Как изучать базальной мембраны Жесткость как биофизической Trigger в раке простаты и других патологий, связанных с возрастом или метаболических заболеваний

Краткое содержание

Здесь мы объясняем протокол для моделирования биофизических микросреду, где сшивание и повышенная жесткость базальной мембраны (БМ), индуцированной передовых гликирования (возрасты) имеет патологическое значение.

Аннотация

Здесь мы опишем протокол , который может быть использован для изучения биофизических микросреду , связанные с увеличенной толщиной и жесткости базальной мембраны (БМ) во время возрастных патологий и нарушений обмена веществ (например , рак, диабет, микрососудистой болезни, ретинопатия, нефропатия и нейропатия) , Предпосылкой модели является неферментативного сшивание реконструированной матрицы БМ (УКР) путем обработки гликолевого (GLA) для продвижения передовых гликирования endproduct (AGE) генерацию с помощью реакции Майяра. Примеры лабораторных методов, которые могут быть использованы для подтверждения возраста, поколение неферментативного сшивание и повышенную жесткость в GLA обработке RBM очерчены. К ним относятся подготовка отечественных RBM (обработанных фосфатно-буферном солевом растворе, PBS) и жесткой RBM (обработанных GLA) для определения: его содержание AGE фотометрическим анализа и иммунофлюоресценции микроскопии, его неферментативного сшиванию додецилсульфата полиакриламида натриягель-электрофореза (SDS-PAGE), а также конфокальной микроскопии, а его повышенную жесткость с помощью реометрия. Процедура, описанная здесь, может быть использован для увеличения жесткости (модули упругости, Е) RBM до 3,2 раза, в соответствии с измерениями, проводимыми в здоровой по сравнению с патологически измененной ткани предстательной железы человека. Для того, чтобы воссоздать биофизической микросреду, связанный со старением и пораженной железы три типа клеток простаты были введены на родном RBM и жесткой RBM: RWPE-1, простаты эпителиальные клетки (УИКи), полученной из нормальной предстательной железы; BPH-1, УИКи, полученные из железы, пострадавших от доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ); и PC3, метастатические клетки, полученные из вторичного костного опухоль, исходящая от рака простаты. Несколько параметров могут быть измерены, в том числе размер, форма и инвазивные характеристики железистой ацинусов 3D образованного RWPE-1 и BPH-1 по сравнению с родной жесткой УОР и средней длины ячейки, миграционный скорости и сохранения клеточного движения 3D-СФЕРOID, образованные PC3 клетками в тех же условиях. Сотовый путей и внутриклеточную локализацию белков сигнализации также могут быть оценены.

Введение

Базальная мембрана (БМ) — это лист специализированного внеклеточного матрикса (ВКМ), который поддерживает стабильные границы тканей, отделяя слои эпителиальных клеток от стромы¹. Ковалентная сшивка между соседними тройными спиралями коллагена IV в КМ стабилизирует их латеральную ассоциацию путем создания нерегулярной сети сверхзакрученных спиралей². Эти коллагеновые внутривенные решетки выступают в качестве каркаса для его взаимодействия с ламинином и другими компонентами БМ¹. Структурное расположение БМ обеспечивает ему механическую прочность и жесткость, необходимые для нормального развития железистого эпителия³.

Во время старения и болезней БМ постепенно утолщается и становится жестче^3,4. Например, 3-кратное увеличение модуля эластики (Е) глазного КМ происходит в возрасте от 50 до 80 лет в нормальной популяции, и это повышение еще больше усугубляется при метаболических нарушениях, таких как диабет⁵. Структурные и биомеханические изменения в БМ, приводящие к повышению ее жесткости, происходят, когда ее компоненты ВКМ, коллаген IV и ламинин, становятся неферментативно сшитыми после их воздействия конечных продуктов гликирования (КПГ).

Целью описанного здесь метода было создание модели для исследования того, как жесткость КМ из-за воздействия AGE способствует инвазивности эпителиальных клеток предстательной железы (PEC) и клеток опухоли предстательной железы (PTC) в контексте перехода к метастатическому раку предстательной железы (PCa). Для этого предыдущий метод, используемый для получения 3D железистых ацинусов из эпителиальных клеток молочной железы (МЭК) в восстановленных гелях^{rBM 6}, был адаптирован для включения дополнительной стадии, на которой гели rBM предварительно обрабатываются гликолальдегидом (GLA). Описаны несколько методов оценки индуцированного GLA сшивания и затвердевания предварительно обработанных гелей rBM, включая фотометрический анализ, электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS PAGE), конфокальную микроскопию и реометрический анализ. Типы клеток предстательной железы, выбранные для культивирования на предварительно усиленных rBM, включают: RWPE-1, PECs, полученные из нормальной предстательной железы⁷; ДГПЖ-1, ПЭК, полученные из предстательной железы, пораженной ДГПЖ⁸; и PC3, метастатические ПТК, полученные из вторичной опухоли, расположенной в позвоночной кости пациента с раком предстательной железы (РПЖ)⁹.

В дополнение к продвижению изучения патологии предстательной железы, протокол для повышения жесткости гелей rBM путем их лечения GLA может быть адаптирован для изучения того, как жесткость КМ способствует другим возрастным патологиям и метаболическим нарушениям. Например, модель может быть непосредственно применена для исследования того, как метастатический рак индуцируется ригидностью КМ в таких органах, как молочная железа, толстая кишка, яичники и поджелудочная железа, путем включения соответствующих типов клеток. Кроме того, протокол может быть адаптирован для изучения того, как жесткая КМ способствует биомеханическим механизмам прогрессирования заболевания при микрососудистых заболеваниях, связанных с диабетом, ретинопатии, нефропатии и нейропатии.

