Методическая статья

Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

DOI:

10.3791/54202

⸱

22 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самоорганизующиеся полиэлектролитные комплексы (ПЭК), изготовленные из гепарина и протамина, были нанесены на альгинатные шарики для захвата и регулирования высвобождения остеогенных факторов роста. Такая стратегия доставки позволяет в 20 раз снизить дозу BMP-2 при спондилодезе. В этой статье рассказывается о преимуществах и изготовлении УИК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время реконструктивных операций костей, супрафизиологические количество факторов роста эмпирически загружены на строительные леса, чтобы способствовать успешному слиянию кости. Большие дозы сильнодействующих биологических агентов необходимы из-за нестабильности фактора роста в результате быстрого ферментативного разложения, а также носителей неэффективностью локализацией достаточное количество фактора роста на участки имплантации. Следовательно, стратегии, которые продлевают стабильность факторов роста, таких как BMP-2 / НЕЛЛ-1, а также контролировать их высвобождение может реально снизить эффективную дозу и, таким образом, уменьшить потребность в больших дозах во время будущих операций регенерации костной ткани. Это, в свою очередь, приведет к снижению побочных эффектов и затрат на фактор роста. Самоассоциированные УИКи были изготовлены для обеспечения лучшего контроля БМП-2 / НЕЛЛ-1 доставку через гепаринсвязывающий и еще один фактор роста биоактивности потенцировать за счет повышения естественных условиях стабильности. Здесь мы проиллюстрируем простоту изготовления ФЭП, который помогает в deliveRy из множества факторов роста во время реконструктивных операций костей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частота ложных суставов , как сообщается, может достигать от 10 до 45% при дегенеративных спондилодез и пересмотров операции на позвоночнике 1. Для снижения скорости псевдоартрозов во время спондилодеза и других реконструктивных операциях костей, остеогенных факторы роста , такие как BMP-2, Нелл-1 1 и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) были введены в целях содействия De Novo остеогенез. Среди них, БМП-2 является популярным выбором для спондилодеза 2. Хотя эффективность БМП-2 в стимулировании и облегчении образования новой кости хорошо установлено 3; клинически значимые осложнения , такие как гетеротопной формирования костной ткани, серома и образования гематомы, воспалительной реакции, радикулите, позвоночной остеолиза тела, и ретроградной эякуляции продолжают оставаться вопросы, вызывающие озабоченность в связи с супрафизиологического суммами , используемыми 4,5.

Таким образом, снижая дозу BMP-2 остается соответствующую стратегию наманит, чтобы минимизировать побочные эффекты. Кроме того, эффективные системы носителей необходимы для подавления первоначального выпуска разрыва БМП-2 наблюдается в современной коллагеновые губки систем-носителей и дальнейшего повышения длительной и локализованной доставки этого мощного цитокина. Слой за слоем , самосборка чередующихся катионного и анионного полиэлектролитов могут быть использованы в качестве перестраиваемого метода для формирования до полиэлектролитных комплексов на поверхности матриц строительных лесах или имплантируемых материалов 6. В этом отношении, гепарин (известный, имеющие самую высокую отрицательную плотность заряда всех биологических агентов) был признан запоем связываться с различными факторами роста за счет электростатических и гепарин связывающих доменов. Действительно, гепарин, как было показано, чтобы продлить период полураспада и, таким образом, потенцируют биоактивности нескольких факторов роста.

Исходя из этого, наша группа адаптировали слой за слоем протокола самосборки для изготовления гепарином на основе полиэлектролита комплекс (PEC), что грузы и сохраняет биоактивности остеогенных факторов роста во время иммобилизации 7,8. Ядро альгинат Microbead был изготовлен сшивающий -L-guluronate (G) остатки альгината с ионами двухвалентных катионов кальция или стронций. Ядро альгинат представляет собой биоразлагаемый матрица строительных лесов; который после имплантации, она рассасывается в гибридном кровати, обеспечивая пространство для костистых врастания. Поли-L-лизин (ФАПЧ) или протамин используется в качестве катионного слоя переплетаются с обеих матрицы подмостей (в данном случае, ядро ​​альгинат Microbead носитель) и отрицательно заряженного гепарина; в то время как функции анионные гепарин слой, чтобы стабилизировать и локализовать нагруженных факторы роста. Тройной слой PEC было показано увеличение мощности нагрузки фактора роста в модели свиньи 9. В последнее время , носители PEC было показано , что успешно уменьшить эффективную дозу BMP-2 , по крайней мере , в 20 раз в 10 крыс и свиней моделей спондилодез 8.

