Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выращивание дрозофилы

22.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54219

⸱

30 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Wildlife Sciences, Brigham Young University, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Division of Infectious Diseases, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 5Biological Sciences, SUNY Oswego

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Способ выращивания дрозофилы под аксенический и гнотобионтных условиях представлена. Fly эмбрионы dechorionated в гипохлорит натрия, асептически переносят в стерильную диету, и выращены в закрытых контейнерах. Инокулируя диеты и эмбрионов с бактериями приводит к гнотобионтных ассоциаций, и бактериальный присутствие подтверждается металлизированный всего тела дрозофилы гомогенатах.

Аннотация

В последние годы все больше признается влияние микробов на множество черт и поведения животных. Плодовая муха Drosophila melanogaster является моделью для понимания взаимодействия микроорганизмов с животными-хозяевами, чему способствуют подходы к выращиванию больших размеров выборки дрозофилы в условиях, свободных от микроорганизмов (аксенических) или с определенными микробными сообществами (гнотобиотик). В данной работе описан метод сбора эмбрионов дрозофилы, гипохлоритной дехорионации и стерилизации, а также перевода на стерильное питание. Стерилизованные эмбрионы переводятся на стерильную диету в центрифужных пробирках объемом 50 мл, а развивающиеся личинки и взрослые особи остаются свободными от каких-либо экзогенных микробов до тех пор, пока флаконы не будут открыты. В качестве альтернативы мух с определенной микробиотой можно выращивать путем инокуляции стерильной диеты и эмбрионов с видами микроорганизмов, представляющими интерес. Мы описываем интродукцию 4 видов бактерий для создания репрезентативной гнотобиотической микробиоты у дрозофил. Наконец, мы описываем подходы к подтверждению состава бактериального сообщества, включая проверку того, остаются ли аксенические дрозофилы свободными от бактерий во взрослом возрасте.

Введение

Большинство животных тесно связаны с бактериями ( «микрофлора») от рождения до смерти 1. Сравнения микроорганизмов , свободной ( 'аксенический') и микроорганизмов-ассоциированных ( "обычных") животных показали микробы влияют на различные аспекты здоровья животных, в том числе обмена веществ, питательных веществ, сосудистой, печени, органов дыхания, иммунологических, эндокринных и неврологической функции 2. Плодовой мушки дрозофилы является ключевой моделью для понимания многих из этих процессов в присутствии микробов 3,4 и для изучения микробиоты влияния на здоровье животных 5,6. Нет видов бактерий присутствует в каждом человеке ( «ядро»), но Acetobacter и Lactobacillus видов численно преобладают микробиота обоих лабораторных выращенных и пойманных D. MELANOGASTER. Другое Acetobacteraceae (включая Komagataeibacter и Gluconobacter), Firmicutes (такие как Enterococcus и Leuconostoc) и энтеробактерий либо часто присутствуют у дрозофилы лиц при низкой численности, или нерегулярно присутствуют на высокой численности 7.12.

Микрофлора дрозофилы и млекопитающих непостоянно внутри и между поколениями 14,19. Микробиота непостоянство может привести к фенотипической шума при измерении микробиоты-зависимых черт. Например, для хранения Acetobacteraceae влияние липидов (триглицерида) в Drosophila 15-18. Если Acetobacteraceae более многочисленны у мух одного флакона , чем в другом 19, изогенных мух может иметь различные фенотипы 20. Решение для проблемы микробиоты непостоянства у мышей 14 был на практике с 1960 -х годов, путем введения определенного сообщества 8 доминирующих видов микроорганизмов к щенкам мыши каждое новое поколение (измененное Schaedler флоры),гарантируя, что каждый щенок подвергается воздействию тех же самых ключевых членов микробиоты мыши. Эта практика управления для микробиоты композиции , даже когда микрофлора не является основным объектом исследования 32, и устанавливает прецедент для обеспечения присутствия ключевых микробов в различных экспериментальных условиях.