Протокол

1. Индукционная БМ Жесткость, индуцированный GLA Лечение (Неферментативный Сшивание)

1. Оттепель замороженный флакон матрицы БМ (10 мл) путем инкубирования при 4 ° С (стоя на льду в холодном помещении или холодильнике), пока содержимое флакона не стали жидкости (8-16 ч).
   Внимание: Если холодное помещение / холодильник не используется, покрывают всю бутылку со льдом. Это позволит предотвратить маточного раствора БМ затвердевание.
2. Для будущих экспериментов и избежать повторных циклов замораживания и оттаивания, подготовить 25 х 0,4 мл аликвоты из каждого нового флакона матрицы BM 10 мл. Хранить флаконов при температуре -80 ° C до истечения срока годности, указанного изготовителем. При необходимости оттаивать ампул при 4 ° С, стоя на льду в течение 2 ч.
3. Подготовьте ровную поверхность льда. Поместите 8-и камерный предметного стекла на поверхности льда, чтобы поддерживать температуру 4 ° С во время процедуры нанесения покрытия. Оттепель флакон матрицы БМ при температуре 4 ° С.
   Примечание: Один 0,4 мл флакон матрицы BM достаточно СоАт целую 1 х 8-луночного камеры слайд. Держите флакон, покрытый льдом при обращении, чтобы предотвратить матрицу BM затвердевание.
4. Отрезанные выдачного конца 200 мкл кончика пипетки с помощью ножниц. Охлаждают с тупыми концами 200 мкл кончиком пипетки до 4 ° C и поместите его на 200 мкл емкости пипетирования помощи. Поднимают 40 мкл холодного раствора матрицы BM в наконечник пипетки и передать его в скважину на охлажденную 8-луночного камера предметное стекло.
   Примечание: 40 мкл раствора BM достаточно , чтобы покрыть площадь поверхности 0,8 см ^2. Хранить пипеток в охлажденном во время процесса нанесения покрытия для предотвращения застывания раствора BM. Не вводить пузырьки воздуха в раствор матрицы БМ и обеспечивают скважину равномерное покрытие без образования видимых мениска на краях.
5. Повторите шаг 1.4 в зависимости от количества скважин и камер требуется.
6. После того, как покрытие, поместите 8-луночного камеры слайд при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы способствовать полимеризацииот БМ. Закройте дверцу инкубатора очень осторожно, чтобы избежать нежелательного нарушения жидкости УКР. Не превышать 30 мин времени инкубации, чтобы избежать обезвоживания геля УКР.
   Примечание: Полученный гель является родным восстановленный BM (УОР). Стадия C Инкубационный 37 ° не требует 5% CO _2. Тем не менее, для удобства выполнения этого шага в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С и 5% CO ₂ (с увлажнением).
7. Готовят 50 мМ гликолевого альдегида (GLA), разведенный в 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,8). Стерилизацию раствора путем пропускания его через шприцевой фильтр 0,22 микрон с использованием 50 мл шприца.
   1. Для реакции сшивания в конечном объеме 250 мкл 50 мМ GLA, добавляют 25 мкл 0,5 М цианоборгидрида натрия или 2,5 М аминогуанидином к 125 мкл 100 мМ GLA (2х акций), и 100 мкл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,8 ). Стерилизация маточных растворов путем пропускания через шприцевой фильтр 0,22 микрон с использованием 50 мл шприца.
      Внимание: Ручка натрийборциангидрид носить лабораторный халат, перчатки, faceshield и респиратором во время работы в вытяжном шкафу.
8. Добавьте 250 мкл раствора гамма-линоленовой кислоты, чтобы покрыть полимеризованный гель RBM и инкубировать при 37 ° С в течение 6 ч с получением полу-жесткой RBM гель или 14 ч для получения жесткой гель RBM.
   Примечание: Объем GLA добавлен должен покрывать полимеризованный гель RBM и должны быть соответствующим образом скорректированы. Если используются разные времена ГЛК инкубации гели RBM должны быть проанализированы, чтобы определить, загнутой увеличение жесткости RBM (этап 2.4).
   1. Приготовьте отрицательный контроль путем инкубирования нативный гель УКР в 250 мкл стерильного фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) в течение 14 ч при 37 ° С.
   2. Приготовьте два дополнительных элементов управления, где ингибируют образование основания Шиффа или Амадори аддукта перегруппировке во время реакции сшивания, добавлением 50 мМ цианоборогидрида натрия или 250 мМ аминогуанидином.
9. Приготовьте 1 М глицин еThyl эфир (ГЭЭ), разведенного в PBS. Стерилизацию раствора путем пропускания его через шприцевой фильтр 0,22 микрон с использованием 50 мл шприца.
10. После указанного времени инкубации, осторожно удалите раствор GLA из сшитых гелей RBM, GLA раствор, содержащий ингибиторы из УКР гелей управления и PBS с контрольными носителями гелей УКР. Добавьте 250 мкл раствора GEE для всех гелей RBM и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
    Примечание: Этот шаг гасит реакцию сшивания.
11. Промыть гели RBM 10 раз в 500 мкл PBS, чтобы удалить все следы GLA и ГЭЭ. Инкубируйте гели RBM в течение ночи при температуре 37 ° С в 400 мкл PBS, чтобы предотвратить их обезвоживание.
    1. Проанализировать гели RBM для накопления AGE, неферментативного сшивающих и вязкоупругих свойств (шаги 2.1-2.4). Для Реометрические анализа их вязкоупругих свойств готовят гели RBM в клонировании кольцах (шаг 2.4).
    2. Для культивирования клеток, ополоснуть RBM гели 2 раза с 500 мкл культуры менядиам перед посевом клеток (шаги 5 и 6). Выполнение промывок аккуратно без наконечника пипетки касаясь поверхности геля.