ntent "> Здесь мы сообщаем методы изготовления УИКов для расширенной доставки фактора роста в спондилодез и других реконструктивных операций с использованием костей БМП-2 в качестве фактора роста остеогенной модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление раствора альгината

  1. Растворите 200 мг альгината натрия (не облученный) или 400 мг 8 мрад облучают альгинат натрия в 10 мл дважды дистиллированной воде и встряхивают в течение 1 часа для не-излучаемая альгината и 15 мин для облученного альгината. Хранить раствор альгината при 4 ° С в течение ночи. Фильтр альгината раствора со стерильным фильтром шприца 0,2 мкм до изготовления альгината микрогранулами.

2. альгинат Microbead Fabrication

  1. Лечить электростатического генератора шарик и шприцевой насос с 70% -ным этанолом и помещают их в классе II биологической безопасности (рисунок 1).
  2. Поместите стеклянный резервуар с магнитной мешалкой внутри генератора шарик.
  3. Установите кронштейн электрода генератора шарик 9 см выше бассейна.
  4. Подключите кабель электрода генератора борта к накатанной головкой 2 рычага электрода, и залить 80 мл раствора SrCl 2 вбассейна.
  5. Нагрузка 5 мл 0,2 мкм фильтрованного раствора альгината в шприц и резиновую трубку. После подключения резиновой трубки к рычагу электрода, включите насос шприца в 5 мл / ч в течение 2 мин, чтобы изгнать воздух внутри трубки и доставить альгинат решение кончике сопла. Выключите шприцевой насос.
  6. Затем включите инкапсуляторе, а затем, шприц насос начать Microbead поколение. Установите скорость потока альгината при 5 мл / ч и напряжение на 5,8 кВ на инкапсуляторе. Откажитесь микрошариков, сгенерированные в течение первых двух минут (или начальное 0,5 мл раствора альгината, откачиваемой из шприца), так как эти микросферы, как правило, неравномерно размер и форму.
  7. Сбор последующих микрогранулы в растворе хлорида 0,2 М стронций. Выключите и шприцевой насос и инкапсулятор (в таком порядке) после откачки Запланированный объем альгината раствора. Повторите эту процедуру для последующих партий изготовления микрогранулами. После завершения поворотуе шприцевой насос первой, а затем инкапсуляторе.
  8. Хранить микрошариков в 20 мл раствора хлорида 0,2 М стронций при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы закончить сшивание и стабилизировать гель.

3. Измерение размера альгината микрошариков

  1. Сбор 0,5 мл альгинатных микрогранул с пластиковой пипеткой и поместите его на предметное стекло. Просмотр микрошариков под оптическим микроскопом при 10-кратным увеличением. Возьмите десять изображений микрошариков с помощью микроскопа ПЗС-камерой. Сохранение изображений со шкалой бар (500 мкм) в формате TIFF с разрешением 2048 х 1536.
  2. Использование инструментов длины в ImageJ, измерить размер микрошариков и масштабной линейки (Рисунок 2). Преобразование длины микрогранулы от пикселя к микрометра.
    1. Нажмите на инструменты линии и нарисуйте линию через середину альгината шарик.
    2. Нажмите кнопку "Анализ" в строке меню и выберите "Мера". Появится всплывающее окно.
    4. Преобразование диаметра альгината борта к фактической длине, используя формулу: длина альгинат шарик / длина шкалы бар х 500 мкм. Например, 1,420 (диаметр, измеренный с помощью ImageJ) / 2,657 (шкала длина шины измеряется ImageJ) * 500 мкм = 267 мкм.
  3. Рассмотрим средний размер 100 микрошариков (среднее значение ± стандартное отклонение) в качестве репрезентативного размера каждой партии микрогранул.