Для того, чтобы определить влияние микробов на Drosophila питания, несколько протоколов , используемых для получения аксенический мух линии были разработаны, в том числе гипохлорита dechorionation эмбрионов (либо получена De Novo каждого поколения или поддерживается генерационно путем передачи стерильных диет) и лечение антибиотиками 13. Есть преимущества различных подходов, таких как легкость и быстрота для обоих лечения антибиотиками и последовательной передачи, по сравнению с более эффективного управления вмешивающихся переменных с де Novo dechorionation (например, плотность яиц, остаточных загрязняющих микробов, вне целевой антибиотик эффектов). Независимо от методаподготовка, введение указанных видов микроорганизмов к аксенический эмбрионов позволяет культуру дрозофилы с определенными ( 'гнотобионтных') общин. В качестве альтернативы, имитируя использование Schaedler флоры, это сообщество может быть привиты к условно-откладывали яйца (следующие шаги 6-7 только), чтобы обеспечить наличие признака, оказывающих влияние микробов в каждом флаконе и избежать осложнений микробиоты непостоянства. Здесь мы опишем протокол для повышения аксенический и гнотобионтных дрозофилы де Novo dechorionation эмбрионов, а также для подтверждения присутствия введенного или загрязняющего микробного таксонов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Бактерии Культура (Старт ~ 1 неделя перед собиранием яиц)

  1. Подготовка модифицированного MRS 20 (КМС) пластин и отвар трубки (таблица 1). Налейте MMRS 20 мл агара в каждую 100 мм чашку Петри и дать остыть / сухой в течение ночи или 5 КМС мл отвар на 18 мм тестовых трубок.
  2. Серия ацетобактеры pomorum, А. tropicalis, Lactobacillus Brevis и L. Plantarum на MMRS чашки с агаром. Выдержите ацетобактеры в течение ночи при 30 ° С. Выдержите Lactobacillus анаэробно путем размещения пластины в герметичном контейнере и затоплению с углекислым газом перед герметизацией. Инкубировать при 30 ° С в течение ночи.
    Примечание: L. Brevis колонии не могут быть не видны до 24-48 ч. Пластины можно хранить при температуре 4 ° С и колонии могут быть использованы в течение 3 недель.
  3. От двух до трех дней перед передачей dechorionated яйца в стерильной диете (раздел 5), выбрать одну колонию от пластины КМС в кон пробиркойчалось MMRS бульон. Grow ацетобактеры при встряхивании и расти Lactobacillus статически в течение 24 часов или до мутной, и при 30 ° С.

2. Подготовить стерильный диета

  1. Приготовьте стерильную диету (таблица 2) в колбе Эрленмейера 2 л. Микроволновая диету, пока она не закипит 3 последовательных раз; смешать между каждым кипению.
  2. Поместите колбу на мешалке для поддержания перемешивания при переносе диеты в конические центрифужные пробирки. Перенести 7,5 мл рациона до 50 мл центрифужные пробирки. Неплотно колпачок трубки, и место в покрытом автоклавируемого полипропиленовой стойку.
  3. Стерилизация летучую диеты с использованием автоклава при температуре 121 ° C и 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 25 мин. Удалите стойки из автоклава, и сразу же встряхните каждую стойку горизонтально, чтобы обеспечить рацион не отделиться во время охлаждения. Будьте осторожны, чтобы не трясти стойки вертикально, чтобы предотвратить передачу диеты на крышке или ободов трубок. Дайте остыть диеты на шейкере в течение ровно 45 мин иснова встряхнуть диету по горизонтали вручную.
    Примечание: Диета может храниться при температуре 4-15 ° С в течение до недели.
  4. В качестве альтернативы использованию покрытых автоклавируемые стоек (шаги 2.1-2.3), или поднять мух на диетах, содержащих консервант кислоты, выполните следующие действия:
    1. Готовят 1 л жидкую диету в 2-литровую колбу с мешалкой в ​​колбу. Автоклава диету.
    2. После обработки в автоклаве, добавляют 10 мл консерванта и непрерывно перемешивают на мешалке с подогревом. Когда агар охлаждали до 50-60 ° С, перемещать колбу на мешалке с подогревом в шкафу биологической безопасности и поддерживать температуру в колбе при нагревании при температуре 50-60 ° С.
    3. В шкафу биологической безопасности, пипетка ~ 7,5 мл индивидуально в конические пробирки.

