Этот анализ адгезии потока обеспечивает простую, высокую модель удара клеток-эпителиального взаимодействия Т-клеток. Шприцевой насос используется для генерирования напряжения сдвига, и конфокальной микроскопии захватывает изображения для количественной оценки. Целью этих исследований является эффективно количественно адгезию Т-клеток с использованием условий потока.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В целом, адгезия Т-клеток является важным компонентом функции, вносит свой вклад в различных процессах клеточного набора на участках воспаления и взаимодействия с антиген-представляющих клеток (APC) в формировании иммунологических синапсов. Эти два контекста адгезии Т-клеток отличаются тем, что Т-клеток APC взаимодействия можно считать статичным, в то время как взаимодействие Т-клетками кровеносных сосудов сталкиваются с проблемой напряжения сдвига, порожденного самого обращения. Т-клетки-Арс взаимодействия классифицируются как статические в том, что две клеточные партнеры являются статическими по отношению друг к другу. Как правило, это взаимодействие происходит в лимфатических узлах. Поскольку Т - клетка взаимодействует со стенкой кровеносного сосуда, клетки арестовывать и должны противостоять сгенерированного напряжения сдвига. 1,2 Эти различия подчеркивают необходимость более глубокого понимания статической адгезии и адгезии в проточных условиях в виде двух отдельных регуляторных процессов. Регулирование адгезии Т-клеток может быть наиболее лаконично описан как контроллинг состояние сродства интегрина молекул экспрессируется на поверхности клетки, и, таким образом, регулируя взаимодействие интегринов с молекулой лигандами адгезии, экспрессированным на поверхности клетки, взаимодействующей. Наше нынешнее понимание регуляции интегрина сродства состояний происходит от часто упрощенно в пробирке модельных системах. Анализ адгезии с использованием условий потока, описанных здесь, позволяет для визуализации и точной количественной оценки клеток-эпителиальной взаимодействий Т-клеток в реальном времени после стимула. Адгезией при анализе потока могут быть применены к изучению адгезии сигнализации в Т-клетках после обработки ингибирующими или стимулирующими веществами. Кроме того, этот анализ может быть расширен за пределы сигнализации Т-клеток в популяции любого адгезив лейкоцитарного и любой пары интегрином молекул адгезии.
Введение
Т - лимфоцит адгезия опосредует ряд различных процессов в здоровой иммунной системы, 3 играет критически важную роль в торговле людьми Т - клеток и презентации антигена. Если во время иммунного надзора или активного иммунного ответа эти две широкие роли для адгезии являются критическими. 4 Физиологические сигнальные события клеток-эндотелиальной взаимодействия Т - клеток отличаются от Т - клеток-антигенпрезентирующих клеток (АРС) взаимодействия, и , следовательно , требуют различных методов исследование, чтобы наилучшим образом понять сигнальные каскады, вовлеченные. Фирма адгезия Т-клеток к стенке кровеносного сосуда во время экстравазации лимфоцитов требует быстрого и динамического активации интегрина. Тесное взаимодействие между активным государством интегрином и адгезионных молекул по эндотелию приводит к адгезии , устойчивой к потоку крови, что позволяет Т - клетки ползать по поверхности в поисках области разрешительного до клеточного прохода. 5 сканированию сотовом Bi T -directionally Алонга стенки кровеносного сосуда полагается на поляризованной адгезии, с отчетливым клеевой передним концом Т - клетки. 6 Что наиболее важно, фирма адгезии и трансмиграции требуют устойчивости к сдвиговой силы , генерируемой за счет циркуляции кровотока.
При разработке экспериментов по изучению адгезии лимфоцитов, внимание должно быть обращено на специфический стимул интереса. В то время как активации интегрина является общим и важным компонентом всех форм адгезии Т-клеток, каскады активации, вероятно, будут уникальными ниже по потоку от отдельных рецепторов и ко-рецепторов. Кроме того, пары интегрин и молекулы адгезии функционируют в специализированных микросреды и на конкретных подгруппах. Таким образом, эти пары могут регулироваться совершенно по-разному. Модель , представленная здесь , идеально подходит для изучения сигнальных каскадов , приводящих к активации интегрина , происходящие при сдвиге условиях стресса. 7 Эти взаимодействия не могут быть адекватно понимать в статическом adhesiна системе из - за воздействия этих сил было показано, что непосредственно на поведение Т - клеток. 8 Хотя представленные здесь с Т - клетками и СНО (яичника китайского хомячка) клетки , сконструированные для экспрессии человеческого ICAM-1 (СНО-ICAM клетки) система может легко модифицировать для изучения различных популяций лейкоцитов или молекулы адгезии.
