Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Краткое содержание

Человеческой сердечной ткани укрывает мультипотентных популяции клеток-предшественников периваскулярные, которые могут быть пригодны для регенерации миокарда. Техника , описанная здесь , позволяет одновременно выделения и очистки двух мультипотентных клеточных популяций стромы , связанных с носителями кровеносных сосудов, т.е. CD146 ⁺ CD34 ^- перицитов и CD34 ⁺ CD146 ^- адвентициальных клетки, из миокарда человека.

Аннотация

Мультипотентные мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК) были традиционно выделены, благодаря их пластическому адгезиям, из первичных тканевых переваров, в то время как их анатомическое тканевое расположение оставалось неясным. Недавнее открытие нашей группой и другими исследователями экспрессии маркеров периваскулярных клеток и маркеров МСК периваскулярными клетками в нескольких тканях дало возможность проспективно изолировать и очистить специфические гомогенные субпопуляции мультипотентных периваскулярных клеток-предшественников. Ранее мы продемонстрировали использование сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) для очистки микрососудистых CD146⁺CD34-перицитов и сосудистых CD34⁺CD146^- адвентициальных клеток из скелетных мышц человека. В данной работе мы описываем метод одновременной изоляции этих двух подмножеств периваскулярных клеток из миокарда человека с помощью FACS, основанный на экспрессии определенного набора маркеров клеточной поверхности для положительного и отрицательного отбора. Таким образом, этот метод делает доступными две специфические субпопуляции мультипотентных сердечных МСК-подобных клеток-предшественников для использования в фундаментальных исследованиях и/или терапевтических исследованиях.

Введение

Сердце уже давно считается постмитотическими орган. Однако недавние исследования показали наличие ограниченного оборота кардиомиоцитов у взрослых человеческих сердец ^1. Родные стволовые клетки / клетки - предшественники с кардиомиоцитов дифференцировке также были определены в миокарде у взрослых грызунов и человеческие сердца, в том числе Sca-1 ^+, C-Kit ^+, cardiosphere-формирующей, и совсем недавно, периваскулярные клетки - предшественники ^2,3. Эти клетки представляют привлекательными кандидатами для терапии , направленных на повышение сердечного восстановления / регенерации через трансплантации клеток или стимуляции пролиферации на месте.

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) были выделены из почти каждой ткани человека ^4,5 Клинические испытания терапевтических применений MSC были проведены для нескольких патологических состояний , таких как сердечно - сосудистые ремонта ^6, трансплантат против хозяина заболевания ⁷ , И цирроз печени ^8. Благоприятные эффекты были приписаны способности к MSCs: дома к местам воспаления ^9; дифференцироваться в различные типы клеток ^10; секретируют про-репаративных молекул ^11; и модулировать иммунные реакции хозяев ^12. Изоляция MSCs традиционно полагались на их преимущественной соблюдения пластиковых подложках. Тем не менее, в результате популяция клеток , как правило , заметно гетерогенным ^13. При использовании флуоресцентного активированной сортировки клеток (FACS) с комбинацией ключевых маркеров периваскулярных клеток, мы смогли выделить и очистить мультипотентных MSC-как население предшественника (CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / CD56 ^-) от несколько человеческих тканей , включая взрослых скелетных мышц и белого жира ^14.

Периваскулярные клеточные популяции в различных несердечных тканей было показано, что имеют свойства стволовых / прогениторных кювета системые исследуются для клинического применения в сердечно-сосудистой обстановке. Перициты, один из самых известных околососудистых подмножеств клеток, являются гетерогенной популяции , которые играют несколько ролей патофизиологические в том числе в разработке новых судов ^15, регулирование кровяного давления ^16, и поддержание целостности сосудов ^17,18. Как было показано во многих тканях, специфические подмножества перицитами изначально выразить MSC антигены и поддерживать их MSC-подобные фенотипы в первичной культуре после FACS очистки ^14. Кроме того, эти клетки стабильно сохраняют свои долгосрочные фенотипов внутри культуры и демонстрируют несколько клонов дифференциации потенциал, похожий на MSCs ^19,20. Эти результаты свидетельствуют о том, что перицитов являются одним из истоков неуловимого MSC ^14. Терапевтический потенциал перицитов было продемонстрировано с сокращением миокарда рубцевания и расширение функции сердца после трансплантации в ишемией ранениясердца ^21. В последнее время мы успешно очищают перицитов из миокарда человека и продемонстрировали свои МСЦ-как фенотипы и мультипотентность (липогенез, хондрогенезе и остеогенез) при отсутствии скелетной миогенезе ^3. Кроме того, инфаркты перицитов выставлены дифференциальные cardiomyogenic потенциал и развитие кровеносных сосудов потенциала по сравнению с аналогами, очищенных из других органов.

