Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Бедро Window камера Модель

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54205

⸱

28 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Techna Institute, University Health Network

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описывает новую модель оконной камеры бедренной кости мыши, которую можно использовать для отслеживания движения клеток в бедренном костном мозге in vivo. Прижизненная многофотонная флуоресцентная микроскопия используется для визуализации трех компонентов бедренного костного мозга (сосудистой сети, коллагенового матрикса и нейтрофилов) с течением времени.

Аннотация

Костный мозг — сложный орган, который содержит различные кроветворные и некроветворные клетки. Эти клетки участвуют во многих биологических процессах, включая кроветворение, иммунную регуляцию и регуляцию опухолей. Обычно используемые методы для понимания клеточных действий в костном мозге, такие как гистология и анализ крови, предоставляют статическую информацию, а не фиксируют динамическое действие нескольких клеточных компонентов in vivo. В дополнение к стандартным методам была разработана модель на основе оконной камеры (WC), позволяющая проводить последовательную визуализацию in vivo клеток и структур в костном мозге мышей. Этот протокол описывает хирургическую процедуру установки туалета в бедренную кость с целью обеспечения долгосрочного оптического доступа к бедренному костному мозгу. В частности, чтобы продемонстрировать свою экспериментальную полезность, этот подход WC был использован для визуализации и отслеживания нейтрофилов в сосудистой сети бедренной кости, тем самым обеспечив новый метод визуализации и количественной оценки транспорта и регуляции иммунных клеток в костном мозге. Этот метод может быть применен для изучения различных биологических процессов в костном мозге мышей, таких как кроветворение, трансплантация стволовых клеток и иммунные реакции при патологических состояниях, включая рак.

Введение

Костный мозг является важным органом участвует в кроветворении и регуляции иммунной системы. Он состоит из компонента , содержащего кроветворной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) и стромальных компонент , содержащий не-кроветворных клеток - предшественников , которые приводят к мезенхимальных клеток 1. Две трети кроветворной деятельности посвящена поколению миелоидных клеток 2. В частности, большое количество нейтрофилов в костном мозге, при 1-2 х 10 11 клеток , полученных в день в нормального взрослого человека 2. Нейтрофилы являются первой линией защиты от микробной инфекции и в основном сохраняются в костном мозге , пока стресс не вызывает их мобилизацию в дополнение нейтрофилов периферической 1,3. В дополнение к их антимикробных эффектов, недавние исследования указывают на важную роль нейтрофилов в биологии рака, имеющие как про- и анти-онкогенными фенотипы в зависимости от роста преобразующейКоэффициент бета (TGF-β) сигнализации в опухоль микроокружения 4,5. Кроме того, исследования показали , что нейтрофилы , которые накапливаются в первичных опухолях оказывают про-онкогенных и метастатических эффекты путем подавления цитотоксическую функцию Т - клеток 6,7, в то время как нейтрофилы в обращении оказывают цитотоксическое, антиметастатическую эффект 8. Таким образом, исследование гемопоэтических клеток в костном мозге, в частности нейтрофилах, имеет решающее значение для их выяснении роль в иммунной и опухолевой регуляции.

Гистологическое и полный периферийный анализ крови , которые обычно используются для оценки клеточных и структурные изменения в костном мозге 9. Тем не менее, эти методы обеспечивают только статическую информацию о различных клеточных популяций или микроструктур тканей. Продольный в естественных изображений могут быть использованы в сочетании со стандартными методами с целью оценки динамики нескольких клеточных, сосудистых и стромальных компонентов, а также от клетки к CELL взаимодействия в продольном образом. Прижизненные микроскопии (IVM), определяется как визуализации живых животных при микроскопическом разрешением 10, является особенно полезным для оценки динамических клеточных процессов , в течение долгого времени в том же самом образце, уменьшая количество экспериментальных животных требуется. IVM часто сочетается с хронически пересаженной окна камеры (WC), чтобы получить доступ к органу интереса для визуализации в течение периода от нескольких недель до месяцев. Черепных и спинных-складка WC модели имеют самую длинную историю использования, начиная с середины 1990-х годов. Совсем недавно другие органоспецифические WC модели , такие как таковые из жировой ткани молочных желез и различных органах брюшной полости, были разработаны 11.