Этот анализ предоставляет метод количественной оценки клеток адгезионную T и активацию интегрина с использованием напряжения сдвига, обеспечивая модель для твердой стадии адгезии лейкоцитов. Благодаря использованию ЧО-ICAM клеток сродство LFA-1 для его лиганда в живых клетках, могут быть рассмотрены в режиме реального времени, в ответ на различные стимулы, представляющие интерес. Этот метод требует легко получить, коммерчески доступные камеры микро-потока в сочетании с насосом со шприцем, что значительно упрощает оборудование , необходимое для моделирования кровотока и напряжения сдвига по сравнению с другими моделями. 9 Другим важным преимуществом этого анализа является то , что специфической сигнализациикаскады и результирующее состояние активации отдельных интегринов может быть чисто изучены посредством использования сконструированных клеток СНО, экспрессирующих молекулы адгезии человека, представляющие интерес. Кроме того, сочетание количественных данных с изображений живых клеток является существенным преимуществом этого метода. В целом, в то время как количество анализов статической адгезии Т-клеток было описано, что хорошо модель Т-клеток-APC взаимодействия, эти модели недостаточно для захвата динамичного процесса клеточного эпителиальной адгезии T. По этой причине при выборе анализа адгезии стимул в вопросе должны быть рассмотрены.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Покрытие Клетки СНО-ICAM
Примечание: Цель этого шага заключается в высевания CHO-ICAM клеток в проточных камерах для роста в течение ночи с целью создания сливающийся монослой.
- Поддержание ЧО-ICAM клеток в 10 см тканевых культур обрабатывают культуральных чашках в 10 мл RPMI среде с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (СНО-ICAM полной культуральной среды) при 37 ° С с 5% CO 2.
- Для того, чтобы собрать клетки, добавляют 1 мл 0,5% трипсин-ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин при осторожном встряхивании. Нейтрализовать трипсина с 4 мл среды.
- Граф клеток СНО-ICAM с использованием гемоцитометра и расчета 0,75 × 10 5 клеток на камеру. Примечание: В этом эксперименте: 2,25 х 10 5 клеток будут необходимы для семян 3 камеры.
- Центрифуга 0,75 х 10 5 CHO-ICAM клеток в камере в течение 5 мин при 500g, комнатной температуре и ресуспендируют осадок клеток в 30 мкл на камеру ЧО-ICAM Полная культура средств массовой информации.
Примечание: В этом эксперименте потребуется 90 мкл семян 3 камеры. - Медленно добавить ячейки в один резервуар проточной камеры. Разрешить клетки урегулировать в течение 5 мин в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- Добавить 200 мкл полной культуральной среды через два резервуара каждой камеры. Альтернативные дополнения между ними, чтобы избежать перемещения элементов, как система уравновешивается.
- Инкубируйте клетки в течение ночи в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
2. Получение Т-клеток
Примечание: Этот анализ может быть сделано с первичных человеческих Т-клеток или Т-клеточной линии. Протокол по изоляции Т - клеток из крови было описано ранее. 10 Если с помощью Т - клетки человека используют первичные свежеизолированных клетки для достижения наилучших результатов. При использовании Т-клеточной линии, следовать протоколу культуры, указанного источника клеток. Для того чтобы обнаружить клетки на флуоресцентном microscoП.Е. Т-клетки метили флуоресцеина карбокси сукцинимидил эфира (CFSE).
- Подсчитайте Т - клеток с помощью гемоцитометра и вычислить 2 × 10 6 клеток в камере. Примечание: В этом эксперименте, 6 х 10 6 клеток будут необходимы для 3 -х камер.
- Центрифуга 2 × 10 6 клеток на Т камере в течение 5 мин при 500g, комнатной температуре и клетки вновь суспендируют в 1 мл фосфатно - буферного раствора (PBS) , содержащего 1% глюкозу или 2% FBS.
- Добавить CFSE в соотношении 1: 1000 разбавление (запас сделаны 5 мМ). Накройте от света и инкубировать в течение 8 минут при комнатной температуре
- Спин при 500 мкг в течение 5 мин, RT.
- Ресуспендируют осадок клеток с 240 мкл на состояние (смотри раздел 4 "Примечание") в RPMI средах без сыворотки. В этом эксперименте, ресуспендируют осадок клеток в 720 мкл среды RPMI обычной. Разделите клетки в пустые 1,5 мл пробирки, меченных для каждой камеры, 240 мкл на пробирку. Держите клетки в C тепла блока 37 ° С до использования.
