Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

14.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54256

⸱

20 сентября 2016 г.

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи мы описываем протокол для функционального изучения транскрипции и ингибирующей активности антибактериальных агентов, нацеленных на бактериальную транскрипцию.

Аннотация

В пробирке транскрипции анализы были разработаны и широко использовались в течение многих лет , чтобы изучить молекулярные механизмы , участвующие в транскрипции. Этот процесс требует множества субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы (РНКП) и ряд факторов транскрипции, которые действуют, чтобы модулировать активность РНКП во время экспрессии генов. Секвенирование гель-электрофорез радиоактивно меченных транскриптов используется, чтобы обеспечить подробную механистическую информацию о том, как Транскрипция происходит, и какие параметры могут повлиять на нее. В этой статье мы опишем протокол для изучения того, как существенный фактор элонгации Нуса регулирует транскрипционный приостановку, а также способ идентификации антибактериальный агент таргетирования инициации транскрипции путем ингибирования холофермента формирования РНКП. Эти методы могут быть использован в качестве платформы для разработки дополнительных подходов для изучения механизма действия факторов транскрипции, которые до сих пор остаются неясными, а также новые антибактериальные AgenТ.С. ориентации транскрипции, которая является объектом недоиспользованными наркотиков в исследования и разработки антибиотиков.

Введение

Транскрипция является процессом, в котором РНК синтезируется из определенной ДНК-матрицы. В эукариотических клетках имеются три различных РНКП: РНК-полимераза I расшифровывает предшественников рРНК, РНК-полимераза II отвечает за синтез мРНК и определенных малых ядерных РНК, и синтез 5S рРНК и тРНК осуществляется РНКП III. У бактерий существует только одна РНК-полимераза отвечает за транскрипцию всех классов РНК. Есть три стадии транскрипции: инициация, удлинение и прекращение. Транскрипция является одним из наиболее регулируемых процессов в клетке. Каждая стадия в цикле транскрипции представляет собой контрольную точку для регуляции экспрессии генов 1. Для инициирования, РНК - полимераза должен ассоциировать с коэффициентом сигмы с образованием Голоэнзим, которое требуется , чтобы направить фермента к определенным узлам , называемые промоторами 2 с образованием открытого промотора комплекса. Впоследствии, большой набор факторов транскрипции отвечают за регулирование Oдеятельность F РНКП во время удлинения и терминации фаз. Фактор транскрипции рассматриваемых здесь является высоко консервативным и существенным содержанием белка, Нуса. Он участвует в регуляции транскрипции Приостановка и прекращение, а также анти-терминацию в процессе синтеза рРНК 3-5.

В пробирке транскрипции анализы были разработаны в качестве мощных инструментов для изучения сложных регуляторных мер во время транскрипции 6. В общем случае, линейный фрагмент ДНК, в том числе области промотора необходим в качестве матрицы для транскрипции. ДНК-матрицы, как правило, генерируются с помощью ПЦР или путем линеаризации плазмиды. Затем добавляют Очищенные белки и НТП (в том числе один меченый NTP для обнаружения целей) и продукт анализировали после необходимого периода инкубации. С использованием соответствующих шаблонов и условий реакции, все этапы транскрипции были исследованы с помощью этого подхода, который позволил подробную молекулярную характеристику Transcription за последние полвека 7. В сочетании с информацией о 3-мерной структуре РНКП это также оказалось возможным исследовать молекулярный механизм ингибирования транскрипции антибиотиков и антибиотиков приводит, и использовать эту информацию при разработке новых, усовершенствованных лекарств 8-10.

В данной работе мы приводим примеры того, как транскрипционные анализы могут быть использованы для определения механизма регуляции транскрипции путем удлинения / фактора прекращения Нуса, а также как механизм действия нового ингибитора инициации транскрипции свинца может быть определена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Внимание: Эксперименты предполагают использование радиоактивного изотопа 32 P и никакой работы не следует проводить до тех пор , все надлежащие условия безопасности не были соблюдены. Как правило, персонал обязаны посещать курс по технике безопасности и пройти практику под наблюдением перед экспериментами с использованием радиоактивных реагентов. Пожалуйста, носите средства индивидуальной защиты (термолюминесцентный дозиметр, защитные очки, перчатки, радиационная номер халатах, полные штаны длины, закрытые носок обуви) при проведении реакции.