3. Подготовить яйцекладка Cages

  1. Сделать виноградный сок агаром микроволновке 100 мл воды, 10 г дрожжей пивные, 10 г глюкозы и 1 г агар. Доведите до кипения 3 раза в шаге 1.1 и добавляют 10 г замороженного виноградного сока соncentrate увеличить видимость яиц на агаровой пластине.
  2. Когда агар охлаждали до 55 ° С, заливают 20 мл на 100 мм чашках Петри и позволяют затвердеть.
  3. Накройте на поверхность чашек с агаром с дрожжевой пасты путем смешивания дрожжей 1 г пивными с 15 г воды. Залить дрожжи пасту на агар пластины, убедившись, что поверхность покрыта, а затем слейте избыток, оставляя тонкий остаток дрожжей позади. Если используются несколько пластин, паста может быть последовательно вливают в несколько пластин.
  4. Передача агаром на дно клетки.
    Примечание: гастроном контейнер 32 унций является хорошей заменой для акриловых мух клеток.
    1. Сделайте крышки для гастронома контейнеров 32 унций путем разрезания отверстие в верхней части и приклеивая воздухопроницаемой сеткой над отверстием с нетоксичного клея. Если клей растворяется в воде предотвращения воздействия воды на крышке.
  5. Передача 200-300 летит в контейнер и накрыть крышкой. Накройте сетки с защитой отверстие с пустым чашку Петри крышкой для предупреждет испарение с поверхности агара, и добавьте бумагу влажную ткань на внутренней поверхности крышки, при желании. Выдержите мух при 25 ° С в течение ночи в течение 16-20 ч.

4. собирать яйца

  1. Подготовьте сито для сбора яиц, помещая нейлоновую сетку в пластиковую втулку.
  2. Чтобы получить тарелку с яйцами на него, удалить мух из клетки путем передачи пустого контейнера. Если же мухи будут использоваться на следующий день, немедленно передать в новую клетку, содержащую свеже дрожжевого агаризованной виноградный сок. Мухи могут быть использованы в течение 3-5 последовательных дней
  3. Удалить мертвых мух из агара с чистой кистью, соблюдая осторожность, чтобы не разбить агар.
  4. Сбор яиц путем промывки агаризованной дистиллированной водой, аккуратно чистит яйца с поверхности агара, и заливкой суспензии над сеткой. Повторить 3-4 раза, пока все или большинство яиц не были удалены из чашки с агаром.

