Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Summary

Человеческой сердечной ткани укрывает мультипотентных популяции клеток-предшественников периваскулярные, которые могут быть пригодны для регенерации миокарда. Техника , описанная здесь , позволяет одновременно выделения и очистки двух мультипотентных клеточных популяций стромы , связанных с носителями кровеносных сосудов, т.е. CD146 ⁺ CD34 ^- перицитов и CD34 ⁺ CD146 ^- адвентициальных клетки, из миокарда человека.

Abstract

Мультипотентные мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК) были традиционно выделены, благодаря их пластическому адгезиям, из первичных тканевых переваров, в то время как их анатомическое тканевое расположение оставалось неясным. Недавнее открытие нашей группой и другими исследователями экспрессии маркеров периваскулярных клеток и маркеров МСК периваскулярными клетками в нескольких тканях дало возможность проспективно изолировать и очистить специфические гомогенные субпопуляции мультипотентных периваскулярных клеток-предшественников. Ранее мы продемонстрировали использование сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) для очистки микрососудистых CD146⁺CD34-перицитов и сосудистых CD34⁺CD146^- адвентициальных клеток из скелетных мышц человека. В данной работе мы описываем метод одновременной изоляции этих двух подмножеств периваскулярных клеток из миокарда человека с помощью FACS, основанный на экспрессии определенного набора маркеров клеточной поверхности для положительного и отрицательного отбора. Таким образом, этот метод делает доступными две специфические субпопуляции мультипотентных сердечных МСК-подобных клеток-предшественников для использования в фундаментальных исследованиях и/или терапевтических исследованиях.

Introduction

Сердце уже давно считается постмитотическими орган. Однако недавние исследования показали наличие ограниченного оборота кардиомиоцитов у взрослых человеческих сердец ^1. Родные стволовые клетки / клетки - предшественники с кардиомиоцитов дифференцировке также были определены в миокарде у взрослых грызунов и человеческие сердца, в том числе Sca-1 ^+, C-Kit ^+, cardiosphere-формирующей, и совсем недавно, периваскулярные клетки - предшественники ^2,3. Эти клетки представляют привлекательными кандидатами для терапии , направленных на повышение сердечного восстановления / регенерации через трансплантации клеток или стимуляции пролиф....

Protocol

1. Обработка человеческого кардиохирургии образца

1. Убедитесь, что все жидкости, контейнеры, инструменты, а также специализированный оперативной области являются стерильными.
2. Поместите образец ткани сердца (закупленные банка тканей или хирургической бригады) в запоминающей среде, состоящей из модифицированной среды охлажденной Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (P / S) на льду для перевозки ^3.
3. Удалить сердечный образец из запоминающей среды и промывают промывной среды, состоящей из фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением 2% FBS и 1% P / S. П....

Results

Отдельные клетки отличались от мусора и дублетов на основе распределений вперед и бокового рассеяния. Живые клетки были идентифицированы по их непринятие до красителя DAPI. Стратегия стробирования была выбрана на основе управления изотипическим маркировки этого живого, всего-сердечной диссоциации клеток (рисунок 1). Из живых клеток, CD45 ⁺ клетки сначала закрытого типа из, а затем CD56 ⁺ клеток. CD144 ⁺ эндотелиальные клетки затем удаляют.......

Discussion

Растущие доказательства поддерживает ограниченную регенеративную способность взрослого сердца человека после травмы. Идентификация и характеристика нативных клеток-предшественников, ответственных за такие регенеративных реакций в травмированных сердцах имеют решающее значение как для понимания связанных с ними механизмов и путей передачи сигналов и разработка подходов для использования этих клеток в терапевтических целях.

Предыдущие протоколы описали выделение околососудистых подмножеств кле.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit	Molecular Probes	A-10344
Collagenase I	Gibco	17100-017	Восстанавливать порошок по мере необходимости и фильтровать стерилизовать
Коллагеназа II	Gibco	17101-015
Коллагеназа IV	Gibco	17104-019
античеловеческий CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Сохранять стерильность
античеловеческий CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Сохранить стерильным
античеловеческий CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Сохранить стерильным
античеловеческий CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Сохранить стерильным
античеловеческий CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Сохранить стерильным
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Для сбора клеток и культуры до прилипания
DMEM, высокого уровня глюкозы, GlutaMAX без пирувата натрия	ThermoFischer Scientific	10566-016
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFischer Scientific	10500-064	Заморозить в аликвотах и сохранить стерильным
Желатин	Sigma Aldrich	G1393	Разбавить стерильной водой
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	Сохраняйте стерильность
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	Сохраняйте стерильность
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	Сохраняйте стерильность
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Сохраняйте стерильность
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Сохраняйте стерильным
Сыворотка мышей	Sigma Aldrich	M5905	Keep Стерильная
парафиновая пленка - Парапленка M	Sigma Aldrich	P7793
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15979-063	Замораживать в аликвотах и хранить стерильно
Фосфатный буфер с солевым раствором pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Хранить стерильный
буфер для лизинга эритроцитов Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	Сохранять стерильным
Трипан Синий раствор	Sigma Aldrich	T8154
Трипсин-ЭДТА 0,5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Сортировщик флуоресцентных активированных клеток