1. Получение пробирного материалов

  1. Получение требуемой Белки Транскрипция для анализа.
    1. Для эксперимента , описанного здесь, избыточно и очищают E. палочка РНК - полимераза в лаборатории , как описано 11, или получить из коммерческих источников (список материалов).
      Примечание: Оба обеспечивают аналогичные результаты. Другие способы очистки нативного или аффинная меченый РНКП также может быть использован 12,13. Sigma / Нуса факторы могут быть получены в виде dвневписанной в предыдущей работе 14,15.
  2. Получение диэтилпирокарбонат (DEPC) Очищенная вода
    Примечание: В качестве альтернативы, РНКазы вода может быть получена из коммерческих источников (список материалов).
    1. Добавляют 1 мл диэтилпирокарбонат (DEPC) до 1 л очищенной воды (0,1% об / об) и перемешивают в течение ночи.
    2. Автоклавы DEPC воды и советы дважды.
  3. ДНК шаблона Подготовка
    1. Очищают плазмиду pSG1154 16 и / или pIA226 17 с использованием набора для очистки плазмида (Материалы List) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Чтобы усилить шаблон для вымывания транскрипции анализов (фрагмент 360 п.н. , охватывающий XYL участок промотора P), собрать реакцию ПЦР на льду в том числе 25 мкл 2x ПЦР смеси (Материалы List), 2 мкл каждого из праймеров (5 мкМ) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(вперед) и 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (обратный), 1 мкл pSG1154 плазмида прeparation (250 мкМ) и 20 мкл очищенной водой).
      1. Или в качестве альтернативы, для одного раунда анализов транскрипции, амплификации фрагмента 447 н.п. , охватывающую на λ P R промотор из pIA226 17. Настройка реакции ПЦР на льду с использованием 25 мкл ПЦР-смеси 2x, 2 мкл каждого из праймеров (5 мкМ): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(вперед) и 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (обратный), 1 мкл pIA226 17 плазмида препарат (250 мкМ) и 20 мкл очищенной водой).
        Примечание: Этот шаблон не хватает цитозин до позиции +26 нт, который является 26 - й нуклеотид от сайта инициации транскрипции. Таким образом, транскрипция с помощью этого шаблона позволит инициацию, зазор промотор и сваливания на + 26 нт с образованием комплекса элонгации стабильной транскрипции (EC), когда только АТФ, УТФ и ГТФ присутствуют в реакции.
    3. Настройка реакции ПЦР со следующими условиями: 95 °С в течение 30 сек, 50 ° C в течение 30 сек, 72 ° C в течение 30 сек, повторяющейся в течение 30 циклов.
    4. Очищают продукт, используя очистке набора ПЦР (список материалов) в соответствии с инструкциями изготовителя и элюции в 100 мкл буфера транскрипции для анализа транскрипции.
    5. Определить концентрацию ДНК-матрицы с использованием fluorospectrometer (список материалов).
  4. NTP Подготовка
    Примечание: НПТ могут быть получены из различных коммерческих источников (список материалов).
    1. Растворите НПТ (≥99% чистоты) в DEPC-обработанной воды, чтобы сделать 1 М запас, аликвоты 1 мл раствора в 1,5 мл пробирки (50 мкл в каждую пробирку) и хранят при -20 ° C.
    2. Порядок α- 32 Р UTP (3000 Ки / ммоль) до эксперимента. 32 Р имеет короткий период полураспада 14.29 дней.
      Примечание: С помощью альфа-меченого UTP избегает сравнения интенсивности полос с различной длиной.
  5. РНК Ladder Подготовка
    1. Собрать последующиеИНГ реакции при комнатной температуре: 0,5 мкг РНК шаблон Mix (Список материалов), 80 мМ HEPES буфера рН 7,5, 12 мМ MgCl 2, 10 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 2 мМ АТФ / CTP / GTP, 0,5 мМ UTP, 2 мкл альфа- 32 P UTP, 0,5 мкл Т7 РНКП (материалы List), DEPC обработанной воды до 20 мкл.
    2. Разрешить реакции протекать при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Используйте сразу или хранить при -80 ° С.