Вторая популяция мультипотентных периваскулярных стволовых клеток / клеток - предшественников, в адвентиции клетки, был выделен из подкожных вен человека на основе выражения ²² положительным CD34. Венозные адвентициальные клетки , как было показано , чтобы иметь потенциал, клоногенных мезодермального способность дифференциации и проангиогенные потенциал в пробирке. Трансплантация этих клеток в ишемией сердца травмированных мышей привело к уменьшению интерстициального фиброза, увеличение ангиогенеза и кровотока миокарда, снижение желудочковой разбавленнойвания, а также увеличение сердечного выброса фракция ^23. Интересно отметить , что жировая адвентициальные клетки было показано , что теряют экспрессию CD34 и CD146 выражение апрегулируются в культуре в ответ на лечение Ангиопоэтинподобный II, что предполагает принятие перицитов фенотипа при стимуляции ^24. В сердце, тем не менее, адвентиции популяция клеток еще не перспективно очищают FACS и / или хорошо охарактеризованы. Используя процедуры выделения клеток, описанных в следующих разделах, мы в настоящее время характеризующие инфаркты адвентициальных клетки и исследовать их потенциал для регенеративной приложений.

Здесь мы опишем способ выделения и очистки двух субпопуляций периваскулярными стволовых клеток / клеток-предшественников из эмбриона человека или взрослого миокарда. Этот метод выделения проспективное клеток позволит исследователям получить изогенных периваскулярные подмножества стволовых / прогениторных клеток из биопсий сердца человека для проведения сравнительных исследований и furtheR исследовать их терапевтический потенциал в различных сердечных патологических состояниях.

Протокол

1. Обработка человеческого кардиохирургии образца

1. Убедитесь, что все жидкости, контейнеры, инструменты, а также специализированный оперативной области являются стерильными.
2. Поместите образец ткани сердца (закупленные банка тканей или хирургической бригады) в запоминающей среде, состоящей из модифицированной среды охлажденной Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (P / S) на льду для перевозки ^3.
3. Удалить сердечный образец из запоминающей среды и промывают промывной среды, состоящей из фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением 2% FBS и 1% P / S. При обработке образца, используйте точная наклоненная пинцетом захватить крупные сосуды или перикард и свести к минимуму дробление миокарда.
4. Погрузите образец в моющей среде в чашке Петри и удалить перикарда, эндокарда и крупные кровеносные сосуды с стерилизованных ириса ножницами и остроконечного пинцета , как описано ^3.
5. Отрежьте оставшиеся myocardium на мелкие кусочки примерно 1 мм ³ с помощью одной стороне лезвия бритвы или пару острых ножниц радужной оболочки глаза. Примечание: Наиболее высокие выходы ячеек будут получены, если образцы обрабатываются немедленно. Если задержка неизбежна, хранение обработанной ткани сердца в свежей среде для хранения (> 5 мл на 1 см ³ ткани) при 4 ° С в течение 72 ч , возможно, однако , предположительно с соответствующим снижением выхода клеток.