5. Dechorionate яйца и передачи в стерильную DИЭПП

  1. Подготовьте кабинет по биобезопасности путем распыления внутри (в том числе сторон) с 70% -ным этанолом. Протрите дно с лабораторной ткани и стерилизовать капюшон с УФ-светом в течение ~ 15 мин. Стерилизовать все небиологических поставки (образец чашки, кисть, щипцов, контейнер для отходов, 400 мл стерилизованной воды и 100 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия) путем распыления с этанолом и сразу же размещения в шкафу биологической безопасности. Стерилизуют ультрафиолетовым светом в течение 15 мин.
  2. Запустить первый из 2 гипохлорита натрия промывок путем размещения втулке с яйцами в мл образца чашку 120 или другой стерильный контейнер. Медленно влить ~ 90 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия во втулку до чуть ниже обода.
  3. Полоскание яйца в течение 2,5 мин. Периодически повторно приостанавливать яйца с помощью щипцов, чтобы переместить втулку вверх и вниз в раствор гипохлорита.
  4. Перенести втулку непосредственно во вторую чашку образца, предварительно заполненный 90 мл хлорной извести, внутри шкафа биологической безопасности.
  5. Повторениешаг 5.3 внутри шкафа биологической безопасности. В конце второй обработки хлорной извести, яйца должны начать придерживаться сторон втулки.
  6. Выполните действия в кабинете биологической безопасности 5,7-5,8.
  7. Выбросьте отбеливатель и промойте втулку стерильной водой в 3 раза. Повторное приостановить яйца несколько раз в течение каждого мытья путем перемещения втулки с пинцетом. К концу третьего мытья большинство яиц должны быть прикреплены к боковой стороне втулки.
  8. Используя кисточку стерилизовали в этаноле, передавать яйца со стороны втулки к стерильной диете. Передача яйца по отдельности или небольшими партиями. Цель для 30-50 яиц в одном флаконе. Оставьте колпачки свободно, чтобы кислород, чтобы войти в трубу. Если пузырьки должны оставаться аксенический, трансфер в инкубаторе насекомых; в противном случае, добавьте бактерии, как показано ниже.

6. Сделать гнотобионтных Мухи Использование 4 видов бактерий

  1. Приготовьте бактерии
    1. Подготовьте стерилизованные шкаф биобезопасности при необходимых расходных материалов (рipettes, пипетку коробки, стерилизованные центрифужные пробирки, MRS бульоне и стоек для пробирок), как на этапе 4.1. Протрите наружную поверхность пробирки с этанолом лаборатории пропитанной протирать перед помещением в кабинете биологической безопасности.
    2. Гранул бактерии сначала путем переноса 500 мкл роста в течение ночи в стерильной пробирке. Если бактериальная плотность мала, добавить до 1,5 мл в каждую пробирку или последовательно удалить супернатант и добавить дополнительную культуру в той же трубе. Удалить образцы из шкафа биологической безопасности и центрифуги в течение 10 мин при 10000 х г. Используйте подсказки фильтра, чтобы избежать загрязнения между образцами.
    3. Определить плотность каждой культуры путем измерения OD 600. При использовании многоскважинных планшет-ридер, передача 200 мкл каждой культуры в 96-луночный планшет в 1-, 2- и 4- кратном разбавлении.
    4. Определить количество КМС, в котором, чтобы разбавить каждый клеточный осадок (5.2.2) с помощью спектрофотометра пластины для чтения и следующие уравнения. План, чтобы добавить достаточно бульона, чтобы инокуляции 50 &# 956; л в каждый флакон мух.
      1. Соберите OD 600 показания для 1: 1, 1: 2 и 1: 4 разведение каждой бактериальной культуры на тарелке чтения спектрофотометра. Выберите разбавление для каждого бактериального штамма , который производит 600 значение OD от 0,1 до 0,2 и использовать это значение и соответствующий коэффициент разбавления как 'O' и 'D' в формулах , приведенных в 6.1.4.2 или 6.1.4.3.
      2. При использовании 4 видов , описанных здесь, нормализуют клетки в эквивалентные колониеобразующих единицы (КОЕ) / мл плотности (OD 600 до преобразования КОЕ определяется ранее 20) , используя это уравнение:
        E = ((OB) х V х Г) / С
        где Е = объем ресуспендирования гранул в (мкл), O = OD 600 бактерий, B ​​= OD 600 пустой носитель, D = кратное разведение, V = мкл бактериальной культуры перед центрифугированием, C = OD 600 из заданной постоянной. См Дополнительный код файла примеры расчетов с использованием этих уравнений. Для спектрофотометраs, которая автоматически пустым, используйте "O" вместо "OB".
        Примечание: Заранее определенные константы (единицы измерения OD 600, нормированная к 10 7 КОЕ мл -1, константы , полученные в 20) следующим образом : A. tropicalis (0,052), А. pomorum (0,038), Л. Brevis (0,056), Л. Plantarum (0,077).
      3. При использовании других видов бактерий (не КОЕ / OD 600 константа не доступен), нормализуют плотность до OD 600 = 0,1 с помощью этого уравнения:
        E = ((OB) х V х Г) /0.1 OD 600
        Примечание: Единицы такие же, как на этапе 6.1.4.2. См Дополнительный код файла примеры расчетов с использованием этих уравнений.
    5. В шкафу биологической безопасности, удалить супернатант с наконечником пипетки и ресуспендируют осадок в свежих КМС или PBS в расчете на этапе 6.1.4.2.
  2. Привить Бактерии
    1. Передача 50 мкл бактерий в конические пробирки со стерильным рационеd dechorionated яйца в шкафу биологической безопасности. Добавить бактерии после переноса яйца, чтобы предотвратить загрязнение между флаконах.
    2. Поместите засеянных пробирки в термостат при температуре 25 ° С

