Методическая статья

Быстрый и упрощенный метод высокой пропускной положить Выделение микроРНК из высокоочищенной липопротеинов высокой плотности

DOI:

10.3791/54257

⸱

27 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Virginia Commonwealth University, 2McGuire Veterans Affairs Medical Center, Research BC-101

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs играют важную регулирующую роль и появляются в качестве новых терапевтических мишеней для различных заболеваний человека. Было показано, что микроРНК осуществляется в липопротеинов высокой плотности. Мы разработали упрощенный метод, чтобы быстро изолирует очищенный HDL, подходящий для анализа микроРНК из плазмы крови человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Малые некодирующие РНК (микроРНК) были вовлечены в различные заболевания человека, включая метаболические синдромы. Они могут быть использованы в качестве биомаркеров для диагностики и прогнозирования или могут служить мишенями для разработки лекарств соответственно. Недавно было показано, что микроРНК переносятся в липопротеинах, в частности в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП), и доставляются в клетки-реципиенты для поглощения. Это повышает вероятность того, что микроРНК играют важную и ключевую роль в функционировании клеток и органов через регуляцию экспрессии генов, а также в качестве посредника для межклеточной коммуникации и перекрестных помех между органами. Современные методы выделения микроРНК из очищенных ЛПВП непрактичны при использовании небольших образцов в больших масштабах. Во многом это связано с трудоемкими и трудоемкими методами, используемыми для выделения липопротеинов. Мы разработали упрощенный подход к быстрому выделению очищенных ЛПВП, пригодных для анализа микроРНК, из образцов плазмы. Этот метод должен облегчить исследования роли микроРНК в здоровье и болезнях и, в частности, дать новое понимание разнообразия биологических функций, помимо обратного транспорта холестерина, которые были приписаны ЛПВП. Кроме того, виды микроРНК, присутствующие в ЛПВП, могут предоставить ценную информацию о клинических биомаркерах для диагностики различных заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МикроРНК являются эндогенными некодирующими крошечными видами РНК, которые высоко консервативны и считаются ключевыми игроками в регуляции различных биологических процессов путем деградации или подавления специфических целевых матричных РНК1. Поскольку микроРНК действуют внутриклеточно, они были исследованы как биомаркеры тканевого происхождения, что привело к открытию тканеспецифичных функций этих микроРНК. Тем не менее, микроРНК также обнаруживаются внеклеточно, либо в белках, либо в экзосомах/микровезикулах, которые могут эффективно защищать их от деградации внеклеточными РНКазами2. Более поздние исследования показали, что защитный эффект ЛПВП может быть тесно связан не с его способностью способствовать оттоку холестерина, а скорее с его нехолестериновым грузом, в частности, в качестве носителя циркулирующих микроРНК 3, 4. Эти микроРНК могут не только модулировать липидный обмен, но также связаны с противовоспалительными, антиоксидантными и антитромботическими эффектами комплекса ЛПВП-микроРНК 5, 6.

Для дальнейшего изучения роли микроРНК, переносимых в частицах ЛПВП, необходимо разработать простой и понятный протокол для экстракции микроРНК из выделенных высокоочищенных ЛПВП для использования в клинической практике. Было описано множество методов выделения ЛПВП. Эти методы либо очень трудоемки, либо требуют большого объема плазмы, что может потребовать объединения образцов, обширного диализа для обессоливания выделенных липопротеидов и они не полностью удаляют экзосомы как источник микроРНК соответственно. В этой статье мы опишем простой и быстрый метод, который позволяет выделить микроРНК из высокоочищенных ЛПВП, используя небольшой объем образцов крови в больших масштабах. Мы считаем, что этот метод может служить хорошим ориентиром для продвижения исследований роли циркулирующих микроРНК и, в частности, роли ЛПВП в облегчении коммуникации между различными клетками и органами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор проб крови

  1. Сбор натощак периферической венозной пробы крови в 10 мл пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (который имеет несколько преимуществ по сравнению с другими антикоагулянтами) стандартными венепункции видного вены в локтевую ямку.
  2. Центрифуга образцов крови при 1600 х г в течение 20 мин при 4 ° С в настольной центрифуге, чтобы получить свободный от красных кровяных клеток и небольших количеств РНК плазмы.
  3. Последовательная центрифугировать супернатант при 3000 г (4 ° C) в качающемся роторе в течение 10 мин, чтобы удалить WBC & тромбоциты и затем еще 15 мин, чтобы удалить остатки клеточных остатков соответственно.
  4. Измерение плотности плазмы с помощью денситометра при КТ в соответствии с инструкциями изготовления.
    Примечание: Регулировка плотности (d = 1,023 г / мл) с 0,9% солевом растворе может потребоваться после удаления экзосомы, но до градиента плотности ультрацентрифугирования.