2. Количественное Неферментативные Сшивание и скованность УКР Обработанные с GLA

1. Фотометрический анализ
   1. Мера накопление AGE в GLA контрольных и обработанных RBM гелей с использованием фотометрического анализа, чтобы определить степень реакции Майяра.
      1. После этапа 1.11, удалите PBS из RBM гелей в 8-луночных камерных слайдов и добавить 250 мкл ледяной дважды дистиллированной воде. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 16-24 ч, чтобы гарантировать, что матрица полностью сжиженным.
         Примечание: RBM пептиды в этом растворе содержат AGES с автоматическим флуоресцентных свойств.
      2. Перенести сжиженным раствор БМ в 1,5 мл трубки и измеряют флуоресцентное излучение раствора, используя спектрофотометр (длина волны возбуждения = 370 нм, длина волны излучения = 440 нм).
2. SDS-PAGE Анализ цианобромидом пептидами
   1. Устраните GLA контрольных и обработанных RBM гели на полиакриламидном геле, чтобы подтвердить, что GLA побудила сшивание и образование макро-волокон.
      1. Центрифуга сжиженным решение BM, собранных на шаге 2.1.1.2 при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Подготовка исходного раствора, содержащего 2 г / мл бромистого циана, разведенного в ацетонитриле.
         Внимание: Всегда обрабатывать цианогенбромидом в вытяжном шкафу при ношении лабораторный халат, перчатки, faceshield и респиратором.
      3. Удалить супернатант, вновь приостановить гелевый осадок BM в 500 мкл 20 мг / мл бромистого циана + 70% об / об муравьиной кислоты и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
      4. Используйте 1 мл шприц одноразового для передачи ресуспензированной BM гель гранул в диализную кассету с молекулярной массой отрезан 3,5 кДа.
      5. Погрузите кассету в стеклянный стакан емкостью 500 мл, содержащий 500 мл дистиллированной воды и магнитной мешалкой.Поместите это на магнитную мешалку и диализ в течение ночи (16 ч) при температуре 4 ° С (в холодном помещении), чтобы удалить все следы бромистого циана и муравьиной кислоты.
      6. Используйте 1 мл шприц одноразового для передачи Диализированный раствор БМ из кассеты в 1,5 мл пробирку.
      7. Проанализировать по 25 мкл каждого образца БМ на объем / объем геля ^10,11 12% полиакриламидном. После SDS-PAGE, осуществляют окрашивания серебром в полиакриламидном геле ¹² , чтобы визуализировать электрофоретической образец бромистый циан-матричных пептидов ^13.
3. Анализ Иммунофлуоресцентного Микроскопия
   1. Выполните иммунофлуоресцентного окрашивания GLA контрольных и обработанных RBM гели с анти-AGE / пентозидина, анти-коллаген IV и анти-ламинин антител с последующим конфокальной микроскопии для визуализации накопленных возрасты и коллагена IV / ламинин волокна структурных перестроек в сшитом RBM гели ^13.
      Примечание: Всегда используйте достаточный объем для покрытия ENTIповторно RBM гель во время инкубирования и моет, не касаясь поверхности RBM кончиком пипетки. Для получения дополнительной информации о 3D анализа ацинусов культур с помощью иммунофлуоресценции см ссылку ⁶ и конфокальной микроскопии 3D ацинусов см ссылку ^14.
      1. Промыть ГЛК лечение и контроль RBM гели в 8-Скважина камерные слайды 2 раза по 300 мкл PBS + (PBS , содержащим 0,1 мМ CaCl ₂ и 0,5 мМ MgCl ₂₎ в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Удалите PBS + затем добавить 300 мкл 4% вес / об параформальдегида (PFA), разведенного в PBS +, чтобы покрыть каждый гель RBM. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы зафиксировать компоненты RBM.
      3. Удалите 4% вес / объем раствора PFA. Добавить добавить 300 мкл 75 NH ₄ мМ раствора Cl + 0,5 мМ MgCl ₂ и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (повтор 5x) для гашения фиксации.
      4. Подготовьте иммунофлюоресценции буфер (если буфер), сделав следующее решение в стерильной воде: 130 мМ NaCl, 7 мМ Na ₂ HPO _4, 3,5 мМ NaH₂ PO _4, 7,7 мМ NaN _3, 0,1% вес / об бычьего сывороточного альбумина, 0,5% об / об полиэтиленгликоль трет- октилфенильная эфир и 0,05% об / об полиэтиленгликоль монолаурат сорбита.
      5. Подготовьте ПЧ блокирующий буфер, дополнив ПЧ буфер с 20% об / об сыворотки козьего.
      6. Удалите раствор закалкой и добавить 300 мкл блокирующего буфера IF для гелей RBM для предотвращения неспецифических реакций. Выдержите 2 часа при комнатной температуре на качалке платформе.
      7. Удалить блокирующий буфер, если и инкубировать гели RBM в течение 16 ч при температуре 4 ° С с 300 мкл первичного антитела, разведенного в ПЧ блокирующем буфере (1: 500 мышиное анти-пентозидина мАт, 1/250 кролика против коллагена IV ПАБ; 1 / 250 кроличье анти-ламинин / C ПАБ).
         Примечание: Инкубирование в течение более 20 часов при температуре 4 ° С может смешивать в миксере УКР.
      8. Удалить первичное антитело и промыть 3 раза (10 мин каждый) с 300 мкл буфера IF при комнатной температуре на качалке платформы.
      9. Удалить буфер IF иДобавьте 300 мкл вторичного антитела (козий анти-кроличий или анти-мышиного IgG [H + L]), конъюгированных с флюорохромом разведенного 1: 500 в блокирующем буфере ПЧ. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на качалке платформы.
      10. Удалите вторичные антитела и инкубировать в 300 мкл буфера для ПЧ в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите буфер, если и промыть 3 х 10 мин в 300 мкл PBS + при комнатной температуре.
      11. Закрепить и гасят второй раз, как описано выше (этапы 2.3.1.2 и 2.3.1.3).
      12. Монтировать запятнанные гели RBM в монтажных средах и анализ формирования плотных пучков основных компонентов с использованием эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
          Примечание: Подробную информацию о 3D анализа ацинусов культур с помощью иммунофлуоресценции см ссылку ⁶ и эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии 3D ацинусов см ссылку ^14.
4. Анализ Реологические
   1. Выполните Реометрические анализ GLA контрольных и обработанных RBM гели для измерения их Viscoelasticity (жесткость).
      1. Установка RBM гели, которые имеют толщину в круглой форме с диаметром 8 мм, 1 мм. Чтобы сделать это, поместите клонированию кольцо (диаметр 8 мм) внутри скважины культуры пластины 24-луночного и добавьте BM матричного раствора, приготовленного, как описано в шагах 1.3-1.6.
         Примечание: Для точного перепросмотре гелей RBM, используемых для экспериментов, гели RBM, подготовленные для Реометрические анализа необходимо иметь такую ​​же площадь поверхности и толщину, как гели RBM, созданных в 8-луночных камер. Гели RBM , проанализированные на рисунке 3 были толщиной 1 мм и диаметром 8 мм.
      2. Лечить гели RBM созданы в клонированию кольцах с PBS, GLA в течение 6 ч и GLA в течение 14 ч, как описано выше (этапы 1.8 до 1.11).
      3. Измерьте модуль упругости (Е) диаметром 8 мм RBM гелей на реометре с диаметром 8 мм с параллельными пластинами зазубренными геометрии, в диапазоне 1-3% деформации, при фиксированной частоте колебаний 1 Гц и температуре 21 ° С. Для получения дополнительных сведений ореометрия анализ ECM гелей см ссылки см эталонный ^13,15,16.
         Примечание: Е определяется из полученного модуля упругости при сдвиге (G ') путем использования следующего уравнения E = 2 + G' * (1 + V) , где V есть коэффициент Пуассона , равный 0,5, как описано в ссылке ^{13,15 , 16.}