4. Стерилизация

  1. Соберите микрогранулы с использованием 100 мкм нейлоновый фильтр и мыть шарики с дважды дистиллированной водой.
  2. С помощью шпателя, передать все микрошарики, сделанные из 0,1 мл раствора альгината в микроцентрифужных пробирку 2 мл и накрыть марлей, чтобы предотвратить высыхание.
  3. И, наконец, стерилизуют автоклавированием микрогранулы с использованием жидкого режима (115 ° С, 15 мин), или в соответствии с мХарактеристики anufacturer в. Добавить 1,5 л дистиллированной воды в камеру, чтобы предотвратить бусы из сушки.

5. Протамина и гепарин покрытие

  1. Внутри BSL-2 капот, инкубировать стерильные микрогранулы с 1 мл 2 мг / мл протамина раствора (стерилизованный с помощью шприца 0,2 мкм фильтр) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. После инкубации микрошарики в течение 1 ч (шаг 5,1), собирают 150 мкл протамина раствора для микро бицинхониновой кислоты (microBCA) испытания (раздел 6).
  3. Вымойте Протамина покрытием микрошарики дважды дистиллированной водой. Спин вниз с помощью лабораторной центрифуге при 200g в течение 3 мин при комнатной температуре. После центрифугирования, аспирация воды с помощью шприца.
  4. Выдержите протамин покрытием микрогранулы с 1 мл 0,5 мг / мл раствора гепарина (стерилизованы с помощью шприца 0,2 мкм фильтр) в течение 30 мин для создания полиэлектролитного комплекса (PEC).
  5. После инкубирования протамин- покрытием микрогранул Fили 30 мин (шаг 5,4), собирают 400 мкл раствора гепарина для определения содержания гепарин (раздел 7).
  6. После инкубации, смыть несвязанного гепарин из УИКов дважды промывку с использованием дважды дистиллированной водой.

6. Протамина Содержание

  1. Выполните проверку microBCA в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, добавьте 150 мкл раствора протамина (собранные до и после инкубации с микрошариков) в 96-луночный планшет. Добавьте 150 мкл рабочего раствора microBCA.
  2. Используйте раствор альбумина (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 и 200 мкг / мл) в качестве калибровочных стандартов.
  3. Выдержите смесь в течение 60 мин при 60 ° C. Измеряют поглощение с помощью спектрофотометра при 562 нм.
  4. Используйте стандартную кривую для определения концентрации протамина каждого неизвестного образца в соответствии с инструкциями изготовителя.
  5. Определяют содержание протамина микрошариков вычитанием общего количества протамина вРаствор для нанесения покрытия (до инкубации с микрогранул) от количества протамина, оставшегося в растворе для нанесения покрытия (после инкубации с микрогранул).

7. Гепарин Содержание

  1. Приготовьте 10 мл рабочего раствора путем растворения 4 мг толуидиновым синим и 20 мг хлорида натрия в 0,01 н соляной кислоты.
  2. Добавить 400 мкл образца (со стадии 5.5) в рабочий раствор в соотношении 2: 3 и вихре в течение 30 сек.
  3. Добавьте 600 мкл н-гексана (эквивалентный объем раствора до рабочего реактива) и вихрь смеси для извлечения толуидиновым синим гепарин комплекс.
  4. Отберите 200 мкл водной фазы с помощью шприца после разделения фаз.
  5. Измерить количество неизвлеченная толуидиновым синим, содержащегося в водной фазе с использованием спектрофотометра при 631 нм.
  6. Подготовка стандартных растворов гепарин 0-20 мкг / мл.
  7. Участок чтения 631 нм каждого стандарта гепарин против концентрации гепарина в мкг / мл. С помощью стандартной кривой, чтобы определить концентрацию гепарин каждого образца.