2. Расщепление ткани и выделение клеток

1. Свежеиспеченный составляют переваривания раствор, содержащий 1,5 мл каждого из коллагеназы I, коллагеназы II и коллагеназы IV (все по 0,5 мг / мл в DMEM) и нагревают до 37 ° С в водяной бане.
   Примечание: Объем и концентрация коллагеназы пригодны для образцов приблизительно 1 см ^3.
2. Фильтр приостановленные кусочки ткани через сито 100 мкм и дважды промывают PBS. Передача части ткани в стерильный 30 мл контейнера сплотно закрытой крышкой.
   Примечание: Короткие широкие горшки, а не высокие узкие трубки дают лучшие результаты. В качестве альтернативы, положить кусочки ткани в стерильный 50 мл пробирку и помещают горизонтально, если 30 мл баллона под недоступен.
3. Добавьте все пищеварением растворы (4,5 мл всего) и поместите контейнер в герметичном полиэтиленовом пакете в ванне 37 ° C встряхивании воды, установленного до 120 оборотов в минуту. В качестве альтернативы, запечатать контейнер с парафиновой пленкой и поместить в нагретую орбитальном шейкере до 120 оборотов в минуту.
4. Через 15 минут снимите и переверните горшок три раза, прежде чем заменить в течение еще 15 мин. Удалить и гасят коллагеназы с 5 мл DMEM, дополненной 20% FBS и 1% P / S.
5. Растирают дайджеста осторожно пипеткой от десяти до двадцати раз с 10 мл серологической пипеткой, чтобы разбить комки любые ткани. Суспензию фильтруют последовательно через 100 мкм, 70 мкм и, наконец, 40 мкм клеточных сетчатые для удаления непереваренных материалов и получения суспензии отдельных клеток.
   Заметка:Не смывать между клеточными стяжек, чтобы избежать клетки debrisgenerated в процессе пищеварения фермента.
6. Центрифуга клеточной суспензии при 200g в течение 4 мин, осторожно декантируют супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл эритроцитов лизирующего буфера в течение 2 мин при комнатной температуре перед разбавлением 4 мл промывочной среды.
7. Повторите центрифугирования и повторно приостанавливать осадок в 1 мл промывочного раствора. Хорошо перемешать и принимать по 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток.
8. Смешать 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего красителя и помещают по 10 мкл смеси на стандартном гемоцитометра для подсчета клеток. Подсчитайте количество ярких, круглых клеток, присутствующих в четырех угловых квадратов (каждый разделен на шестнадцать маленьких квадратов) и разделить на 4, чтобы получить среднее значение за угла квадрата. Умножьте среднее значение на 2 для учета коэффициента разбавления пятно , а затем 10 ⁴ , чтобы получить общее количество клеток на 1 мл образца.

3. Cell Этикетировочное и сортировка

1. Добавляют 50 мкл мышиной сыворотки к суспензии клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 20 мин, чтобы блокировать связывание неспецифическое антитело.
2. Центрифуга клеточной суспензии с мышиной сывороткой при 200g в течение 4 мин, удаления надосадочной жидкости, и повторно приостанавливать в моющей среде при концентрации 1 × 10 ⁶ клеток на 100 мкл.
3. Аликвоты по 50 мкл каждой клеточной суспензии для изотипа и неокрашенных контролей в два полистирола с круглым дном проточной цитометрии трубки затем поместить оставшийся объем в третью пробирку для многоцветной окраски.
4. Добавить CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 и CD146-AF647 антитела (всего 1: 100) в одной клеточной суспензии для многоцветного окрашивания. Для контроля изотипа, добавьте эквивалентные объемы, APC PE-Cy7--, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- и AF647-сопряженными изотипных антител. Аккуратно пипетку, чтобы смешать антитела с клетками и инкубировать все пробирки при температуре 4 ° С в течение 20мин в темноте.
5. Готовят управления корректировкой бусинки, добавив одну каплю положительных бусинок к 100 мкл промывочного раствора в пяти полистирола с круглым дном и проточной цитометрии трубок. Добавить CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 и CD146-AF647 антитела (всего 1: 100) по отдельности к каждому из 5 трубок. Инкубируйте все пробирки при температуре 4 ° С в течение 20 мин в темноте.
6. Во время инкубации, готовят сбора клеток пробирки, каждая с 500 мкл роста эндотелия сосудов среднего-2 (EGM-2) культуральной среды и место при 4 ° С.
7. После инкубации антитела, добавляют 5 мл промывочной среды, чтобы промыть клетки и бусы с целью удаления несвязанного антитела. Центрифуга все пробирки при 200 мкг в течение 4 мин. Повторите для стирки и центрифугирования шаг. Осторожно сливают супернатант и пипетку осторожно при ресуспендирования клеток.
8. Ресуспендируйте в моющей среде в концентрации приблизительно 1 × 10 ⁶ клеток на 250 мкл. Повторное приостановить бисером в 100 мкл промывочного мedium.
9. Транспорт все клеточные и Шарик суспензии клеток к сортировщика на льду в темноте. Добавьте 1 каплю отрицательных бус положительных трубок контроля компенсации шарик и использовать их, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
10. Запуск неокрашенные клетки управления в соответствии с инструкциями изготовителя по созданию фоновой флуоресценции и установить напряжение к следующему: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400В; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480В; R780 / 60 460В. Запуск изотипы управления в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы установить фон флуоресценции пороги, связанные с неспецифическое связывание. Запуск многоцветной окрашенного образца и собирать перицитов и популяции адвентициальных клеток в приборке (рисунок 1).
    Примечание: Оптимальные выходы жизнеспособных клеток являются приблизительно 3% от общей диссоциации живых клеток для перицитов и 4% для адвентициальных клеток.