7. Измерение КОЕ нагрузки / Тест на стерильность

  1. Для измерения нагрузки КОЕ в целом тело мухи гомогенатах, передача 5 мух (5-7 дней после вылупления) до 1,7 мл пробирке, содержащей 125 мкл керамических шариков и 125 мкл MMRS бульона. Однородный мух с помощью гомогенизатора тканей в течение 30 сек при 4,0 м / сек.
    1. В качестве альтернативы, опустить шарики и рука гомогенизировать в микропробирок с пластиковыми пестиков в течение 1 мин.
    2. Если количественного кишечную флору, стерилизует поверхность мух для удаления экзогенных микробов 22. Передача летит в микроцентрифужных пробирку, содержащую 100 мкл 70% этанола в течение 1 мин, аспирация этанола и перехода на новую пробирку микроцентрифужных для гомогенизации. Если содержание ДНК в кишечнике будет измеряться, полоскание Fили 1 мин с 0,6% раствором гипохлорита натрия перед промывкой этанолом.
  2. Развести гомогената 875 мкл MMRS, вортексе в течение 5 сек, и пипеткой 120 мкл гомогената в первую лунку микротитрационного планшета.
  3. Выполните два последовательных 1: 8 разведений с использованием 10 мкл гомогената и 70 мкл MRS в течение следующих двух скважин.
    1. Удалить 10 мкл из первой скважины и добавить его на вторую лунку, содержащую 70 мкл MRS. Смешайте содержимое второй скважины тщательно, перенос 10 мкл из второй скважины на третьей скважине, содержащей 70 мкл MRS, и тщательно перемешать. Это приводит к 3 общей концентрации исходного 1000 мкл гомогената: в неразбавленном виде, 1: 8 и 1:64.
  4. Передача 10 мкл каждого разведения к пластине КМС (используя пипетку многоканальную при желании). Слегка наклоните блюдо, чтобы распространить разведение на несколько миллиметров вниз поверхность агара и дайте жидкости высохнуть перед перемещением пластины. Жидкость сохнет по наце пластины быстро если пластины 2 дней, уменьшая смешение двух соседних капель.
  5. Инкубировать при 30 ° С в течение 1-2-х дней. Удалить пластины из инкубатора сразу различны, отдельные колонии видны, и считать от разбавления 10-100 изолированных колоний.
  6. Вычислить КОЕ на лету, используя уравнение E = С х D / P х V / F, где Е = КОЕ на лету, C = количество колоний подсчитывали, D = разбавление, P = мкл высевали, V = объем зольной гомогената и F = число мух гомогенизированных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное разведение аксенический мух подтверждается выделением не КОЕ от гомогенизации всего тела обследуемого D. MELANOGASTER взрослых (рисунок 1). В качестве альтернативы, если гальваническим гомогенат дает колонии, Флаконы загрязнены и должны быть отброшены. Для гнотобионтных мух, каждый из четырех бактериальных изолятов были выделены из пулов 5 взрослых самцов, демонстрируя различия в общем объеме жизнеспособных КОЕ , связанных с взрослых мух (рисуно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь метод является одним из нескольких подходов для эмбрионов dechorionation 8,11,18,25,26,27 вместе с альтернативными методами выращивания аксенический мух, в том числе последовательный перевод аксенический взрослых 18,27 или лечения антибиотиками 13,18. Другие методы включают dechorionation промывок этанол и уменьшить 11,25,26 или продлить 8 гипохлорита лечение. Различные этапы стирки может помочь выращивание различных генотипов мух: в предыдущем...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Некоторые детали этого протокола были оптимизированы с помощью доктора Адама Добсон, который также предоставили полезные замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Фондом Национальных институтов здравоохранения (FNIH) номер гранта R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD и AED). FNIH грант номер 1F32GM099374-01 (PDN) и Университет Бригама Янга запуска средства (JMC, MLK, М. В.). Затраты на публикации были поддержаны Brigham Young University College биологических наук и кафедры растительного и животного мира наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пивные дрожжиMP Biomedicals, LLC.903312http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312