3. Культура и обработка линии Нормальная PEC, RWPE-1

1. Grow RWPE-1 клеток в кератиноцитов не содержащей сыворотки среде (KSFM), дополненной 5 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF), 50 мкг / мл бычьего гипофизарный экстракт (BPE) и 50 ед / мл пенициллина с 50 мкг / мл стрептомицина ( завершить KSFM).
   Примечание: Во избежание индукции эпителиальной-к-мезенхимальных (EMT) -как переход не подвергать RWPE-1 клеток в сыворотке крови. Разрешить полный KSFM достичь комнатной температуре в течение 30 мин после снятия с хранения при 4 ° С и не тепло в C водяной бане при 37 °, как это инактивирует EGF и BPE.
2. Аспирируйте полныйKSFM от сливающийся 10 см ² пластины клеток RWPE-1, промывают 5 мл подогретого PBS и добавляют 5 мл 0,05% об / об трипсин гарантируя , что все клетки покрыты раствором.
   1. Поместите клетки в культуре ткани инкубатор при стандартных условиях 37 ° С и 5% CO ₂ (с увлажнением) в течение 5 до 10 мин. Проверьте степень трипсином через 5 мин и осторожно нажмите на культуру пластину, чтобы отделить клетки.
      Примечание: клетки RWPE-1 не переносят длительные периоды трипсином поэтому рекомендуется не обрабатывать более двух пластин одновременно. Кроме того, важно, чтобы диссоциировать все клетки от пластины, чтобы избежать клональной селекции.
3. Когда все клетки RWPE-1 имеют в отрыве, добавляют 5 мл теплого PBS, содержащего 2% v / v фетальной телячьей сыворотки (FCS) для гашения трипсина. Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить клеточных агрегатов перед переносом клеток в центрифужную пробирку.
4. Центрифуга диссоциированного клеток при 125-150 хг в течение 5 мин при 25 ° С, отбросить супернатант и повторно не приостанавливать осадок клеток в 5 мл полной KSFM до получения суспензии изолированных клеток.
5. Передача 1 мл взвешенное клеток в новую пробирку и добавляют 9 мл полной KSFM для распространения клеток в 1: 5 прохода разбавления для последующего экспериментального использования. Подсчитайте остальную часть клеток с помощью гемоцитометра для создания трубочек (см раздел 5.1).
   Примечание: Не культуры клеток RWPE-1 для более чем 10 пассажей так как после длительных периодов культуры они не образуют ацинусы с правильной архитектурой.
6. Изменение культуральной среды каждые 48 ч, чтобы обеспечить ЭФР и BPE остаются активными.
   Примечание: Включите эту среднюю для изменения каких-либо лечения, которые выходят за пределы 48 часов.

4. Культура и обработка клеточной линии ДГПЖ, ДГП-1

1. Культура BPH-1 клеток в среде RPMI 1640 с 5 дополнена% об / об FCS, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина. Подогретькультуральные среды, PBS и 0,25% вес / объем трипсин-0,53 М ЭДТА до 37 ° С перед использованием.
   Примечание: Клетки также можно культивировать в средах с 2,5% об / об FCS ^8.
2. Аспирируйте культуральной среды от сливающийся 10 см ² пластины BPH-1 клеток и промыть клетки 2 х 3 мл PBS , чтобы удалить все следы культуральной среды с сывороткой , которая может погасить реакцию трипсина.
3. Аспирируйте PBS и добавляют 3 мл раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клетки. Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ (с увлажнением) в течение 5 мин. Удалите раствор трипсин-ЭДТА, когда клетки имеют круглую форму, но остаются прикрепленными к блюду. Промыть клетки с 5 мл PBS.
4. После удаления PBS, добавляют 5 мл культуральной среды и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток. Передача клеток в 15 мл пробирку.
5. Принимать по 2 мл клеточной суспензии в новую пробирку центрифуги с 8 мл полной среды и пластины ДГПЖ 1 клеток ОНТоа 10 см ² культуральный планшет при 1: 5 канала разбавления для последующего экспериментального использования. Подсчитайте остальную часть клеток с помощью гемоцитометра для создания трубочек (см раздел 5.2).
   Примечание: Записывайте числа прохода, как более старые клетки BPH-1 не образуют ацинусы с правильной архитектурой. Отрывок номер более чем 10 не требуется.
6. Изменение культуральной среды каждые 72 часа.

