Быстрый и упрощенный метод высокой пропускной положить Выделение микроРНК из высокоочищенной липопротеинов высокой плотности

МикроРНК являются эндогенными некодирующими крошечными видами РНК, которые высоко консервативны и считаются ключевыми игроками в регуляции различных биологических процессов путем деградации или подавления специфических целевых матричных РНК¹. Поскольку микроРНК действуют внутриклеточно, они были исследованы как биомаркеры тканевого происхождения, что привело к открытию тканеспецифичных функций этих микроРНК. Тем не менее, микроРНК также обнаруживаются внеклеточно, либо в белках, либо в экзосомах/микровезикулах, которые могут эффективно защищать их от деградации внеклеточными РНКазами². Более поздние исследования показали, что защитный эффект ЛПВП может быть тесно связан не с его способностью способствовать оттоку холестерина, а скорее с его нехолестериновым грузом, в частности, в качестве носителя циркулирующих микроРНК ^{3, 4}. Эти микроРНК могут не только модулировать липидный обмен, но также связаны с противовоспалительными, антиоксидантными и антитромботическими эффектами комплекса ЛПВП-микроРНК ^{5, 6}.

Для дальнейшего изучения роли микроРНК, переносимых в частицах ЛПВП, необходимо разработать простой и понятный протокол для экстракции микроРНК из выделенных высокоочищенных ЛПВП для использования в клинической практике. Было описано множество методов выделения ЛПВП. Эти методы либо очень трудоемки, либо требуют большого объема плазмы, что может потребовать объединения образцов, обширного диализа для обессоливания выделенных липопротеидов и они не полностью удаляют экзосомы как источник микроРНК соответственно. В этой статье мы опишем простой и быстрый метод, который позволяет выделить микроРНК из высокоочищенных ЛПВП, используя небольшой объем образцов крови в больших масштабах. Мы считаем, что этот метод может служить хорошим ориентиром для продвижения исследований роли циркулирующих микроРНК и, в частности, роли ЛПВП в облегчении коммуникации между различными клетками и органами.

1. Сбор проб крови

1. Сбор натощак периферической венозной пробы крови в 10 мл пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (который имеет несколько преимуществ по сравнению с другими антикоагулянтами) стандартными венепункции видного вены в локтевую ямку.
2. Центрифуга образцов крови при 1600 х г в течение 20 мин при 4 ° С в настольной центрифуге, чтобы получить свободный от красных кровяных клеток и небольших количеств РНК плазмы.
3. Последовательная центрифугировать супернатант при 3000 г (4 ° C) в качающемся роторе в течение 10 мин, чтобы удалить WBC & тромбоциты и затем еще 15 мин, чтобы удалить остатки клеточных остатков соответственно.
4. Измерение плотности плазмы с помощью денситометра при КТ в соответствии с инструкциями изготовления.
   Примечание: Регулировка плотности (d = 1,023 г / мл) с 0,9% солевом растворе может потребоваться после удаления экзосомы, но до градиента плотности ультрацентрифугирования.
2. экзосома Удаление из плазмы
1. Удалите циркулирующие экзосомы , которые имеют плотность , аналогичную HDL и представляют собой количественно важный источник микроРНК ^3.
   1. Это можно сделать, добавив 252 мкл раствора осаждения экзосом до 1 мл плазмы с последующей инкубацией в течение 30 мин при 4 ° C. Чтобы осадить вне экзосомы, центрифугировать смесь в течение 30 мин при 1500 г при температуре 4 ° С.
   2. Для выделения HDL, перенос 1 мл полученного супернатанта к поликарбонатным толстостенные ультрацентрифуге трубки для дальнейшей обработки с градиентом плотности ультрацентрифугирования (см ниже).

3. Плотность Градиент Ультрацентрифугирование (Рисунок 1).