    5. 2. экзосома Удаление из плазмы

    1. Удалите циркулирующие экзосомы , которые имеют плотность , аналогичную HDL и представляют собой количественно важный источник микроРНК 3.
      1. Это можно сделать, добавив 252 мкл раствора осаждения экзосом до 1 мл плазмы с последующей инкубацией в течение 30 мин при 4 ° C. Чтобы осадить вне экзосомы, центрифугировать смесь в течение 30 мин при 1500 г при температуре 4 ° С.
      2. Для выделения HDL, перенос 1 мл полученного супернатанта к поликарбонатным толстостенные ультрацентрифуге трубки для дальнейшей обработки с градиентом плотности ультрацентрифугирования (см ниже).

    3. Плотность Градиент Ультрацентрифугирование (Рисунок 1).

    1. Для того, чтобы отделить HDL использовать 3-х шаговый использующую пол ультрацентрифуге с фиксированным углом ротора работает на 448,811 х G и 8 ° C, соответственно.
    2. Подготовьте три различных решения плотности последовательно и годной для каждой изоляции.
      1. Приготовьте раствор A (выделение ЛПОНП, d = 1,006 г / мл) путем растворения 11,4 г NaCl (NaCl: 0,195 моль), 0,1 г EDTA2Na и 1 мл 1 N NaOH в 1000 мл автоклавного дистиллированной воды. Затем добавляют еще 3 мл автоклавного дистиллированной воды.
      2. Приготовьте раствор B (выделение LDL, D = 1,182 г / мл), добавляя 25,2 г NaBr на 100 мл раствора A (NaCl 0,195 моль, NaBr, 2,44 моль).
      3. Готовят раствор С (выделение ЛВП, d = 1,470 г / мл) путем смешивания 78,8 г NaBr с помощью 100 мл раствора А (NaCl, 0,195 моль, NaBr, 7,7 моль). Подтвердите соответствующую плотность при комнатной температуре, используя денситометр. Держите все решения при 4 ° С до дальнейшего использования.

    4. Выделение ЛПОНП

    1. Смешайте 1 мл плазмы (средняя плотность = 1023 г / мл) и нуклеазные бесплатно 200 мкл жира Red 7В в 6,5 мл из поликарбоната толстостенной ультрацентрифуге трубки.
    2. Затем осторожно слой 5 мл раствора А на верхней части смеси. При необходимости, добавить дополнительный жир Red 7В на вершине раствора A TO уравновесить вес каждой трубки. Центрифуга в течение 2 ч (ускорение - 5), (замедления - 7).
      Примечание: Во время центрифугирования, липопротеиды накапливаются как группа в своих регионах равновесной плотности.
    3. В конце прогона наблюдать 2 слоя. Удалить 1,5 мл фракции липопротеинов очень низкой плотности, представляющего верхний слой и хранят при температуре 4 ° С.
    4. И, наконец, с помощью передачи пипетки 4 мл из нижней части трубы, содержащей ЛПНП, ЛПВП, альбумин и фракции жирных кислот в новый поликарбонатной трубки для изоляции ЛНП.

    5. Выделение LDL

    1. Смешайте 2 мл раствора В и 100 мкл нуклеазы свободного жира Красный 7Б в пробирку, содержащую LDL и HDL фракции (раздел 4), соответственно.
    2. Затем центрифуге в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 1,5 мл ЛНП фракции, представляющей верхний слой и держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° С. И, наконец, передача 4 мл из нижней части трубы, содержащей HDLФракцию к новому поликарбонатной трубки.

    6. Выделение HDL

    1. Смешайте 2 мл раствора С, 100 мкл нуклеазы свободного жира Red 7В и 15 мкл 98% бета-меркаптоэтанол в пробирку, содержащую фракцию HDL, соответственно.
    2. Центрифуга в течение 3 ч (ускорение, замедление 9 7). После удаления 2 мл HDL фракции, представляющие верхний слой и либо держать при температуре 4 ° С или хранить при температуре -80 ° C.