3. Настройка-гое ввода / вывода и шланги шприцевой насос
- Подогреть камеру микроскопа живого изображения до 37 ° C.
- Подготовьте входной подсоединенные шланги:
- Заполните стеклянную бутылку емкостью 500 мл с водой и сделайте 2 отверстия в крышке. Этикетка дыры "в" и "вне". Это будет выступать в качестве водогрейного ванны для ввода средств массовой информации.
- Выполните вход через шланги , отверстия в крышке и в водяной бане. Убедитесь , что сторона шланга , который подключается к шприц приходит через "в" отверстие и сторона , которая будет подключаться к входу резервуара поступает через «аут» отверстие.
- Промыть вход обливание 60 мл воды , чтобы удалить воздух из системы.
- Заливка вход обливание RPMI средах без сыворотки нагревалась до 37 ° С. Заполните 60 мл шприц и протащить через средства массовой информации до тех пор, пока шланги полностью загрунтованную и отсутствие пузырьков воздуха.
Примечание: В зависимости от lengtч тюбинга объема, необходимого для простого числа будет меняться.- Рассчитать объем носителя, необходимых для эксперимента путем умножения скорости потока (здесь 0,3 мл / мин) на количество минут (5 мин) по количеству камер в эксперименте (здесь 3); В этом эксперименте используют 4,5 мл среды. Примечание: Мы рекомендуем иметь 5 мл дополнительный объем (здесь на общую сумму 9,5 мл), оставшийся в шприце после грунтования.
- Поместите все настройки входа в живой оболочки визуализации микроскопа для поддержания 37 ° C. Запустите подсоединенные шланги и шприц из корпуса и загрузите шприц в шприцевой насос.
- Подготовьте выходной подсоединенные шланги:
- Сделайте отверстие в крышке бутылки 250 мл для использования в качестве вывода отходов.
- Запуск выходной трубопровод через отверстие и в бутылку. Неплотно закрыть крышку, не закрывая весь путь.
- Установите настройки вывода в корпусе живого изображения Миcroscope.
- Рассчитывают расход (мл / мин) , необходимые для создания желаемого напряжения сдвига (дин / см 2). Напряжение сдвига варьирует в различных сосудистых отделениях, поэтому принимать во внимание общую модель, включая типы клеток для изучения и лечения при решении вопроса о сдвига уровня напряжения.
Примечание: Эти эксперименты проводились при 0,4 дин / см 2 , чтобы точно имитировать небольшую установку вены.- Возьмите размеры камеры во внимание при расчете напряжения сдвига. Используйте следующую формулу (предоставляемая производителем 11) для проточных камер , используемых здесь (см Таблицу материалов): T = η * 176,1 * O , где напряжение т = сдвига, η = динамическая вязкость, диаметр = скорость потока. Примечание: Динамическая вязкость RPMI сред при температуре 37 ° С составляет 0,007.
4. Загрузка потока камер и стимуляции клеток
Примечание: Для того, чтобы начать адгезию,Т-клетки должны быть стимулированы. В следующем эксперименте клетки либо останется нестимулируемый или стимулируются SDF-1α 12 или форболмиристатацетата (РМА; положительный контроль) 13. Для правильной презентации хемокина на Т-клетки, CHO-ICAM-клетки предварительно инкубировали с SDF-1 & alpha; (с последующим последовательным стирок), что позволяет для представления на поверхности клетки. РМА представляет собой форболовый эфир, который структурно похож на второй мессенджер диацилглицерин (DAG); Здесь он используется в качестве положительного контроля. Т-клетки непосредственно обрабатывают РМА перед загрузкой в проточную камеру.
- Установите камеру потока на слайд микроскопа и установить фокальной плоскости на монослой CHO-ICAM с использованием цели 20X.
- Держите CFSE окрашенных Т-клеток для всех других условий в C тепла блока 37 °. Готовят клетки СНО-ICAM или Т следующим образом непосредственно перед анализом, для этого условия:
- Для нестимулированных условия (камера 1), держите одну трубку / ПОДАЮЩЕЙянтарный необработанный, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для стимуляции.
- Для стимуляции РМА (камера 2), стимулируют одну трубку Т-клеток с РМА (10 нг / мл), чтобы служить в качестве положительного контроля; лечить непосредственно перед загрузкой в проточную камеру.
- Для SDF-1 & alpha; стимуляции (камера 3), стимулируют третью камеру потока с SDF-1 & alpha; (100 нг / мл) путем удаления 70 мкл в то время , 3 раза из верхнего резервуара (выходной резервуар) , а затем добавляя 70 мкл SDF -1α (100 нг / мл) в нижний резервуар (вход резервуара). Инкубировать в течение 5 мин.