2. Получение РНК Секвенирование Gel

  1. Гель Приготовление
    1. Очистите пластины от устройства секвенирования гель (список материалов) в два раза с 70% этанола и очищенной воды, и собирают клетки с гребнем и двумя прокладками.
      Примечание: Одна пластина может быть покрыта силицирования реагентом (список материалов) для облегчения удаления геля на шаге 4.2.
    2. Растворить 33,6 г мочевины в 22 мл воды и 16,4 мл 5х Трис / борат / ЭДТА (КЭ) буфер (54 г трис (гидроксиметил); 27,5 г борной кислоты, 10 мл 1 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 7,4 в 1 л воды) с использованием магнитной мешалки.
    3. Добавить 16 мл 40% акриламида / бис-акриламида раствора (19: 1) с раствором мочевины и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
    4. Добавить 514 мкл 10% (вес / объем) Свежеприготовленный персульфата аммония в воде с последующим 51,4 ​​мкл N, N, N ', N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) для отфильтрованного раствора.
    5. Аккуратно инвертировать раствора геля, чтобы избежать чрезмерного аэрации и ввести немедленно и плавно переходит в горизонтально расположенной расфасована секвенирования ячейки от нижнего отверстия впрыска. Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей во время инъекции.
    6. Разрешить 1-1.5 ч до тех пор, пока гель не полностью установлен перед использованием в анализе транскрипции. Гель можно хранить при комнатной температуре в течение двух или трех дней, когда обматывают смоченного водой ткани на верхней части секвенирования клетки.

3. Транскрипция реакции

  1. Транскрипция Удлинение Приостановка Анализ
    1. Формирование элонгации транскрипции комплекса
      1. Добавить 1 мкл основного фермента РНКП (1 мкМ складе в транскрипции буфере) в 1,5 мл трубки.
      2. Добавить 1 мкл очищенного сигма-70 фактора (a 70, 3 мкМ запас в транскрипции буфере) к РНК - полимеразы и инкубировать на льду в течение 10 мин , с образованием РНК - полимераза холофермента.
      3. Добавить 3 мкл 500 нМ очищено матрицы ДНК (А , P R промотор из продукта pIA226 ПЦР) в транскрипции буфере с РНКП голоэнзима и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин , чтобы сформировать открытый комплекс.
      4. Приготовить смесь из компонентов реакции в другую 1,5 мл пробирку с использованием 5 мкл 10х транскрипции буфера (Материалы Список: 400 мМ Трис-HCl, 1,6 М KCl, 100 мМ MgCl 2, 10 мМ ДТТ, 50% глицерин, рН 7,9 в DEPC обработанной воды), 2 мкл 250 мкМ каждого GTP и UTP, 1 мкл 1 мМ АТФ и 1 мкл альфа- 32 Р UTP (3000 Ки / ммоль). Добавить DEPC очищенную воду до 41 мкл.
        НетТЕ: ингибитор РНКазы (Список материалы) могут быть использованы для минимизации загрязнения РНКазы.
      5. Переносят раствор смеси в пробирку, содержащую комплекс с открытым и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы сформировать транскрипция удлинение комплекс остановлен при + 26 нт.
      6. Перемещение реакционную смесь до комнатной температуры (~ 21 ° C) и добавить 1 мкл 2,5 мг / мл рифампицина до конечной концентрации 50 мкг / мл.
      7. Добавляют 1 мкл 0,1 мМ очищенного Nusa к реакционной смеси и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
      8. Добавляют 2 мкл 250 мкМ CTP в реакционную смесь, чтобы сделать окончательный объем 50 мкл и измеряют время реакции с помощью таймера.
      9. Передача 5 мкл реакционного раствора в 2 мкл РНК гель загрузочного буфера (95% формамида, 0,05% бромфенол синий и 0,05% cyanol ксилола) в 30, 60, 120, 240, 480 и 1200 сек, чтобы погасить реакцию.
      10. Утилизировать советы 32 P UTP и трубы в продолжение радиоактивных отходовainer.
  2. Анализ инициации транскрипции
    1. Формирование открытого комплекса
      1. Развести очищенную σ 70 до 0,5 мкм.
      2. Повторите шаги 3.1.1.1 к 3.1.1.3 , используя 0,5 мкм (вместо 3 мкМ) очищенное σ 70 и ДНК - матрицы (Р XYL промоторную область от продукта pSG1154 ПЦР).
    2. Ингибирование инициации транскрипции анализа
      1. Добавьте ингибитор , предназначенный для предотвращения образования РНКП Голоэнзим к основным ферментом РНКП перед добавлением сг 70 (после стадии 3.1.1.1), а затем шаги 3.1.1.2 и 3.1.1.3 изучить , способен ли нарушить Голоэнзим образование ингибитора.
      2. В качестве альтернативы, после этапа 3.1.1.2, добавьте ингибитор рассмотреть , является ли он в состоянии конкурентно ингибируют σ 70 связывания РНК - полимеразы.
      3. Используйте такое же количество ДМСО, растворитель ингибитора, вместо ингибитора STock в контрольных реакций.
    3. По завершении реакции
      1. Растворите гепарин в воде до концентрации акций 1 мг / мл и при наличии -20 ° C.
        Примечание: Гепарин является конкурентом ДНК, которая может изолируют РНКП, который не образуется открытый комплекс. После того, как открыт комплекс образуется, гепарин не может войти на сайт связывания ДНК РНК-полимеразы и ингибируют транскрипцию из предварительно сформированного открытого комплекса. Поэтому, гепарин требуется только для однообходных анализов; это не требуется для нескольких круглых анализов.
      2. Готовят реакционную смесь , используя 5 мкл 10х буфера транскрипции (материалы список), 1 мкл 1 мг / мл гепарина раствор, 1 мкл 10 мМ каждого АТФ, ГТФ, и CTP, 2,5 мМ UTP, и 1 мкл 32 альфа- Р УТФ (3000 Ки / ммоль). Добавить DEPC очищенную воду до 45 мкл.
      3. Смешайте реакционную смесь с транскрипцией открытой сложной, импульсная спина и инкубировать при 37 ° С в течение 20 мин.
      4. Перенесите 10 мкл реакционной смеси, таклюция в 5 мкл РНК гель загрузочного буфера (95% формамида, 0,05% бромфенол синий и 0,05% cyanol ксилол) для гашения реакции.