4. Культура клеток

1. Выберите подходящий размер культуры пластины в соответствии с итогами сортировкой FACS. Добавляют 100 мкл стерильного 0,2% раствора желатина на см ² площади роста и перемешивать вручную , чтобы покрыть всю скважины. Инкубируйте пластины при температуре 4 ° С в течение 10 мин и полностью удалить раствор желатина. Держите собранные клетки на льду во время приготовления культуры пластин.
   Примечание: отсортированный перицитов и адвентициальные клетки растут хорошо , когда высевали при плотности от 30000 до 40000 клеток / см ² на желатин покрытием поверхности культуры.
2. Центрифуга свежесобранных клеток при 200g в течение 4 мин и осторожно повторно приостанавливать осадок клеток в соответствующем количестве EGM-2.Seed клеток на покрытых желатином пластин.
   Примечание: Фактическое количество ячеек, которые будут посеяны на лунку, и количество EGM-2, которые будут добавлены в зависимости от выбора пластины. Например, 0,5 мл и 1 мл EGM-2 необходимы на лунку в течение 48- и 24-луночные планшеты, соответственно.
3. Обмен EGM-2 для средних периваскулярная роста клеток (DMEM, дополненной 20% FBS и 1% P / S) для обоих перицитов и адвентициальных клеток, как только клетки осели и приклеена к пластине (после того, как по меньшей мере 72 ч). Изменение средств массовой информации каждые 72 ч с тех пор. Проведение первоначального и всех последующих инкубацию в 5% СО ₂ и при 37 ° С.
4. Диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина ЭДТА при перицитов и адвентициальные клетки достигают от 80 до 90% слияния. Гасили 20% FBS в PBS, центрифугируют при 200g в течение 4 мин, повторно приостанавливать в околососудистой среде для роста клеток, а затем прохождение клеток при соотношении 1: 3 на непокрытых полистирол культуральных планшетах. От Пассаж 2 года и далее, прохождение клетки в соотношении 1: 5 (или приблизительно 7000 клеток / см ²⁾ без покрытия пластин полистирола культуры или колб.

Результаты

Отдельные клетки отличались от мусора и дублетов на основе распределений вперед и бокового рассеяния. Живые клетки были идентифицированы по их непринятие до красителя DAPI. Стратегия стробирования была выбрана на основе управления изотипическим маркировки этого живого, всего-сердечной диссоциации клеток (рисунок 1). Из живых клеток, CD45 ⁺ клетки сначала закрытого типа из, а затем CD56 ⁺ клеток. CD144 ⁺ эндотелиальные клетки затем удаляют...

Обсуждение

Растущие доказательства поддерживает ограниченную регенеративную способность взрослого сердца человека после травмы. Идентификация и характеристика нативных клеток-предшественников, ответственных за такие регенеративных реакций в травмированных сердцах имеют решающее значение как для понимания связанных с ними механизмов и путей передачи сигналов и разработка подходов для использования этих клеток в терапевтических целях.

Предыдущие протоколы описали выделение околососудистых подмножеств кле...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Восстанавливать порошок по мере необходимости и фильтровать стерилизовать
Коллагеназа II	Gibco	17101-015
Коллагеназа IV	Gibco	17104-019
античеловеческий CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Сохранять стерильность
античеловеческий CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Сохранить стерильным
античеловеческий CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Сохранить стерильным
античеловеческий CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Сохранить стерильным
античеловеческий CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Сохранить стерильным
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Для сбора клеток и культуры до прилипания
DMEM, высокого уровня глюкозы, GlutaMAX без пирувата натрия	ThermoFischer Scientific	10566-016
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFischer Scientific	10500-064	Заморозить в аликвотах и сохранить стерильным
Желатин	Sigma Aldrich	G1393	Разбавить стерильной водой
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Сохраняйте стерильность
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Сохраняйте стерильность
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Сохраняйте стерильность
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Сохраняйте стерильность
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Сохраняйте стерильным
Сыворотка мышей	Sigma Aldrich	M5905	Keep Стерильная
парафиновая пленка - Парапленка M	Sigma Aldrich	P7793
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15979-063	Замораживать в аликвотах и хранить стерильно
Фосфатный буфер с солевым раствором pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Хранить стерильный
буфер для лизинга эритроцитов Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Сохранять стерильным
Трипан Синий раствор	Sigma Aldrich	T8154
Трипсин-ЭДТА 0,5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Сортировщик флуоресцентных активированных клеток