Типичный подход для визуализации костного мозга в естественных условиях имеет в основном вовлечены воздействие на своде черепа мышей, где утонченная кости позволяет осуществлять прямую визуализацию отдельных клеток с минимальным хирургическим вмешательством 12-14. Тем не менее, свода черепа костный мозг может бе отличие от других костей, таких как длинной кости, как продемонстрировано меньшим количеством HSPCs и гипоксических клеток в своде черепа, что свидетельствует сокращает расходы на содержание и развитие HSPCs 15. Таким образом, альтернативные подходы для оценки клеточных компонентов в длинной кости были исследованы. К ним относятся прямое облучение костного мозга бедренной кости 16 и внематочной трансплантация разделенной бедренной кости в дорсальной кожной складки WC 17. Тем не менее, первый является терминал процедура, которая не позволяет отслеживать клеточных, структурных и функциональных изменений в течение более длительных периодов времени, и последний, вероятно, нарушает нормальную функцию костного мозга из-за трансплантацией бедренной кости к внематочной месте внутри спинной кожной складки WC. Другой метод, который позволяет ортотопической последовательного визуализации костного мозга бедренной кости в течение долгого времени является использование туалета в бедренной кости. Один предыдущий доклад продемонстрировал долгосрочный визуализации микроциркуляции в костном мозге бедра с использованиембедренной кости туалет у мышей 18. Кроме того, авторы продемонстрировали визуализацию опухолевых клеток в бедренной кости, что указывает на его полезность в деле мониторинга костного метастаза мозга. Тем не менее, эта конструкция WC был ограничен его большой размер (диаметр 1,2 см) и относительно небольшой площади изображения (4 мм в диаметре), который подходит только для больших мышей (26-34 г, в 3-6-месячном возрасте), тем самым делая подход непрактичным для повседневного использования.

Таким образом, новый туалет с меньшим общим размером и большей площади внутренней обработки изображений был разработан для целей настоящего исследования. Цель данного исследования состояла в том, чтобы обеспечить способ для визуализации различных типов клеток в костном мозге бедра. Модель WC бедренной кости была разработана в доме и был использован для визуализации и отслеживания нейтрофилов в 3D сосудистой сети. С помощью этой модели ИВМ костного мозга может быть выполнена последовательно в течение 40 дней. Этот подход может быть применен к различным полей для выяснения процессов кроветворения, иммунной регуляцииразвитие опухоли й.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все для животных работа была проведена по протоколу # 2615, утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем.

1. Хирургическая подготовка мыши

  1. До операции стерилизации все хирургические инструменты и окно камеры (WC) автоклавированием. Дополнение к питьевой воде с 50 мг / кг массы тела амоксициллин 2 дня до операции. Вводят мышь с 0,1 мг / кг массы тела бупренорфина внутрибрюшинно 4 ч до операции.
  2. Обезболить бестимусных голых мышей путем внутрибрюшинной инъекции 350-400 мкл физиологического раствора, содержащего 80 мг / кг кетамина и 13 мг / кг ксилазина (Примечание: Это предложение было одобрено Комитетом по уходу Institutional животного происхождения, и мы не имели никакого опыта работы с неблагоприятными последствиями ). Подтверждение надлежащего анестезии путем тестирования для ног рефлекса. Продолжайте наблюдение за дыхательного паттерна, слизистый цвет мембраны и стопы рефлекса во время процедуры.
  3. Выполнение хирургического прocedures под шкаф биологической безопасности для поддержания стерильных условий во время операции. Поместите мышь на электрическом грелку, покрытом хирургической простыне для поддержания температуры тела во время операции. Выполнение всех хирургических процедур под стереомикроскопа.
  4. Нанести глазную мазь, чтобы держать глаза влажными во время операции. При необходимости повторить во время хирургической процедуры. Стерилизовать рабочую зону мыши протиранием 7,5% повидон-йод, 70% изопропилового спирта и 10% повидон-йода последовательно, и повторите эту процедуру дважды.
  5. Делают 10 мм продольный разрез кожи, используя скальпель с лезвием (# 15), приближаясь к бедренной кости с боковой стороны. Выставляют бедренной кости между сгибателей и разгибателей тупым рассечением с помощью пинцета и кровоостанавливающих для обеспечения функциональных возможностей мышц.
  6. Вставьте планку U-образную форму под костью, и установить туалет (рисунок 1). Закрепить панель с окном, используя две гайки, и затянуть гайки дляCEPS. Заполнить пространство между костью и WC с зубным цементом.
  7. Стачивать кортикальной кости в мм 2 области 6 х 2 с микро-сверлом , чтобы получить оптический доступ к костномозговой полости.
    Примечание: Внимательно осмотрите истончение кортикальной кости под микроскопом при выполнении этой процедуры. Оставьте нетронутыми, почти прозрачной периостальное слой кости.
  8. Поместите 8 мм покровного стекла на окне, и закрепите покровного стекла с упорным кольцом, чтобы держать его на месте.
  9. Отрегулировать мускулатуру сгибателей и разгибателей обратно в исходное местоположение с помощью щипцов для поддержания их функции после операции. Шовный дермы с помощью 5-0 шва и держатель иглы.
  10. Монитор мыши для восстановления, пока он находится в сознании и может свободно перемещаться. Поместите животное в новую клетку, когда выздоровел.
  11. После выздоровления выполнить получение изображений на животное в тот же день или в последующие дни (см раздел 2). Монитор physiкал состояние мыши ежедневно.
    Примечание: Монитор физических условий, таких как отношение веса на конечность, скрючившись, быстрое или поверхностное дыхание, отек конечностей задние, членовредительство, целлюлит и тяжелый дерматит.
  12. Дайте внутрибрюшинную инъекцию 0,1 мг / кг массы тела бупренорфина в течение 3-х дней, и 1 мг / кг массы тела мелоксикама в течение 5 дней после операции по поводу лечения послеоперационной боли и воспаления. Продолжить предоставление амоксициллин-добавляемой воды в течение 5 дней.
  13. В экспериментальной конечной точке, усыпить животное СО 2 наркоза с последующим вторичным методом (например, рак шейки дислокации).