8. конфокальной Изображение послойный Структура

  1. Изготовить протамин, гепарин и НЕЛЛ-1 / БМП-2 флуоресцентный аналог CF-405 протамин (синий), CF 594 гепарин (красный) и FITC помечены НЕЛЛ-1 / меченное ФИТЦ (зеленый) BMP-2 + гепарин + протамин в соответствии с производителем технический паспорт.
  2. Шерсть 100 мкг микрогранулы 300 мкл флуоресцентного аналога (способ нанесения покрытия, как описано в 5.3-5.6) CF-405 протамин (синий) (2 мг / мл, 1 ч инкубации), CF-594 гепарин (красный) (0,5 мг / мл, 30 мин) и меченное ФИТЦ НЕЛЛ-1 / меченное ФИТЦ (зеленый) ВМР-2 (1,5 мг / мл, в течение ночи). Промыть микрогранулы дважды дистиллированной водой для удаления несвязанного флуоресцентного протамина, гепарин и НЕЛЛ-1 / БМП-2.
  3. Обратите внимание на слой за слоем структуры (рисунок 3) с помощью конфокальной микроскопии при 10 - кратным увеличением. 7

9. БМП-2и НЕЛЛ-1 Усвоение и выпуска

  1. Нагрузка 13,3 мкл 1,5 мг / мл ВМР-2 или НЕЛЛ-1 раствора на 100 мкг ФЭП. Выдержите PEC при 4 ° С при 30 оборотах в минуту встряхивания в течение 10 ч.
  2. Погружают микрогранулы в 1 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) при 37 ° С при постоянном встряхивании (30 оборотов в минуту).
  3. Сбор 1 мл надосадочной жидкости и заменить его на 1 мл PBS, после того, как 1, 3, 6, 10 и 14 дней.
  4. Оценить поглощение и выпустить эффективность БМП-2 с использованием метода ELISA в соответствии с протоколом производителя. Оценка поглощения и выпуска эффективности Нелл-1 с использованием карбоксибензоил хинолин-2-карбоксальдегид (CBQCA) метод анализа белка в соответствии с протоколом производителя.
  5. Определить высвобождение накопленного в момент времени (T):
    Совокупный выпуск в момент времени (Т) = Release в момент времени (T) + Предыдущий релиз в момент времени (т-1).
  6. Участок кумулятивный выпуск БМП-2 и Нелл-1 в зависимости от времени.

10. экстракорпорального биоактивностьнел-1

Примечание: Биоактивность НЕЛЛ-1 выпущенный из ФЭП оценивали путем измерения его способности увеличивать экспрессию щелочной фосфатазы (ALP) в кролика стволовых клеток костного мозга (rBMSC).

  1. Семенной 20000 rBMSCs на лунку в 24-луночный планшет и дать им возможность расти в течение одного дня с 1 мл Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Через 24 часа заменить среду с 1 мл остеогенной среды Игла (DMEM , дополненной 10% FBS, 2% пенициллина стрептомицин, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 10 ммоль / л бета-глицерофосфат, и 10 -8 моль / л дексаметазона ) в течение 7 дней при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  3. Поместите 300 мкг PEC-Нелл-1 (с шага 8.2) и ПЭК внутри клеточных культур вставок (TC вставки), чтобы держать отдельно от УИК клеток (это исключает вымывание PEC микрогранул во время остеогенной среды меняются). Место TC вставки в 24 хорошо плели в течение 14 дней.
  4. Раз в три дня, аспирата 1 мл остеогенной среды путем размещения иглы вне ТС вставки и заменить 1 мл свежей остеогенной среды.
  5. Через 7 и 14 дней инкубации, определения активности ALP с комплектом ALP анализа в соответствии с протоколом производителя комплекта.
    1. Лизируйте клетки с буфером для анализа, содержащего 0,1% Тритон Х-100 при температуре 4 ° С в течение 10 мин. Соскребите прилипших клеток с использованием клеток скребком. Инкубируйте клеточной суспензии при 4 ° С при перемешивании в течение, по крайней мере 60 мин.
    2. Центрифуга клеточной суспензии при 2500 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Соберите супернатант для анализа ALP.
    3. Добавляют 50 мкл серийно разведенного щелочного раствора стандарта фосфатазы от 200 до 0 нг / мл в лунки 96-луночного планшета. Окончательные количества щелочной фосфатазы стандарта 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15, и 0 нг / лунку.
    4. Добавьте супернатант от стадии 10.5.2 (50 мкл / лунку) и разбавьте разбавления бuffer.
    5. Добавляют 50 мкл р - нитрофенил фосфата раствора (PNPP) субстрата в каждую лунку. Перемешайте реагенты, осторожно встряхивая планшет в течение 30 сек. Выдержите смесь в течение 30 мин в темноте. Измеряют поглощение при 405 нм с помощью планшет-ридере.
    6. Вычислить ALP активность с использованием калибровочной кривой.
  6. Определение содержания белка с использованием набора для анализа белка microBCA в соответствии с инструкциями изготовителя. Нормализация ALP активность путем деления ALP активности по содержанию белка.