- Снимите и выбросьте 70 мкл в то время , 3 раза из выходного коллектора одной камеры.
- Добавьте 70 мкл предварительно обработанного (если применимо) клеточной суспензии Т во входной резервуар 3 раза. Подождите 5 минут, чтобы позволить клеткам перемещаться от входного отверстия камеры ( "In"), и достичь проксимальный выпускное отверстие ( "Out") камеры.
- В течение этого времени изображение 5поля для CFSE-окрашенными Т-клеток. Выберите поля , которые разбросаны по всему центру камеры (рисунок 1). Используйте следующие условия возбуждения / излучения: длина волны лазера возбуждения: 488 нм; Коллекция эмиссионный фильтр: 500 - 540 нм. Эти изображения будут служить в качестве кровяных клеток предварительно потока.
- Подключите входной и выходной трубопровод одновременно проточную камеру резервуаров.
Примечание: Присоединение трубки одновременно имеет решающее значение для того, чтобы не вводить пузырьков воздуха в камеру и поддержание общего равновесия внутри камеры. - Начинают потока при 0,3 мл / мин (0,4 дин / см 2) , в то время как визуализируя CFSE-запачканные Т - клеток. Как начинается поток, особенно с первой камерой, часто возникает задержка между началом потока и наблюдения Т-клеток прокатки, поэтому начала отсчета времени 5 мин при начале движения Т-клеток.
- Прекратить поток через 5 мин, и изображения 5 полей в канале CFSE. Выберите поля случайным образом рассредоточенные беспересадочныйughout центре проточной камеры (Рисунок 1). Эти изображения будут служить в качестве кровяных клеток после потока.
5. Определение Процент адгезивных клеток
Примечание: Определение количества клеток в полученных изображений делается объективно с автоматизированным программным обеспечением. Для наших исследований мы использовали программное обеспечение Volocity (версия 6.2.1), но и другие программы, такие как ImageJ (версия 1.48V), также применимы.
- Определить количество клеток в поле предварительного потока для каждого условия. В среднем из 5 полей является "предварительной подачи среднее количество клеток." 7
- Определить количество клеток на поле после потока для каждого условия. В среднем из 5 полей "пост-потока среднее число клеток." 7
- Рассчитывают процент адгезивных клеток , используя следующую формулу: процент адгезивных клеток = (пост-поток Среднее количество клеток) / (предварительно поток Среднее количество клеток) × 100%.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Типичные результаты приведены из анализа адгезии потока с использованием Jurkat и первичных человеческих CD3 + Т - клеток, как показано, стимулировали SDF-1alpha. Негативные управления во всех показанных экспериментах нестимулированных клеток. Порог базальный процент адгезии стимулированных клеток составляет от 5 - 10%; базовая адгезия заметно выше этого диапазона указывает на проблемный эксперимент и предполагает начало популяции Т-клеток были неспецифически предварительно ак...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для того , чтобы правильно проанализировать адгезию Т - клеток, стимулятором быть включены в исследование , необходимо учитывать при выборе метода в лабораторных условиях . Хотя существует несколько анализов для изучения сигналов, приводящих к активации LFA-1 и ICAM-1, связывающего все методы не являются взаимозаменяемыми. Статический анализ адгезии 10 лучше всего подходит для изучения Т - клеток-APC взаимодействия; В качестве альтернативы, метод сдвига напряжений подробно здесь идеально подходит для...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Фонд исследований ревматологии и Фонд Хиршила поддержали эту работу.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Образцы Т-клеток (клеточной линии или первичных) | ATCC | TIB-152 | Периферические Т-клетки человека |
| CHO-ICAM-1 клетки | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| стеклянная бутылка 500 мл | Fisher | FB800500 | |
| стеклянная бутылка 250 мл | Fisher | FB800250 | |
| силикон трубка 0,8 мм | ibidi | 10841 | |
| Конфокальный микроскоп с камерой инкубатора | Ziess | 700 | Любой широкопольный флуоресцентный микроскоп |
| Шприцевой насос | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 мл шприц | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | НИР D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Eppendorf | 5424 | ||
| D-глюкоза | сигма Олдрич | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Программное обеспечение Volocity | Perkin | Elmer Версия 6.2.1 | |
| Программное обеспечение ImageJ | NIH | Версия 1.48V | |
| Чашки для культур, обработанных тканевой культурой | Falcon | 353003 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) Фенол Красный | Gibco | 25200114 | |
| Термоинактивированный FBS | Denville | FB5001-H Пенициллин | |
| /стрептомицин | Фишера | BP295950 |
Ссылки
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