2. Приобретение изображений с использованием Совмещенный Многофотонная и конфокальной микроскопии

  1. До обработки изображений, анестезию мыши путем внутрибрюшинной инъекции 350-400 мкл солевого раствора, содержащего 80 мг / кг кетамина и 13 мг / кг ксилазина. Кроме того, использование ингаляционного анестетика, если таковые имеются.Нанесите мазь для глаз.
  2. Вводят смесь внутрисосудистых красителей для маркировки сосудистую (0,65 мг 2 МДа флуоресцеина (FITC) -dextran) и нейтрофилов (4 мкг из Allophycocyanine (APC) -анти-Ly6G антитела).
  3. Используйте вертикальную комбинированный Многофотонная и конфокальной микроскопии, оснащенный многофотонном лазера в диапазоне от 705-980 нм при двухфотонном возбуждении, а также одиночных фотонов лазеров, который обеспечивает длину волны возбуждения от синего до красного.
  4. Установить этап заказных изображений на микроскоп (рис 1В). Закрепите мышь на сцене с помощью зажима двух концов WC с зажимами.
    Примечание: Критические компоненты стадии являются: две скрепки аллигатора, чтобы держать туалет, и нагревательный элемент для поддержания физиологической температуры (37 ° C) мыши во время съемки.
  5. Включите двухфотонного лазера и конфокальной системы, а также запускать программное обеспечение захвата изображений, нажав кнопку "Start System". Окно с 4 вкладками (Расположить,Сбор, обработка и ведение) откроется.
  6. Настройка каналов визуализации. Нажмите "Smart Setup" на вкладке Приобретение и выбрать красители, которые будут использоваться для работы с изображениями: FITC (488 нм возбуждение, 493-588 нм излучения) и APC (633 нм возбуждения и испускания 638-743 нм). Выберите "лучший сигнал" и нажмите кнопку "Применить".
  7. Добавить генерации второй гармоники (ГВГ) канала захвата изображения вручную. Включите двухфотонного лазера под окном "Лазер" на вкладке Acquisition. Под окном каналов, нажмите на знак "+", чтобы добавить дорожку.
  8. Настройка трека SHG. Изменение длины волны 840 нм под окном каналов с помощью стрелок вверх и вниз, а также выбрать диапазон обнаружения быть 415-425 нм под окном "Light Path" с помощью ползунка.
  9. Нажмите на "окуляры Online" на вкладке Locate. Нажмите FITC под настройки фильтра для FITC, чтобы просмотреть интересующую область и настроить фокус вручную путем поворота тон фокус ручку на боковой стороне микроскопа. Когда область интереса находится, нажмите на кнопку "окуляры автономно" на вкладке Locate.
  10. Нажмите на вкладку Acquisition. Выберите FITC дорожку под окном каналов и нажмите на "Live", чтобы просмотреть изображение FITC-декстран с целью 5X. Отрегулируйте фокусировку, если это необходимо, и нажмите кнопку "Стоп" на вкладке Acquisition, чтобы остановить предварительный просмотр.
  11. Вручную обратиться к 20X цели воды путем перемещения колеса над линзами. Просмотр изображения еще раз для FITC-декстрана с использованием цели 20X, а также настроить Master Gain и Пинхол под окном каналов для достижения оптимального сигнала и контраста. Повторите эти действия для других каналов путем выбора APC и ГВГ дорожки под окном каналов.