1. Для того, чтобы отделить HDL использовать 3-х шаговый использующую пол ультрацентрифуге с фиксированным углом ротора работает на 448,811 х G и 8 ° C, соответственно.
2. Подготовьте три различных решения плотности последовательно и годной для каждой изоляции.
   1. Приготовьте раствор A (выделение ЛПОНП, d = 1,006 г / мл) путем растворения 11,4 г NaCl (NaCl: 0,195 моль), 0,1 г EDTA2Na и 1 мл 1 N NaOH в 1000 мл автоклавного дистиллированной воды. Затем добавляют еще 3 мл автоклавного дистиллированной воды.
   2. Приготовьте раствор B (выделение LDL, D = 1,182 г / мл), добавляя 25,2 г NaBr на 100 мл раствора A (NaCl 0,195 моль, NaBr, 2,44 моль).
   3. Готовят раствор С (выделение ЛВП, d = 1,470 г / мл) путем смешивания 78,8 г NaBr с помощью 100 мл раствора А (NaCl, 0,195 моль, NaBr, 7,7 моль). Подтвердите соответствующую плотность при комнатной температуре, используя денситометр. Держите все решения при 4 ° С до дальнейшего использования.

4. Выделение ЛПОНП

1. Смешайте 1 мл плазмы (средняя плотность = 1023 г / мл) и нуклеазные бесплатно 200 мкл жира Red 7В в 6,5 мл из поликарбоната толстостенной ультрацентрифуге трубки.
2. Затем осторожно слой 5 мл раствора А на верхней части смеси. При необходимости, добавить дополнительный жир Red 7В на вершине раствора A TO уравновесить вес каждой трубки. Центрифуга в течение 2 ч (ускорение - 5), (замедления - 7).
   Примечание: Во время центрифугирования, липопротеиды накапливаются как группа в своих регионах равновесной плотности.
3. В конце прогона наблюдать 2 слоя. Удалить 1,5 мл фракции липопротеинов очень низкой плотности, представляющего верхний слой и хранят при температуре 4 ° С.
4. И, наконец, с помощью передачи пипетки 4 мл из нижней части трубы, содержащей ЛПНП, ЛПВП, альбумин и фракции жирных кислот в новый поликарбонатной трубки для изоляции ЛНП.

5. Выделение LDL

1. Смешайте 2 мл раствора В и 100 мкл нуклеазы свободного жира Красный 7Б в пробирку, содержащую LDL и HDL фракции (раздел 4), соответственно.
2. Затем центрифуге в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 1,5 мл ЛНП фракции, представляющей верхний слой и держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° С. И, наконец, передача 4 мл из нижней части трубы, содержащей HDLФракцию к новому поликарбонатной трубки.

6. Выделение HDL

1. Смешайте 2 мл раствора С, 100 мкл нуклеазы свободного жира Red 7В и 15 мкл 98% бета-меркаптоэтанол в пробирку, содержащую фракцию HDL, соответственно.
2. Центрифуга в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 2 мл HDL фракции, представляющие верхний слой и либо держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° C.

7. обессоливания и концентрации липопротеина фракций

1. Для того, чтобы избежать помех с последующим электрофорезом в агарозном геле и ПЦР, удалите избыток соли, добавляемой при градиенте плотности ультрацентрифугирования с использованием центробежных фильтров устройств с соответствующей молекулярной массой обрезания (3K трубки для ЛОНП и 10K трубки для LDL / HDL), как описано в инструкции изготовителя.
   1. Если коротко, то после добавления 2,5 мл PBS, холодный (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4; рН 7,4) centrifuGE вся ЛПОНП фракция, собранная-во градиенте плотности ультрацентрифугирования при температуре 4 ° С в течение 60 мин с использованием качающийся роторе.
   2. Обессоливания фракции LDL в два раза с 10 мл охлажденного льдом PBS в течение 30 минут каждый. Затем, с помощью 13 мл охлажденного льдом PBS дважды для обессоливания HDL фракции. Чем выше объем PBS необходимо улучшить подвижность с электрофореза в агарозном геле. После центрифугирования, удаления липопротеинов, содержащих растворенные вещества и держать при температуре 4 ° C или хранили при -80 ° C.