5. 3D Культура простате ацинусов на коренных и Stiff RBM

1. Если клетки RWPE-1 используются для формирования трубочек, разбавленные 5000 клеток, полученных на стадии 3.5, в 300 мкл полной KSFM с добавлением 2% об / об раствора BM.
2. Если клетки BPH-1 используются для формирования трубочек, разбавленные 2500 клеток, полученных на стадии 4.5, в 300 мкл среды RPMI 1640 культуральной среде, дополненной 2% об / об раствора BM.
   Примечание: BPH-1 клетки больше, чем RWPE-1 клеток, так что более низкие числа ДГП-1 клеток, которые используются для получения аналогичного распределения ацинусов через 6 дней кульратура.
3. Аккуратно семян клеток на родной и AGE-напряглась RBM и аккуратно поместите культуры в инкубатор при 37 ° С и 5% CO ₂ (с увлажнением) , чтобы обеспечить равномерное распределение растущего ацинусов в скважине и что каждая клетка делится чтобы произвести один acina.
4. Через каждые 2 дня замены культуральной среды свежей культуральной среде, содержащей 2% раствор об / об BM, чтобы гарантировать, что клетки имеют факторы роста, необходимые для нормального acina гомеостаз.
5. Монитор ацинарными морфологии при выращивании культур с использованием микроскопии ¹³ светлого.
   Примечание: После 3-х дней в культуре отдельные клетки образуют кластер> 3 клеток и через 1 нед ацинусов предстательной железы с диаметром ~ будет наблюдаться 50 мкм.
6. Следуйте протоколу , описанному в разделе 2.3 для выполнения иммунофлюоресценции с использованием антител , специфичных для маркеров клеточной матрицы спаек, межклеточных спаек, апикально-базальной полярности и инвазивности ^13.
   1. С помощью монтажного средства массовой с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) или включать дополнительный шаг (после того, как 2.3.12) для окрашивания ядер клеток путем инкубирования с DAPI в течение 5 мин и промывки 2 х 5 мин с PBS +.

6. 3D культуры простаты опухолевой клетки Заполнители на родном и Stiff RBM

1. Культура РС3 клеток в среде RPMI 1640, содержащей 10% об / об FCS и 50 ед / мл пенициллина с 50 мкг / мл стрептомицина. Нагреть культуральной среды, PBS и 0,25% вес / объем трипсин-0,53 М ЭДТА раствор до 37 ° С перед использованием.
2. Аспирируйте культуральной среды от сливающийся 10 см ² чашки для культивирования клеток из PC3 и мыть клетки 2 раза с 3 мл PBS , чтобы удалить все следы FCS , которые могут погасить реакцию трипсина.
3. Аспирируйте PBS и добавляют 3 мл раствора трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть клетки и инкубируют в течение 1 мин.
4. Когда клетки становятся округлая, но остаются прикрепленными к чашке, тщательно аспирата раствор трипсин-ЭДТА и промывают 3 мл PBS доудалить все следы трипсина.
5. После удаления PBS, добавляют 5 мл культуральной среды и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток. Передача клеток в 15 мл пробирку.
6. Взять 1 мл суспензии клеток РС3 в новую центрифужную пробирку и добавляют 9 мл культуральной среды. Пластина клеток на 10 см ² чашки для культивирования (разведение 1:10) для последующего экспериментального использования. Количество оставшихся клеток с использованием гемоцитометра.
7. Развести 2500 PC3 клетки, полученные на стадии 6.6, в 300 мкл среды RPMI 1640 культуральной среде, дополненной 2% об / об раствора BM, чтобы обеспечить образование геля градиента в культуре.
8. Аккуратно семян клеток на родной и AGE-напряглась RBM и осторожно поместить культуру в инкубатор при 37 ° С и 5% CO ₂ (с увлажнением) , чтобы обеспечить равномерное распределение растущих сфероидов в скважине.
9. Изменение культуральной среды каждые 72 часа.
10. Для изучения влияния жесткой (AGE богатых) RBMпо миграции опухолевых клеток предстательной железы, клеток PC3 изображения с помощью видео светлого покадровой микроскопии с использованием / CO ₂ контроль температуры и увлажненной камере ^17.
    Примечание: PC3 клетки растут в пряди на родном RBM и не образуют ацинусы с просветом, но если оставить расти больше, чем 72 часа на родном RBM они будут формировать 3D сфероидов.
11. После сбора данных, вручную отслеживать PC3 клетки и вычислить их скорость миграции, форму (коэффициент удлинения) и сохранение миграции ^17-19.
    Примечание: Настойчивость = отношение D / T, D = расстояние от начала до конца траектории клеток, Т = общая длина траектории клеток.

Результаты

3D простаты ацинусов Выращенный на Stiff RBM

Через 6 дней в культуре, УИКи происходит от нормальной ткани простаты (RWPE-1) (рис 1А) и ДГПЖ ткань (BPH-1) (рис 1B) форма ацинусы на родном (PBS лечение) RBM, которые организованы в единые сфероидов эпителиального клетки. Эти ацинусы также имеют характеристики высокоорганизованных с УИКов апикальной к базальной полярности и видимое пространство полостной ^13,20.