  12. Выберите параметры изображения. Нажмите на кнопку "Режим захвата", чтобы открыть окно. Установите размер кадра, чтобы быть 1,024 х 1,024 пикселей, и усреднение 4X для получения высококачественных изображений.
  13. Приобретают 2D снимок. Выбрать все каналы под каналы выигратьДау и нажмите на кнопку "Привязка" на вкладке Acquisition. Проверьте качество изображения и изменить параметры изображения, если это необходимо.
  14. Приобретать 2D покадровой изображение.
    1. Отмечайте "Time Series" на вкладке Acquisition, чтобы открыть окно временных рядов. Введите в 0 при интервалах и 40 для общего числа сканирований принимать непрерывно 40 изображений без временного интервала.
      Примечание: 40 сканирований генерирует около 5-минутный тайм-серии со скоростью сканирования 7,5 сек / кадра и размером изображения 600 мкм х 600 мкм. Настройка интервала и количества сканирований в зависимости от микроскопа, настроек захвата изображений, и с частотой кадров камеры. Фиксированный интервал времени (> 0 сек) может быть использована для сравнения покадровой изображений, полученных в различные моменты времени. Более длительный срок покадровой обработки изображений может потребоваться в зависимости от ожидаемой средней скорости нейтрофилами (или других интересующих клеток) в экспериментальных условиях.
  15. Приобретать 3D-изображение.
    1. Отметьте "Z-Stack" на вкладке Acquisition, чтобы открыть окно Z-Stack. Запуск "Live" режим предварительного просмотра для FITC-декстрана. Сосредоточиться на верхней части образца и нажмите кнопку "Установить в первую очередь", и сосредоточиться на другом конце образца и нажмите кнопку "Установить Last" в окне Z-стека.
    2. Установить интервал равным 10 мкм под окном Z-стека. В зависимости от первого и последнего оптического среза, выбранный в предыдущем шаге, это будет генерировать 10-20 ломтиков, с общей оптической толщиной 90-180 мкм.
      Примечание: Интервал Z-стек зависит от размера прокол, который определяет толщину оптического среза. Установить интервал, чтобы быть меньше, чем толщина оптического среза.
    3. Нажмите кнопку "Пуск" Эксперимент на вкладке Приобретение, чтобы начать собирать изображения.
  16. Приобретать 3D покадровой изображение.
    1. Отмечайте "Time Series" и "Z-стека" на вкладке Acquisition, чтобы открыть временных рядови Z-стека окон.
    2. Настройка серии Время и параметры сбора Z-стек, как описано в пунктах 2.14 и 2.15. Нажмите кнопку "Пуск" Эксперимент на вкладке Приобретение, чтобы начать собирать изображения.
  17. Монитор мыши во время съемки, чтобы убедиться, что он является стабильным и в бессознательном состоянии. Если мышь неустойчиво и / или сознательным во время формирования изображения, удалить мышь из стадии, вводят дополнительные 100-150 мкл раствора анестетика внутрибрюшинно, и продолжить визуализацию.
    Примечание: Признаки неустойчивости включают учащенное дыхание и движение мыши, который можно рассматривать как смещение артефактов полученных изображений.
  18. После получения изображения, возьмите мышь со сцены и вернуть его в клетку. Используйте нагревательную лампу, чтобы держать его теплым, и контролировать мышь, пока он не осознает.