глюкозаSigma Aldrich158968-3KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US
AgarFisher--Lab Scientificfly802010https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177
100% концентратвиноградного сока Welch'sWalmart или другой продуктовый магазин9116196http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406
Клетка: 32 унции. Полупрозрачный круглый контейнер для деликатесовWebstaurant Store999L5032Yhttp://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html
Полупрозрачная круглая крышка контейнерадля деликатесов Webstaurant Store999YNL500http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html
стоковые бутылкиGenesee Scientific32-130https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130
дросо-заглушкиGenesee Scientific49-101https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101
Нейлоновая сеткаGenesee Scientific57-102 https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102
Пластиковая втулкаHome Depot100404002http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002
Пластиковая втулка Caping HomeDepot100153897http://www.homedepot.com/p/1-1-4-in-rigid-Plastic-Insulated-Buding-2-Pack-27529/100153897
Образец чашкиMedSupply PartnersK01-207067http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html
Репитер M4Eppendorf4982000322https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html
50 мл Центрифужныепробирки TrueLineTR2003https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003
пищевых коробокСША Научный2316-5001http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001
Лизирующая матрица D BulkMP Biomedicals, LLC.116540434
http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search наконечники для пипеток с фильтром, 300 мкм; l США Scientific1120-9810http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810
по продаже продукции в чашках ПетриM089303https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303
EthanolDecon Laboratories, INC.2701http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88
КистьWalmart5133http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005
щипцыFisher08-882https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693
Бытовой отбеливатель (6-8% гипохлорита)Walmart550646751http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295
Универсальный пептонGenesee Scientific20-260https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260
дрожжевой экстракт  Fisher ScientificBP1422-500https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500
дикалийфосфатSigma AldrichP3786-1KGhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&
N=0& mode=match%20partialmax& lang=
ru& region=US& focus=продукт
Цитрат аммонияSigma Aldrich25102-500гhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N
=0& mode=match%20partialmax& lang=
ru& region=US& focus=product
Ацетат натрияVWR97061-994https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994
Сульфат магнияFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500
Сульфат марганцаSigma Aldrich10034-96-5http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match<чел/> %20partialmax& lang=ru& region
=США& focus=product
MRS PowderSigma Aldrich69966-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US
96-луночный планшетный ридерBioTek (Epoch) NAhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_
spectrophotometer.html
Центрифужные пробирки 1,7 млСША Scientific1615-5500http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500
Наконечники для пипеток с фильтром, 1,000 μ l США Scientific1122-1830http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830
96 луночных пластинGreiner Bio-One655101https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/
13243/
керамические бусиныMP Biomedicals, LLC.6540-434
http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 Тканевый гомогенизаторMP Biomedicals, LLC.116004500
http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 Шкаф биобезопасности класса 1Thermo Scientific Модель 1395http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html
Лаборатория