Ацинусы , образованный УИКов , полученных из нормальной ткани простаты (RWPE-1) (рис 1А) и ДГПЖ ткань (BPH-1) (Фигура 1В) на застывшей (AGE богатых) RBM (обработанного GLA) имеют нарушенную архитектуру (сдвиг от сфероидальной до многоугольной формы и клеток выступающими / мигрирующие из ацинусов в AGE богатых УКР) (рис 1А). Эти ацинусы также характеризуются высокой неорганизованных УИКов, утративших апикальной к базальной полярности с небольшим или несуществующим полостной пространства ^13.

Рисунок 1:. Простаты эпителиальные клетки , выращенные как 3D железистыми ацинусами на родной и Stiff Водостойких базальной мембраны (УКР) (A) Светлое образы RWPE-1 клеток выращивали в течение 12 ч до 6 суток на RBM гелей , обработанных PBS (родной) или 50 мМ гликолевого в течение 14 ч (AGE богатых; жесткая); Шкала бар = 50 мкм. (В) с ДГПЖ-1 клеток, выращенных как описано в панели А; Шкала бар = 50 мкм; Данные представитель 3 независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/>
Таблица 1:. Характеристики простаты эпителиальные RWPE-1 ацинусов , выращенного на родной, Semi-Stiff и Stiff Водостойких базальной мембраны (УКР) RWPE-1 ацинусы выращивали на RBM предварительно обрабатывали PBS в течение 14 ч (родной), гликолевый альдегид (GLA ) в течение 6 ч (полу-жесткой) или GLA в течение 14 ч (жесткой). Для формы ацинозной, процент (%) ± стандартное отклонение (SD) круглых, полу-многоугольной и многоугольной ацинусы были вычислены из 5 независимых экспериментов (50 ацинусы количественно в состоянии). Относительный размер ацинарной рассчитывалась (родной RBM = 100%) из 3-х независимых экспериментов. Для инвазивности,% ± SD ацинусов с одним или несколькими выступающими клеток рассчитывали из 3 независимых экспериментов. Fold изменение рассчитывается путем деления среднего значения, полученного при полузакрытых жестких или жестких условиях с помощью соответствующего значения для нативных условиях. Значения P рассчитаны с использованием т-критерия Стьюдента (а = 0,05).

ontent "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> AGE зависит повышенная жесткость RBM способствует миграции опухолевых клеток PC3 предстательной железы

РС3 клетки , выращенные на родном RBM мигрировать путем поддержания непрерывного контакта клетка-клетка, в то время как РС3 клетки , выращенные на возрастное богатых (жесткой) RBM перемещаются независимо друг от друга (рис 2А). После 72 ч в PC3 культуре клеток образуют фокусы (сфероиды) на родном (PBS обрабатывали) RBM, в то время как PC3 клетки на жесткой (AGE богатых) RBM не из сфероидов и мигрировать независимо друг от друга (рис 2В). PC3 клетки на жесткой (AGE богатых) RBM являются более вытянутым , чем PC3 клетки , выращенные на родном RBM (рис 2C). PC3 клетки на жесткой RBM мигрируют быстрее , чем PC3 клетки , выращенные на родном RBM (рис 2D). PC3 клетки на жесткой RBM отображает снижение по сравнению с сохранением PC3 клеток , выращенных на родном RBM (рис 2E).

Рис . 2: опухоли простаты Миграция клеток на коренных и Stiff Водостойких базальной мембраны (УКР) (А) Светлое образы PC3 клеток , выращенных на RBM гелей , обработанных PBS (родной) или 50 мМ гликолевый альдегид в течение 14 ч (AGE богатых, жесткая) , Клетки визуализируют с помощью микроскопа (светлого 10X цель) и скорость получения 1 изображения в час в течение 12 ч с последующей ячейки отслеживания для создания траектории. Изображения, показанные соответствуют моменты времени после того, как 0, 3, 6, 9 и 12 ч. Траектории одиночных клеток показаны на момент времени 12 ч. Шкала бар = 100 мкм. (В) РС3 клетки , культивируемые на родном или ригидный RBM в течение 72 ч, и визуализации согласно описанному в панели (А). Шкала бар = 100 мкм. Деталь показывает выделенную область при увеличении 2X. (C) Среднее ± SD длина ячейки (мкм); существенная разница между родной RBM и жесткой RBM (р = 1,2 х 10 ^-23). ( (Е) Среднее ± SD сохранение клеточного движения (отношение D / T, где D = расстояние от начала до конца траектории клеток, Т = общая длина траектории клеток); существенная разница между родной RBM и жесткой RBM (р = 0,0007). Для панелей были проанализированы CE> 10 клеток, данные представителем 3 независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Протокол для генерации 3D - железистой ацинусов из MECs в чистых RBM гелей ⁶ был изменен в предыдущем исследовании , добавлением 4 мг / мл типа коллагена в матрице RBM. Добавление коллагена приводит к модулю упругости геля RBM возрастающей от 175 ± 37 до 1589 ± 380 Па. Это 9,1-кратное увеличение жесткости модулирует рост, выживание, миграцию и дифференцировку MECs ^21. Протокол был изменен снова, включив стадию обработки D - (-) - рибоза содействовать неферментативного сшивание типа I коллагена, который был добавлен к гелю RBM. Полученный в результате увеличение в 15 раз в жесткости было обнаружено , что сотрудничать с онкогенных трансформации MECs содействовать их инвазивного поведения ^22. Экспериментальный подход добавления типа коллагена УКР гелей облегчает прямое взаимодействие MECs с коллагеновых волокон, что происходит только в тканях человека после физического барьера между стромыи эпителий обеспечивается БМ подвергается протеолитической деградации. Создавая 3D железистой ацинусы из УИКов в чистых гелей RBM предварительно обработанных GLA, текущий протокол открывает путь к изучению , как BM жесткость сама по себе может вызвать их инвазивное поведение (рисунок 3). Уровни жесткости БМ, наведенные в этом протоколе имеют физиологическое значение. Инкубация с 50 мМ GLA в течение 6 ч и 14 ч соответственно увеличили модули упругости чистого RBM геля до 175 ± 90 и 322 ± 160 по сравнению с 122 ± 55 Паскалях в RBM гелей , обработанных PBS (таблица 1). Это увеличение от 1,7 до 3,2 раза в жесткости RBM резюмирует в 2,5- до 3,4-кратное увеличение жесткости наблюдается в злокачественную по сравнению с нормальной простаты или ДГПЖ ткани ^23-26. Как указано в недавней публикации ¹³ морфологических изменений , вызванных накоплением AGE и жесткости УКР в PEC ацинусов может быть определена количественно для статистически значимого сдвига от арСкругленные к многоугольной формы, снижение люминал / общая площадь ацинарными и торчащие клетки мигрируют из acina в AGE богатых RBM (рисунок 3). Иммуноблоттинга также могут быть использованы для оценки маркеров EMT (например , потеря Е-кадгерина ¹³⁾ , а также поведение сократительной (например , фосфорилируется легкой цепи миозина-2, pMLC2 ¹³⁾ в УИКов , выросших в нормальных по сравнению с жесткой RBM (рисунок 3). Дальнейшая оценка с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии может быть применен для визуализации BM (например , ламинин, коллаген IV и накопление AGE ^13), клеточный апикально-базальной полярности (например , апикальная локализация EEA1: ранний эндосом антиген 1 и GM130: 130 кД цис-Гольджи маркер ¹³⁾ и клеточные структуры молекул адгезии (например , локализация E-кадгерина в межклеточных соединений ¹³⁾ (рисунок 3).