11. Жизнеспособность клеток

  1. Инкубируют 200 мг PEC-Нелл-1 с 1 мл DMEM + 10% FBS при 37 ° С в течение 24 ч для 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) анализ.
  2. Seed 2000 rBMSCs на лунку (в 100 мкл среды DMEM с 10% FBS) в 96 - луночный планшет и инкубируют в течение 1 дня при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
  3. Заменить DMEM + 10% FBS с 100 мкл экстракта РЕС-НЕЛЛ-1 / PEC и инкубироватьпри 37 ° С, 5% СО 2.
  4. Через 1 день или 3 дней инкубации, добавляют 10 мкл 5 мг / мл раствора MTT и дополнительно инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 4 часов в темноте.
  5. Добавьте 100 мкл раствора ДМСО в каждую лунку для растворения кристаллов формазана.
  6. Определить оптическую плотность при 570 нм с использованием микропланшет-ридера.
  7. Вычислить относительную скорость роста:
    figure-protocol-1

12. Упаковка в строительные леса и БМП-2 и Нелл-1 Загрузка

  1. Пакет УИК в поры саморассасывающийся медицинского сорта поликапролактон - фосфат трифосфат кальция (mPCL-TCP) с использованием каркасного стерилизованный лопаточку внутри BSL-2 камеры.
  2. Добавить 1,5 мг / мл раствора ВМР-2 или Нелл-1 на mPCL-TCP помост, заполненную ПЭК и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем носителе, протамин был выбран в качестве замены поли-L-лизина, так как он имеет сходные химические свойства, и он FDA одобрил как антидот гепарина. Оптические микроскопы Результаты показали, что необлученных микросферы имеют сферическую форму с диаметром 267 ± 14 мкм. (0,35 мм сопла, скорости потока 5 мл / ч и 5,8 кВ). Большинство облучаемых микрошариков имеют каплевидной формы. Диаметр измеряется на круглой части облучаемых микрошариков была 212 ± 30 мкм (0,35 мм форсунка, со ск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой способ получения избирательных участков через слой за слоем самосборки. Структура послойный визуализируется с использованием флуоресцентных аналогов протамин, гепарин, BMP-2 и НЕЛЛ-1 и конфокальной микроскопии. Усвоение и высвобождают тесты показывают, что гепарин на избирательном участке посредничает остеогенной поглощение фактора роста и высвобождения. Эффективность поглощения метода РЕС: НЕЛЛ-1: 86,7 ± 2,7%, ВМР-2: 70,5 ± 3,1%. Носитель ПЭК имеет лучшую модуляцию высвобождения Нелл-1 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти исследования были профинансированы Национальным советом по медицинским исследованиям Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 и NMRC EDG/0022/2008.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акродиск для медико-биологических наук 25  мм Шассирный фильтр с 0,2  &микро; m Мембрана SuporPALL PN4612Стерильный раствор протамина, гепарина методом ультрафильтрации
24 лунки планшетCell Star 662160
96 луночный планшет Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид), MTTSigma AldrichM5655Измерить цитотоксичность PEC-NELL-1
АцетонаFisher ScientificA/0600/17Преципитат CF-405
Меченый протамин
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Измерить цитотоксичность PEC-BMP-2
Набор для анализа щелочной фосфатазы (ЩФ)AnaspecAS-72146
Хлорид аммонияMerckArt 1145Стоп реагент в мечении FITC
Безводный диметилсульфоксид (ДМСО)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Растворитель для флуоресцентного изотиоцианата I
диметилсульфоксида ( ДМСО)Сигма ОлдричРастворить  формазан 
АвтоклавHirayamaHU-110Стерилизовать альгинатные шарики на пару
Бета-глицерофосфатSigma AldrichG9422
BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) Medtronic Sofarmor Danek, Мемфис, Теннесси, США7510800Остеогенный фактор роста, диализ необходим для удаления компонента стабилизатора, который препятствует соединению FITC