Ссылки

  1. McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
  2. Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their commensal intestinal microbiota. Semin Immunol. 19 (2), 59-69 (2007).
  3. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  4. Arias, A. M. Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century. Methods Mol Biol. 420, 1-25 (2008).
  5. Lee, W. J., Brey, P. T. How microbiomes influence metazoan development: insights from history and Drosophila modeling of gut-microbe interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 571-592 (2013).
  6. Erkosar, B., Leulier, F. Transient adult microbiota, gut homeostasis and longevity: novel insights from the Drosophila model. FEBS Lett. 588 (22), 4250-4257 (2014).
  7. Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genet. 7 (9), e1002272(2011).
  8. Broderick, N. A., Buchon, N., Lemaitre, B. Microbiota-induced changes in drosophila melanogaster host gene expression and gut morphology. MBio. 5 (3), 01117(2014).
  9. Wong, C. N., Ng, P., Douglas, A. E. Low-diversity bacterial community in the gut of the fruitfly Drosophila melanogaster. Environ Microbiol. 13 (7), 1889-1900 (2011).
  10. Staubach, F., Baines, J. F., Kunzel, S., Bik, E. M., Petrov, D. A. Host species and environmental effects on bacterial communities associated with Drosophila in the laboratory and in the natural environment. PLoS One. 8 (8), e70749(2013).
  11. Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12974-12979 (2004).
  12. Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
  13. Ridley, E. V., Wong, A. C., Douglas, A. E. Microbe-dependent and nonspecific effects of procedures to eliminate the resident microbiota from Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 79 (10), 3209-3214 (2013).
  14. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437(2014).
  15. Chaston, J. M., Newell, P. D., Douglas, A. E. Metagenome-wide association of microbial determinants of host phenotype in Drosophila melanogaster. MBio. 5 (5), 01631-01714 (2014).
  16. Huang, J. H., Douglas, A. E. Consumption of dietary sugar by gut bacteria determines Drosophila lipid content. Biology Letters. , (2015).
  17. Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
  18. Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metab. 14 (3), 403-414 (2011).
  19. Wong, A. C., Chaston, J. M., Douglas, A. E. The inconstant gut microbiota of Drosophila species revealed by 16S rRNA gene analysis. ISME J. 7 (10), 1922-1932 (2013).
  20. Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 80 (2), 788-796 (2014).
  21. Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster. Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).
  22. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  23. Wong, A. C., et al. The Host as the Driver of the Microbiota in the Gut and External Environment of Drosophila melanogaster. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6232-6240 (2015).
  24. Dobson, A. J., et al. Host genetic determinants of microbiota-dependent nutrition revealed by genome-wide analysis of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 6, 6312(2015).
  25. Bakula, M. The persistence of a microbial flora during postembryogenesis of Drosophila melanogaster. J Invertebr Pathol. 14 (3), 365-374 (1969).
  26. Ryu, J. H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
  27. Blum, J. E., Fischer, C. N., Miles, J., Handelsman, J. Frequent replenishment sustains the beneficial microbiome of Drosophila melanogaster. MBio. 4 (6), 00860(2013).
  28. Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density. Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).
  29. Edward, D. A., Chapman, T. Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster. Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).
  30. Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (5), e36765(2012).
  31. Newell, P. D., et al. In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors. Front Microbiol. 5, 576(2014).
  32. Dewhirst, F. E., et al. Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora. Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).
  33. Min, K. T., Benzer, S. Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.

Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).

to:

If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

Больше статей

Аксенические условиясбор эмбрионовдехорионизация гипохлоритомстерильный перенос на средубактериальная инокуляцияколониеобразующие единицывыращивание в безмикробных условияхподтверждение стерильности
Выращивание дрозофилы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.