4. РНК гель Запуск и развитие

  1. Запуск денатурирующих полиакриламидном геле
    1. Прогоните гель при 50 ° С и 50 Вт в буфере 1x КЭ в течение примерно 1,5 ч, пока температура геля и буфер стабилен при 50 ° С.
    2. Образцы тепла при 90 ° С в течение 30 сек и перемещать их на льду до загрузки на гель.
    3. Загружают образцы в лунки на верхней части геля вместе с одной полосой, содержащей 2 мкл РНК лестницу (разведение 1: 100).
    4. Выполнить гель при 50 Вт и 50 ° С в буфере 1x КЭ до бромфенол синий краситель не достигнет ~ 2/3 вниз геля.
  2. Гель Лечение
    1. Открыть медленно и осторожно отделить верхнюю пластину из секвенирования клетки. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать нарушения геля.
    2. Вырезать chromatograpгип бумага (Список материалов), чтобы соответствовать размеру геля от верхней части к бромофенолового синего красителя. Используйте счетчик Гейгера, чтобы подтвердить примерное положение радиоактивно меченых РНК-транскриптов.
    3. Осторожно закрывают гель с фильтровальной бумагой, и нажмите твердо, пока гель прилипает к фильтровальной бумаге. Отрезанные и отбрасывать дна геля для радиоактивных отходов в качестве неинкорпорированного НПТБ работать в нижней части геля, который может быть очень жарко.
    4. Поместите одинакового размера кусок фильтровальной бумаги на сушильном слое с вакуумной сушильной машины, и аккуратно закладывают бумагу гель покрытием на нее с гелевой стороной вверх.
    5. Накройте гель с полиэтиленовой пленкой и высушивают при 60 ° С в течение 1,5 ч.
    6. Оберните другую сторону геля покрытием фильтровальной бумаги с полиэтиленовой пленкой и поместите на photostimulable люминофора пластины в случае формирования изображения, с соответствующим временем экспозиции, которая может варьироваться от 1 часа до ночи в зависимости от эффективности реакции.
    7. Изображение люминофор пластины с помощьюсканер Imager в соответствии с инструкциями изготовителя. Определить относительную интенсивность полосы с использованием программного обеспечения ImageJ в соответствии с инструкцией программного обеспечения.
    8. Используйте счетчик Гейгера, чтобы проверить радиоактивного загрязнения в рабочей зоне, протереть подозрительные предметы и область с тканью и чистящим средством и утилизировать ткани в контейнер для утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