карбоксибензоилхинолин-2-карбоксальдегид (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Для количественного определения белкового клеточного фильтра NELL-1
(100  &микро; m)BD Science352360Hold PEC для анализа ЩФ
Скребок для клеток 290  мм Ширина лезвия 20  ммSPL Life Science90030Отсоединить ячейку от 24-луночной пластины
CF 405S, сукцинимидиловый эфирSigma AldrichSCJ4600013синий флуоресцентный краситель для мечения протамином
CF 594, гидразидSigma AldrichSCJ4600031темно-красный флуоресцентный краситель для мечения гепарином
ЦентрифугаBeckman CoulterMicrofuge 22R
Конфокальный микроскопОлимп FV1000
ДексаметазонСигма ОлдричD4902Компонент остеогенной питательной среды
Обессоливающие колонны ДекстранPierce (Thermo Scientific) 43230
DMEMGibco 12320
БМП-2 Quantikine ELISA KitR& D SystemDBP200Define BMP-2
release Фетальная бычья сыворотка FBSHycloneSV30160.03
Флуэсцеин Изотиоцианат, Изомер ISigma AldrichF7250Зеленый флуоресцентный краситель для мечения NELL-1 и BMP-2
Вставки для клеточных культур ThinCert,
Для 24 луночных планшетов, стерильный		Greiner 662630Предотвращает вымывание ПЭК при смене остеогенной среды
Шприцевой насос Havard Appartus (11 плюс)Аппарат Havard70-2208
н-гексан (>99%)Sigma Aldrich139386
гепаринSigma AldrichH3149Связывается с остеогенным фактором роста BR с гепарин-связывающим доменом
Соляная кислота (37%)Merck100317Высококоррозионный
инкубаторСвязующееC8150
Набор для анализа белка MicroBCAТермонаучная23235
Считыватель микропланшетовTecanInfinite M200Для анализов ЩФ и микроBCA
Инкапсулятор клеток NiscoEngineering IncИнкапсулятор VAR V1
Флуоресцентный микроскопOlympusСкаффолд IX71
mPCL-TCP (размер пор 1,3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Hold PEC для исследования in vivo исследование
Penicillin-Streptomycin 10,000 ЕД/мл, 100  млгиклонная клеточная культураSV30010антибиотик
10x фосфатно-солевой буфер (PBS)VivantisPB0344-1L10x раствор, ультрачистый
поли-L-лизин MW 15,000-30,000Sigma AldrichP2568поликатионная
соль протамина сульфата, из лососяSigma AldrichP4020Polycation
Shaker LabnetS2025
Трубка для диализа из змеиной кожи 3,500 MWCO 22  мм x 35 футовThermo Fisher Scientific68035Удалить непрореагировавший FITC диализом
Хлорид натрияMerck1.06404.1000
Гидроксид натрияQrecS5158
Бикарбонат натрияUS BiologicalS4000Буфер
карбонат натрияSigma AldrichS7795-500GБуфер
Хлорид стронция ГексагидратSigma Aldrich255521Сшиватель для альгината
Шпатель3dia
5 мл шприцTerumo140425RДиаметр шприца влияет на скорость потока
75 см2 Cell Culture Flask Canted NeckCorning730720
Толуидин синийSigma Aldrich52040Анализ
Трипсин 1xГиклон Клеточная КультураSH30042.01
Альгинат натрияНоваматрикс (FMC Биополимер, Принстон, Нью-Джерси)Pronova UPMVGМатериал ядра микрогранул
на гепарин

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
  3. Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
  4. Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
  5. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  6. Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
  7. Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
  8. Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
  9. Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
  10. Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
  11. Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
  12. Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules. Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).
  13. Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NELL

Похожие статьи