8. Электрофорез в агарозном геле

1. Липопротеинов Выполнение проектно электрофореза в агарозном геле, использующую набор с незначительными модификациями инструкциями изготовителя следующим образом.
   Примечание: Этот шаг только для оценки качества и чистоты концентрированных образцов липопротеинов.
   1. Если коротко, то получим 6 мкл обессоленной фракции липопротеинов с градиентом плотности ультрацентрифугирования и загружают на липопротеина гель Сборный. Использование человеческого lipopСтандарты rotein для VLDL, LDL и HDL в качестве эталона размера. Проводят электрофорез при комнатной температуре при 100 V в течение 60 мин с использованием буфера Rep Prep.
   2. Сушат гель в течение 10 мин, а затем окрашивают в течение 10 мин при комнатной температуре с жиром Red 7В. Destain геля в смеси метанол-вода 75:25 (об / об) и сухой снова в течение 5 мин.

9. Экстракция РНК и очистка

1. Выполнение проектно изоляции микроРНК очищенным человеческим ЛВП с использованием набора сыворотка / плазма микроРНК выделения и очистки.
   1. Если коротко, то добавляют 1 мл реагента для лизиса РНК в 200 мкл очищенного HDL, смешать с вихревом смесителе и затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов и инактивации РНКазы.
   2. Затем шип 3,5 мкл синтетического Caenorhabditis Элеганс микроРНК (Cel-MIR-39; 1,6 × 10 ⁸ копий / мкл) в смеси. Затем проводят экстракцию РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выполните purificatiна извлеченной-микроРНК с Элюции спиновых столбцов в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте концентрацию микроРНК из очищенного HDL с spectrophorometer.
   Примечание: Вымывание микроРНК из спиновых колонн использовали 16 мкл РНКазы свободной воды.

10. с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

1. Изолировать 100 нг микроРНК из HDL подсыпали синтетическим микроРНК (CEL-микроРНК-39) и обратной транскрипции в объеме реакционной смеси 20 мкл с использованием набора для обратной транскрипции и в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Выполните соответствующие элементы управления без шаблона микроРНК (NTC) и без обратной смеси транскриптазы (НЗТ).

11. ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)

1. Выполнение проектно-изыскательских ПЦР в реальном времени в общем объеме 20 мкл с 2 мкл 1: 2 разведения кДНК, 10 мкл ПЦР-смеси, 2 мкл универсальной грунтовки, 2 мкл микроРНК праймеров и 4 мкл РНКазы воды.
2. Запуск Reactiна в 96-луночные планшеты при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 45 циклов при 94 ° С в течение 15 с и 55 ° С в течение 30 с и фазу удлинения при 70 ° С в течение 30 s.ec Выполнение проектно всех реакций при трехкратном повторе ,
3. Далее, Calcuate относительные количества микроРНК с помощью метода 2 ^-ΔΔ Ct после нормализации к синтетического гена домашнего хозяйства в соответствии с инструкциями изготовителя.

Выделение липопротеинов высокой плотности после удаления экзосомы
Для получения микроРНК с высокой степенью чистоты HDL необходимо удалить экзосомы , которые представляют собой источник загрязнения микроРНК 7. Это было сделано до градиенте плотности ультрацентрифугирования с коммерчески доступного набора. Для практических целей стандартный градиент плотности протокола ультрацентрифугирования три этапа , разработанный коммерческой компании был изменен (рисунок 1). Этот протокол требует , центрифугирование с фиксированным углом ротора со скоростью 140000 оборотов в минуту , который существенно быстрее , чем обычно используемые протоколы с центрифугирование силами до 54000 оборотов в минуту 3, 8, 9 и 10. Использующую широкодоступных Т-1270 ротор с максимальное усилие 70000 оборотов в минуту, центрифугирование первоначально проводили с polyallomer трубками, которые не в состоянии сопротивляться центрифугировании сил. Для того, чтобы избежать коллапса труб,поликарбонатные трубы были успешно использованы. Время Центрифугирование имеет решающее значение для липопротеинов окисления и потенциально деградации микроРНК 11. Поэтому были испытаны несколько различных времени центрифугирования, начиная от в общей сложности 8 до 96 часов. Кроме того температура, при которой центрифугирование проводили регулировали в зависимости от времени центрифугирования и силы, соответственно.