эффективность транскрипции может быть определено путем измерения уровня излучения в полосах в различные моменты времени. Паузу для анализа , чтобы проверить функцию Нуса фактора позволило визуализировать паузы, прекращения и стекания продуктов (Рис . 1А) В присутствии N-концевого домена Нуса (Нуса НТД; аминокислотные остатки 1-137), появление РНК продуктов значительно задерживается по сравнению с контрольным экспериментом не хватает Нуса. Удаление аминок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во всех организмах, транскрипция является жестко регулируется процесс. В пробирке транскрипции анализы были разработаны , чтобы обеспечить платформу для тестирования эффектов транскрипционных факторов, малых молекул и ингибиторов транскрипции. В этом методе бумаги, анализ методом для общей бактериальной транскрипции была описана. Транскрипция анализы в сочетании с гель-электрофореза для секвенирования транскриптов очень важны для механистических исследований, поскольку они позволяют визуализацию всех транскрипц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа является признанием гранта факультета для ранней карьеры от Университета Ньюкасла (CM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Получить белки, необходимые для транскрипционного анализа
E. coli RNAPEpicentreS90250
Препарат обработанного DEPC водного
диэтилпирокарбоната (DEPC) Сигма-Олдрич D5758
Вода, не содержащая РНКазы 
Ambion Nuclease-Free WaterThermoFisherAM9937
Подготовка
Wizard  Plus SV Minipreps Система очистки ДНКPromegaA1330
ACCUZYME Mix BiolineBIO-25028
ПЦР праймеры
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281
NanoDrop 3300 ФлуороспектрометрThermo ScientificND-3300
NTP препарат
ATPSigma-Aldrich A6559
UTPSigma-Aldrich U1006
ГТПСигма-ОлдричG3776
CTPСигма-Олдрич C9274
Высокочистые rNTPGE Healthcare27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer   BLU007C001MC
Подготовка лестницы для радиоактивных соединений РНК 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
Хлорид натрияSigma-Aldrich S7653
Хлорид магнияSigma-Aldrich M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
Гелевый препарат
Sequi-Gen GT для секвенирования нуклеиновых кислот Био-Рад   165-3804
Сигмакот   Сигма-Олдрич Карбамид SL2
   Сигма-Олдрич U6504
трис(гидроксиметил)аминометан   Сигма-Олдрич 
борной кислоты Сигма-Олдрич B7901
этилендиаминтетрауксусная кислота Сигма-Олдрич ED
40% Акриламид/бис-акриламид Сигма-Олдрич А9926
персульфат аммония Сигма-Олдрич A3678
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
Транскрипционный анализ
хлорида калияSigma-Aldrich P9541
глицерин   Сигма-Олдрич G5516
рифампицин  Сигма-Олдрич R3501
формамид   Сигма-Олдрич F9037
бромфенол синий Сигма-Олдрич B0126
ксилолцианол Сигма-Олдрич X4126
гепарин Сигма-Олдрич 84020
Ингибитор рибонуклеазы РНКазинаPromegaN2511
Буфер для транскрипции 
БазаTris Sigma-Aldrich T1503
Хлорид калияSigma-Aldrich P9541
Хлорид магнияSigma-Aldrich M2393
DTT   Сигма-Олдрич DTT-RO
глицерин   Сигма-Олдрич G5516
Фильтровальная бумага
Whatman  3MM Chr Хроматографическая бумагаFisher Scientific05-714-5
Радиоактивное обеззараживание
Decon 90decondecon90
Гель для обработки
Typhoon Trio+ ImagerGE Здравоохранение Медико-биологические науки63-0055-89
ДНК-матрицы154563

Ссылки

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Комплекс элонгации транскрипцииголофермент РНК-полимеразытранскрипционный фактор NusAгель-электрофорез с секвенированиеманализ пауз транскрипцииметод ингибирования транскрипциирадиоактивное детектирование РНКанализ транскрипционных факторовскрининг антибактериальных средств
In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.