Рис . 3: Обзор различных протоколов , представленные здесь Диаграмма показывает , как подготовить и тугим восстановленного базальной мембраны (УКР) с гликолевый альдегид (реакция Майяра), как семена клеток на жесткой RBM, как анализировать жесткий RBM ( степень реакции Майяра) и процедур, которые могут быть использованы для анализа клеточных и молекулярных изменений, вызванных возрастными богатых УКР. AGE, передовые гликирования; БМ, базальная мембрана; DAPI, 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол; EEA1, ранний эндосом антиген 1; GAPDH, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы; GLA, гликолевый альдегид; GEE, этиловый эфир глицина; GM130, 130 кДа цис-Гольджи маркер; п-MLC2 (Thr18 / Ser19), легкой цепи миозина-2 фосфорилируется на участках треонин 18 и серин 19; RBM, восстанавливали базальная мембрана; SDS-PAGE, додецилсульфата электрофорез в полиакриламидном геле натрия. Для RWPE1 ацинусы Scale бар = 10 мкм; для опухолевых клеток PC3сфероиды Шкала бар = 100 мкм. Эта цифра была изменена со ссылкой ^13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Действия по устранению неполадок будет необходимо, если D - (-) - рибоза выбран в качестве сшивающего агента для RBM. В ходе разработки протокола было установлено , что лечение с помощью 1 М D - (-) - рибозы в течение 72 ч, как описано выше для RBM / коллагеновых гелей ^22, приводит к обезвоживанию и усадки RBM гелей. Оценка более низких концентраций D - (-) - рибоза и более короткие времена обработки могут помочь преодолеть это ограничение.

Потенциальным ограничением в будущих приложениях протокола могут встречаться, где более высокие уровни жесткости RBM желательны. Если более длительное время инкубации и более высокие концентрации GLA используются для индукции более высокие уровни жесткости геля RBM это будет необходимо оценить , являются ли эти условия обработки оказывает влияние на выживаемость и пролиферацию клеток, как описано выше ^13. Следует также отметить, что инкубация клеток RWPE-1 с сывороткой индуцирует фенотипическую ЕМТ-подобный переход и подверженность воздействию сыворотки или сыворотки, содержащие материалы следует избегать. Например, если эксперименты предполагают трансфекцию коротких интерферирующих РНК (миРНК) олигонуклеотиды, процедура должна быть оптимизирована с использованием RWPE-1 клеток, выращенных в KSFM, не переключая клетки с низким содержанием сыворотки трансфекция сред. Этот недостаток может поставить под угрозу уровень молчанием генов достигается при использовании переходных миРНК подходов в модели. Для некоторых белковых мишеней было бы рекомендовать использовать индуцируемые векторы shRNA для перестраиваемой молчанием генов и желаемого снижения уровня белка. Адаптации , которые включают ферментативное сшивание с помощью стромальной клетки или опухолевой клетки , связанные лизилоксидазы (LOX) , ¹⁷ также могут быть включены в будущие модели.

jove_content "> Этот протокол будет способствовать дальнейшему изучению про-инвазивных механизмов, вызванных зависящих от возраста БМ жесткости в УИКов (RWPE-1, ВРН-1) и оценки анти-метастатических мишеней в инвазивные ПТК (PC3). Учитывая, что ДГПЖ считается нарушение обмена веществ ^27, этот протокол также открывает путь к нашему лучшему пониманию взаимосвязи между нарушениями обмена веществ и повышенным риском развития рака простаты. Принимая во внимание , что BM жесткость , индуцированное его воздействием АПЭ может быть триггером для инвазии в другой рак типа, это будет представлять интерес для использования протокола для создания аналогичных моделей , которые включают нормальные эпителиальные клетки и опухолевые клетки из других органов (например , молочной железы, толстой кишки, яичников, поджелудочной железы).