Чистота липопротеинов высокой плотности фракций
Чистота выделенных фракций липопротеидов высокой плотности были проверены с электрофорезом в агарозном геле. Рисунок 2. иллюстрирует типичный результат электрофореза для HDL вычитании изолированы путем градиентного ультрацентрифугирования. Он ясно показал, что HDL был лишен каких-либо загрязнений ЛОНП и имеет типичный альфа-мобильности. Отсутствие каких-либо альфа-мигрирующих липопротеинов в ЛОНП и ЛНП фракций демонстрирует полное восстановление от HDL в течение ultracentrifugation шаг. HDL фракции, однако, также показал некоторые следы бета-подвижности, известной электрофоретической рисунком обвязочной вследствие загрязнения липопротеинов (Лп (а)) 12.

Устранение Лп (а) от изолированного HDL
Изучение микроРНК, перевозимые в HDL требует изоляции HDL наивысшей чистоты. Вмешательство Лп (а) с HDL потенциально способствует перекрестного загрязнения ЛВП с микроРНК, переносимых в ЛПНП. Чтобы свести к минимуму это загрязнение HDL, 15 мкл бета-меркаптоэтанола 10 добавляли к раствору C в течение последней стадии центрифугирования (Рисунок 1). Добавление бета-меркаптоэтанола было показано , чтобы не изменить свойства плотности HDL 10. Как показано на рисунке 3. добавление -меркаптоэтанол привело к отсутствию каких - либо B-мигрирующих липопротеинов в соответствии с весьма эффективного удаления Лп (а).

Очистка микроРНК из HDL
Выделение микроРНК первоначально была предпринята попытка использующую лизирующий реагент, который обычно используется для выделения РНК из крови. Хотя этот метод приводит к очень хорошим выходом РНК (91,45 нг / мкл), но после того, как спектрофотометрический анализ показал неудовлетворительную чистоту РНК. Дополнительная очистка выделенной РНК путем удаления фенола улучшило чистоту, но выход РНК был теперь значительно низким. Далее, еще один комплект был испытан , который показал приемлемую чистоту РНК (260/280 нм коэффициент 1,7) , однако выход РНК в 26 раз ниже по сравнению с реактива для лизиса (3,45 против 91,45 нг / мкл). Наилучшие результаты для приемлемой чистоты РНК с хорошим выходом были получены с сыворотки / плазмы комплект miRNeasy (48,2 нг / мкл; соотношение 260/280 нм 1,6), и, следовательно, эта процедура экстракции была впоследствии использована для обнаружения микроРНК из Выделенную HDL фракции липопротеинов.

3 и было показано , что репрессировать HDL холестерина поглощение 5. Рисунок 4A. показывает типичный лог-график кривых усиления, сравнивающих эпидемический порог и порог цикла значения после оптимизации реакции ПЦР для MIR-223 и зубчатым в Cel-MIR-39. Этот синтетический ген был использован в качестве внутреннего контроля, поскольку нет никаких сообщений о нормализации известного контроля за микроРНК в плазме. Кроме того, несколько потенциальных установленных эндогенные гены домашнего хозяйства, такие как RNU6-2, РНЕ-48, HY3 могли быть не обнаружены и SNORD95 может быть обнаружен в очищенном HDL, но разница в значениях Ct СИК-223 и SNORD95 меньше пяти ( данные не показаны). Таяние анализ кривой показано на рисунке 5. ясно показывает отличный синглпик соответствует амплификации селективного микроРНК в предыдущей ПЦР. Как показано на рисунке 4B., И микроРНК-223 и эталонным Cel-Mir-39 последовательно могут быть обнаружены во всех шести профессиональных группах. наблюдались относительно небольшие вариации среди всех лиц для Cel-MIR-39 по сравнению с микроРНК-223. Эти данные подтверждают выделение ЛВП с высокой степенью чистоты, чтобы обнаружить его микроРНК груза.

