Макрофаги представляют собой пластиковые клетки гемопоэтической системы, которые играют решающую роль в защитном иммунитете и гомеостазе. В этом отчете мы описываем оптимизированные методы in vitro для фенотипической и функциональной характеристики трансплантируемых регуляторных макрофагов, которые накапливаются в трансплантированном органе в условиях толерогенности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Функциональная характеристика регуляторных макрофагов, которые ингибируют трансплантат-реактивную иммунитет
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Накопление макрофагов в трансплантированных органах уже давно признано признаком отторжения аллотрансплантата 1 . Иммуногенные моноциты проникают в аллотрансплантат рано после трансплантации, устанавливают реактивный ответ трансплантата против трансплантированного органа и инициируют отторжение органа. Недавние данные свидетельствуют о том, что подавляющие макрофаги облегчают успешную долгосрочную трансплантацию 3 и необходимы для индукции толерантности к трансплантации 4 . Это предполагает многомерную концепцию онтогенеза, активации и функции макрофагов, которая требует новой дорожной карты для изоляции и анализа функции макрофагов 5 . Из-за пластичности макрофагов необходимо предоставить методологию для выделения и характеристики макрофагов в зависимости от тканевой среды и определения их функций в соответствии с различными сценариями. Здесь мы descriБыть протоколом для иммунной характеристики привитых трансплантатом макрофагов и методов, которые мы использовали для функциональной оценки их способности ингибировать пролиферацию CD8 + T и стимулировать экспрессию CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .
Введение
В этом протоколе описаны методы in vitro для изучения функции тканепроникающих макрофагов, выделенных из аллотрансплантатов сердца, в соответствии с их способностью модулировать ответы Т-клеток. Широко описанные в литературе флуоресцентные клеточные следящие красители в сочетании с проточной цитометрией являются мощными инструментами для изучения супрессивной функции конкретных типов клеток in vitro и in vivo. Наш протокол следует методу карбоксифлуоресцеина сукцинимидина (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов in vitro .
Когда клетка с мечеными CFSE делит, ее потомство получает половину числа молек....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В этом исследовании мышей размещают в соответствии с руководящими принципами Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов и рекомендациями Руководства по обслуживанию и использованию лабораторных животных в Службе общественного здравоохранения. Все экспериментальные методы, связанные с использованием животных, проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институтом по уходу за животными и утилизации (IACUC) в Медицинской школе горы Синай.
1. Подготовка средств массовой информации
- Подготовьте полную среду RPMI 1640 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином (10000 U / мл) с использованием 2 мМ L-глутамина, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные результаты показывают стратегию стробирования, описанную в вышеуказанном протоколе. Результаты также показывают анализ активности пролиферации Т-клеток после совместной культуры с трансплантирующими макрофагами. Подавляющая способность in vitro подмножеств макрофагов была проанализирована на рисунке 4 . Результаты показывают, что Ly6C lo Ly6G - макрофаги, полученные от терпимых реципиентов, являются подавляющими. Результаты.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает методы, которые мы использовали для иммуноанализа трансплантат-проникающих миелоидных подмножеств на экспериментальной мышиной модели трансплантации сердца, которая также применима к другим тканям в разных экспериментальных моделях мыши. Сортировка ячейки низкого давления при 20 psi была предпочтительным методом для выделения хорошего выхода чистых подмножеств клеток. Поддержание чистоты каждого миелоидного подмножества имеет решающее значение для установления убедительных результатов подавляющей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы подтверждаем технический вклад проточной цитометрии, микрохирургии и биорезисторных / патологических центров исследовательского мастерства на горе Синай. Эта работа была поддержана COST Action BM1305: действия по фокусировке и ускорению клеточных толерогенных терапий (ФАКТТ), развивающие фонды Института трансплантации горы Синай Реканати / Миллер, министерство здравоохранения и инноваций SAF2013-48834-R и SAF2016-80031-R ДЖО
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-меркаптоэтанол | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-глутамин | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Эфирные аминокислоты | Corning | 25025039 | |
| 1 М буфер HEPES | Corning | 25060CL | |
| 100 мМ пируват натрия | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Пеницилин/стрептавидин | ThermoScientific | 15140122 | |
| коллагене А | Рош | 70381322 | |
| DPBS (без кальция и магний) | Corning | 21031CV | |
| 70 &микро; m Клеточный фильтр | Fisher | 22363548 | |
| ACK лизисный буфер | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Мышиный активатор Т-клеток CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-образная нижняя пластина | Corning | 353077 | |
| Антитела: | |||
| анти-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| анти-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| анти-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| анти-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| анти-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| анти-CD8-P/Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| проточный цитометр LSRII | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | Лаборатория Джексона | 008374 | |
| C57BL/6 | Лаборатория Джексона | 000664 | |
| Balb/c | Лаборатория Джексона | 000651 |
Ссылки
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocyte....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