Критические шаги в рамках протокола, вместе с их тайминги, приведены на рисунке 4. На начальном этапе очень важно для поддержания исходного раствора RBM при 4 ° С , пока она оттаивает , чтобы предотвратить его Polymerization. наконечники пипеток не следует размещать в гм маточного раствора, пока они не были охлажденным до 4 ° С. Для следующего шага также важно обеспечить камерные слайды уравновешивали до 4 ° С, прежде чем они покрывают раствором RBM. Как только температура раствора RBM возрастает выше 4 ° С она будет подвергаться необратимой полимеризации с образованием геля. Это важно, чтобы RBM не нарушается во время стадии полимеризации, чтобы гарантировать, что она образует ровную поверхность, подходящей для культивирования клеток и микроскопического анализа. Продолжительность инкубации с ГЛК с или без ингибиторов реакции Майяра (цианоборгидрид натрия и amingoguanidine) определит, насколько жесткой гель RBM становится. Рекомендуется использовать 6 часов инкубации с ГЛК , если требуется полу-жесткие условия, и 14 ч инкубации , если жесткие условия необходимы (таблица 1). Альтернативные время инкубации или концентрации GLA могут быть использованы, если разных уровнейжесткости желательно. В этом случае реологического анализа гелей RBM должны быть включены в качестве важного шага. После стадии закалки реакции Майяра при инкубации с GEE и последующих стадий промывки с PBS, гели RBM можно использовать сразу или хранить при температуре 4 ° С в течение до 48 часов до их использования для культивирования клеток. После того, как клеточные культуры настроены, важно, чтобы изменить культуральную среду (включая все процедуры) каждые два дня. Рекомендуется поддерживать культуру 3D клеток в течение 3-12 дней в зависимости от параметров исследуемых. Для 3D PEC ацинусов рекомендуется анализировать культуру через 6 дней, а для 3D PTC СФЕРОИДОВ анализ рекомендуется после 3-х дней культивирования в первой инстанции.

Рис . 4: Простой Обзор протокола с критически важными шагами и таймингов указывало на Floж диаграмма показывает, как подготовить и застывают водостойких базальной мембраны (УКР) с гликолевый альдегид (реакция Майяра) с критическими шагами и тайминги указанных. Точки, где протокол может быть остановлен, и УОР гели хранятся, также указаны. RBM, восстанавливали базальная мембрана; GLA, гликолевый альдегид; GEE, этиловый эфир глицина; ON, в течение ночи; PBS, фосфатно-буферный солевой раствор; RT, комнатная температура. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
I - Материал для монослойной культуры
BPH-1	CaP Cell Line База данных	PCaCL-132	Контакт: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Полная кератиноцитарная сыворотка без среды	ThermoFisher Scientific	17005-075	Не греть при 37 ° или м; C перед применением
Сыворотка для телят плода	First Link UK Ltd	02-00-850	Магазин в -20 º C in aliquots
PC3	Американская коллекция типовых культур	CRL-1435
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFisher Scientific	15070-063
Фосфатный буферный физиологический раствор (Дульбекко А) таблетки	Оксоид	BR0014G
средой RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886	теплый в 37º C водяной баней перед применением
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsin-EDTA раствор	Sigma-Aldrich	T4049
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
II - Материал для 3D культуры
Ацетонитрил	Сигма-Олдрич	271004
Аминогуанидина гидрохлорид	Сигма-Олдрич	396494	Раздражающий глаза, дыхательную систему и кожу
Камерные слайды, 8-лунки	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Культуральная матрица восстановленная базальная мембрана (rBM) с пониженным содержанием фактора роста	АМС Биотехнология	3445-005-01	Складская базальная мембрана (БМ) при -80 °Ордм; С в аликвотах
Цианоген бромид	Sigma-Aldrich	C91492	Токсичен при контакте с кожей и вдыхании
Муравьиная кислота	Sigma-Aldrich	695076
Глицина этиловый эфир гидрохлорид (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Раздражает глаза
Димер гликолальдегида (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Цианоборогидрид натрия	Sigma-Aldrich	71435	Легковоспламеняющийся; Токсичен при контакте с кожей и вдыхании
Шприц-фильтр 0,22 мкм	Appleton Woods	BC680
Название<	>Company	Номер в каталоге	Комментарии
III - Материал для количественной оценки реакции Майяра
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	светочувствительный и хранить при -20 º C в аликвотах
Цилиндры для клонирования	Sigma-Aldrich	C1059
Козий антимышиный IgG (H+L) Alexa Fluor 488 конъюгат	ThemoFisher Scientific	A-11001	светочувствительный
козий антикролик IgG (H+L) Alexa Fluor 488 конъюгат	ThemoFisher Scientific	A-11034	светочувствительная
козья сыворотка	Abcam	ab7481	Хранить при -20 º C in aliquots
Vectashield монтажные носители	Vector Laboratories	H-1000
Мышиный антипентозидиновый клон PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Параформальдегид (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Хранить при -20 º С в аликвотах
Кролик античеловеческий коллаген IV поликлональное антитело	Acris Antibodies	R1041	хранить при -20 º C in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Хранить при -20 º C в аликвотах
Полиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Монолаурат сорбитана полиэтиленгликоля (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Кассета для диализа Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Name<	strong>Company	< strong>Каталожный номер	Комментарии
IV - Оборудование
ARG2 управляемый тензометр ротационный реометр	T.A. Инструменты
Axiovert S100 (20-кратное увеличение) микроскоп	Zeiss
CO2 контролируемая увлажненная инкубационная камера для микроскопа Zeiss Axio S100	Научный
конфокальный микроскоп Solent Axiovert 200M (40X, 63X увеличение)	Zeiss
Olympus LH50A оснащен цифровой камерой, использующей фазово-контрастный микроскоп.	Олимп
PHERAstar Plus планшетный ридер спектрофотометр	BMG Labtech
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
V - Программное обеспечение
Image J 1.47v	Национальный институт здравоохранения,
MetaXpress	Молекулярные