Обнаружение микроРНК-223 в очищенном HDL
В реальном масштабе времени количественный метод ПЦР использовали для количественного определения двойной шпилька-структуры микроРНК предшественников к одножильному микроРНК. Этот метод требует вперед / назад ген-специфических праймеров и термостабильной обратной транскриптазы, чтобы преобразовать шпилька структуру микроРНК в кДНК. КДНК затем амплифицировали и определяли количественно, используя в режиме реального времени КПЦР с помощью зеленого обнаружения SYBR. МикроРНК из сыворотки, плазмы и очищенной плазмы HDL может быть точно Profilред использованием системы микроРНК ПЦР.

Наш экспериментальный продукт среднего экспрессии генов микроРНК-223 показал значение Ct 30,9 в очищенном HDL и его соответствующие отрицательные контроли были выше среза 35 (НТК = 38,1 значения Ct, НЗТ и NAC не амплифицировали). В этом эксперименте мы наблюдали в очищенных образцах HDL образование Primer-димера с низкой температурой плавления (73 ° С в MIR-223 и 75,5 ° C в Чел-микроРНК-39) и выше , C значение T , чем специфические микроРНК анализов (Таблица 1). Грунтовка-димеров в таблице 1. происходят , вероятно , из - за высокой концентрации праймеров в растворе. Это происходит , главным образом , когда праймер молекулы присоединять друг к другу после того, как 30 циклов ПЦР 13. Это позволяет им не отжечь с другими молекулами праймера и , по сути, становятся линейными мини-шаблоны , и это приведет к более высокого фона и может привести к генерации С Т значения <40 для NTC (Нет templatе) контроль образцов.

Рисунок 1. Схематическое представление процедуры HDL изоляции. ЛВП получали путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности в серии из трех этапов центрифугирования. Распределение липопротеинов полос и промежуточных фракций градиента плотности проиллюстрированы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Электрофорез в агарозном геле липопротеинов Изолированные Без -меркаптоэтанол. ЛОНП, ЛНП и ЛВП фракции , выделенные с помощью градиента плотности ультрацентрифугирования без добавления бета -mercaptoethanol к раствору C demonstоценить наличие Лп (а) в HDL фракции. Дорожки 1, 2, 9 и 10 представляют каждый маркер размера; Дорожки 3/4, 5/6 и 7/8 представляют собой VLDL, LDL и HDL соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Электрофорез в агарозном геле ЛВП изоляции с бета-меркаптоэтанола. Добавление бета -mercaptoethanol к решению C до последней стадии центрифугирования привело к удалению Лп (а) из HDL фракции. Дорожки 1, 2, 9 и 10, каждый, представляют маркер размера; Дорожки 3-8 представляют HDL. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Кривые плавления для Cel-MIR-39 и микроРНК-223. Как показано, наличие одного пика указывает на специфическую амплификацию Cel-микроРНК-39 (правая панель) и микроРНК-223 (левая панель), соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Ряд C т значение отрицательного и положительного контроля синтетического Cel-MIR-39 и микроРНК-223 характеризуется в сыворотке, плазме, кДНК и очищенной фракции ЛПВП. Не NTC (Нет templatе управление), НЗТ (Нет обратной транскрипции фермента), NAC (Отсутствие контроля амплификации, только вода и реагенты из QRT-PCR).

Авторы не имеют ничего раскрывать.