3. Анализ изображений и Количественная

  1. С помощью программного обеспечения для анализа изображений для анализа 3D и временных рядов данных. Открытое программное обеспечение идобавлять изображения, перетаскивая их в открытый экран, который называется вид "Арена". Двойной щелчок по файлу изображения, чтобы открыть его; изображение будет открыт под "перегнать" вид.
  2. Создание 2D / 3D-изображение.
    1. Из "Дополнительно" бар расположен на верхнем правом углу, нажмите на кнопку "Редактировать / Показать экран настройки", чтобы открыть окно "Настройка дисплея". Оптимизация дисплея флуоресценции путем регулировки пороговых значений для каждого канала, и сделать снимок, чтобы сохранить изображение.
  3. Генерация объектов треков с помощью покадровой изображения.
    1. Откройте изображение, которое будет проанализировано под "перегнать" вид. Нажмите на иконку с изображением оранжевых точек, найденных под значком "перегнать". Откроется новое окно "пятнах".
    2. Отметьте поле "Track Пятна (по времени)" и нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу. Выберите канал, содержащий объекты для отслеживания под "Source Channel" и установите оцениваемого объекта diametэр под "Оценочное XY Диаметр", набрав номер в. Нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      Примечание: Для отслеживания нейтрофилов, выберите канал, содержащий APC флуоресценцию для нейтрофилов и установите диаметр объекта до 12 мкм, основанный на известном размером нейтрофилы.
    3. В окне найдите и выберите "Качество" фильтр, нажав на стрелку вниз. Обратите внимание на пятна, определенные с помощью программного обеспечения и настроить порог вручную, чтобы включить или исключить пятна. После того, как пороговое значение определено, нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к "Tracking" шаг.
    4. В соответствии с алгоритмом, найдите и выберите "авторегрессии Motion Алгоритм", нажав на стрелку вниз. Введите 10 мкм для "Максимальное расстояние" и 3 для "Max Gap Размер" находится под параметрами. Отметьте "Заполнить пробелы со всеми обнаруженными объектами", чтобы начать отслеживать, и нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующему шагу.
      Примечание: "авторегрессии алгоритм движения" используется пили объекты, которые направили движение, так как он создает треки на основе прогнозируемого местоположения от предыдущего движения. "Максимальное расстояние" и "Max Gap Размер" может быть скорректирована в зависимости от предполагаемого размера и скорости объекта отслеживается, а также общая продолжительность времени покадровой изображения.
    5. В разделе Тип фильтра выберите "Track Длительность" фильтр. Нажмите на зеленую стрелку, чтобы закончить отслеживание и проверить треки, которые были созданы. Вернитесь к предыдущему шагу, если необходимо вручную сортировать треки.
  4. Если сгенерированный покадровой заносов изображения, правильные для поступательного дрейфа.
    1. Нажмите на иконку с изображением карандаша. Это вкладка редактирования, которая открывает "Edit Tracks" окно. Проверьте замедленную изображения и найти опорную точку, которая не должна двигаться для всех изображений.
    2. В левом верхнем углу экрана, найти окно "Указатель" и отметьте "Select", чтобы активировать кубrsor для выбора места. Нажмите на опорном месте.
    3. Нажмите кнопку "Правильный сносом" в окне "Edit Tracks". Отметьте "трансляционной сносом". Программное обеспечение будет автоматически генерировать исправленный серии изображений.
  5. Мера клеточного движения, определенный объектом дорожек в покадровой изображений.
    1. Под окном "Edit Tracks", отметьте "Треки" и выберите трек, который представляет движение клетки. Выбранная дорожка будет выделена желтым цветом в виде временной последовательности изображения.
    2. Нажмите на иконку с изображением графика, чтобы открыть окно (вкладку статистики) "Статистика".
    3. В разделе "Выбор", выберите "Track средней скорости", нажав на стрелку вниз, чтобы генерировать скорость трека означает для выбранной дорожки. Выберите различные треки и повторите шаги, чтобы измерить скорость трека означает для всех клеток, представляющих интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Костный мозг бедренной кости мыши успешно доступен с помощью WC, что позволяет визуализировать отдельные нейтрофилы и сосудистые сети. На рисунке 1 показан инструмент WC и описана хирургическая процедура, которая включает обнажение бедренной кости и истончение кортикального слоя для получения оптического доступа внутрь кости. Операция хорошо переносится мышами; в течение 5 дней после хирургического вмешательства они оценивались на предмет нежелательных физических реакций,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Серийная визуализация динамических клеточных процессов в костном мозге в режиме реального времени предоставляет информацию, которую в противном случае трудно получить с помощью обычных методов, таких как гистология и общий анализ крови. Описанная здесь модель WC бедренной кости предоставляет уникальные возможности для исследования клеточных и структурных изменений в костном мозге с течением времени. Несмотря на то, что ранее сообщалось о модели туалета бедренной кости, наша новая конструкция обеспечивает большее поле зре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Advanced Optical Microscopy Facility (www.aomf.ca) в Университетской сети здравоохранения за помощь в микроскопии, а также г-на Джейсона Эллиса из машинного цеха Онкологического центра принцессы Маргарет за изготовление туалета и сцены визуализации. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Ирис Кульбатски за редактирование рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NRCNU-F атимические обнаженные мышиTaconicNcr обнаженные8-10 недель, самка
физиологического раствораBaxterJB1302P
кетамина гидрохлоридаBioniche Animal Health Canada, Inc.DIN 01989529
КсилазинBayer HealthCare, Bayer Inc.DIN 02169592
Хирургическая простыняProximaDYNJP2405
Электрическая грелкаLife Brand57800827375
СтереомикроскопLeicaLeica M60
Глазная мазь (слезный гель)Novartis T296/2
7,5% бетадинPurdue Frederick Co67618-151-16
70% изопропиловый спиртGreenFieldP010IP7P
10% бетадинPurdue Frederick Co67618-150-05
Рукоятка скальпеля 3FineScience Tools10003-12
Лезвие скальпеля (#15)VWR89176-368
Пружинные ножницы изогнутыеИнструменты для тонкой науки15023-10
Детский микстер ГемостатИнструменты для тонкой науки13013-14
Ножницытонкой науки Инструменты для тонкой науки14094-11
Щипцы Extra Fine GraefeИнструменты для тонкой науки11151-10
Гемостатики от комаров ХолстедаИнструменты для тонкой науки13008-12
МикросверлоHarvard Apparaus72-6065
Микросверло заусенцевFine Science Tools19007-14
Оконная камера бедренной костиPMCC механический цехпо индивидуальному дизайну9,1 мм- 8,5 мм- 7,5 мм (внешний диаметр к внутреннему), 2,16 мм (радиус двух отверстий), 13,9 мм (расстояние между двумя отверстиями), 0,7 мм (толщина)
U-образный стерженьPMCC механический цех поиндивидуальному дизайну13,8 мм (длина), 1,6 мм (ширина), 3,7 мм (высота)
Защитное стекло (8 мм)Warner Instruments HBIO 64-0701 CS-8R
Стопорное кольцо (8 мм)ACKLANDS GRAINGERUNSPSC #
Гайки (шестигранная нержавеющая сталь)Fastenal70701
Стоматологический цемент3MRelyX U200
Шовный материал (5-0 Monosof черный)CovioienSN-5698
Иглодержатель HalseyFine Science Tools12501-13
Бупренорфин (Темгезик)Reckitt BenckiserDIN 0281251
Meloxicam (Metacam)Boehringer IngelheimDIN 02240463
Амоксициллин (Clamavox)PfizerDIN 02027879
FITC-DextranSigma-AldrichFD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) eBioscience17-9668
Двухфотонный микроскоп LSM 710Carl ZeissZeiss LSM 710 NLO
Столик визуализацииPMCC механический цехпо индивидуальному дизайну15,9 см (длина), 11 см (ширина), 0,9 см (высота)
Программное обеспечение ImarisBitplaneImaris 8.0Программное обеспечение для анализа изображений, описанное в разделе 3 Протокола 
Zen 2012ZeissZen 2012Программное обеспечение для получения изображений, описанное в разделе 2 Протокола 
для 31163202

Ссылки

  1. Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  3. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  4. Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
  5. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
  6. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
  7. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  8. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
  10. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917(2014).
  12. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476(2015).
  13. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
  14. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).
  15. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  16. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
  17. Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).
  18. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
  19. Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).
  20. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  21. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  22. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  23. Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
  24. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  25. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
  26. Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
  27. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  28. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  31. Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Бедро Window камера Модель
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.