    7. обессоливания и концентрации липопротеина фракций

    1. Для того, чтобы избежать помех с последующим электрофорезом в агарозном геле и ПЦР, удалите избыток соли, добавляемой при градиенте плотности ультрацентрифугирования с использованием центробежных фильтров устройств с соответствующей молекулярной массой обрезания (3K трубки для ЛОНП и 10K трубки для LDL / HDL), как описано в инструкции изготовителя.
      1. Если коротко, то после добавления 2,5 мл PBS, холодный (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4; рН 7,4) centrifuGE вся ЛПОНП фракция, собранная-во градиенте плотности ультрацентрифугирования при температуре 4 ° С в течение 60 мин с использованием качающийся роторе.
      2. Обессоливания фракции LDL в два раза с 10 мл охлажденного льдом PBS в течение 30 минут каждый. Затем, с помощью 13 мл охлажденного льдом PBS дважды для обессоливания HDL фракции. Чем выше объем PBS необходимо улучшить подвижность с электрофореза в агарозном геле. После центрифугирования, удаления липопротеинов, содержащих растворенные вещества и держать при температуре 4 ° C или хранили при -80 ° C.

    8. Электрофорез в агарозном геле

    1. Липопротеинов Выполнение проектно электрофореза в агарозном геле, использующую набор с незначительными модификациями инструкциями изготовителя следующим образом.
      Примечание: Этот шаг только для оценки качества и чистоты концентрированных образцов липопротеинов.
      1. Если коротко, то получим 6 мкл обессоленной фракции липопротеинов с градиентом плотности ультрацентрифугирования и загружают на липопротеина гель Сборный. Использование человеческого lipopСтандарты rotein для VLDL, LDL и HDL в качестве эталона размера. Проводят электрофорез при комнатной температуре при 100 V в течение 60 мин с использованием буфера Rep Prep.
      2. Сушат гель в течение 10 мин, а затем окрашивают в течение 10 мин при комнатной температуре с жиром Red 7В. Destain геля в смеси метанол-вода 75:25 (об / об) и сухой снова в течение 5 мин.

    9. Экстракция РНК и очистка

    1. Выполнение проектно изоляции микроРНК очищенным человеческим ЛВП с использованием набора сыворотка / плазма микроРНК выделения и очистки.
      1. Если коротко, то добавляют 1 мл реагента для лизиса РНК в 200 мкл очищенного HDL, смешать с вихревом смесителе и затем инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов и инактивации РНКазы.
      2. Затем шип 3,5 мкл синтетического Caenorhabditis Элеганс микроРНК (Cel-MIR-39; 1,6 × 10 8 копий / мкл) в смеси. Затем проводят экстракцию РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Выполните purificatiна извлеченной-микроРНК с Элюции спиновых столбцов в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте концентрацию микроРНК из очищенного HDL с spectrophorometer.
      Примечание: Вымывание микроРНК из спиновых колонн использовали 16 мкл РНКазы свободной воды.

    10. с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

    1. Изолировать 100 нг микроРНК из HDL подсыпали синтетическим микроРНК (CEL-микроРНК-39) и обратной транскрипции в объеме реакционной смеси 20 мкл с использованием набора для обратной транскрипции и в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Выполните соответствующие элементы управления без шаблона микроРНК (NTC) и без обратной смеси транскриптазы (НЗТ).

    11. ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)

    1. Выполнение проектно-изыскательских ПЦР в реальном времени в общем объеме 20 мкл с 2 мкл 1: 2 разведения кДНК, 10 мкл ПЦР-смеси, 2 мкл универсальной грунтовки, 2 мкл микроРНК праймеров и 4 мкл РНКазы воды.
    2. Запуск Reactiна в 96-луночные планшеты при 95 ° С в течение 15 мин с последующим 45 циклов при 94 ° С в течение 15 с и 55 ° С в течение 30 с и фазу удлинения при 70 ° С в течение 30 s.ec Выполнение проектно всех реакций при трехкратном повторе ,
    3. Далее, Calcuate относительные количества микроРНК с помощью метода 2 -ΔΔ Ct после нормализации к синтетического гена домашнего хозяйства в соответствии с инструкциями изготовителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение липопротеинов высокой плотности после удаления экзосомы
Для получения микроРНК с высокой степенью чистоты HDL необходимо удалить экзосомы , которые представляют собой источник загрязнения микроРНК 7. Это было сделано до градиенте плотности ультрацентрифугирования с коммерчески доступного набора. Для практических целей стандартный градиент плотности протокола ультрацентрифугирования три этапа , разработанный коммерческой компании...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение новых биомаркеров из крови поможет в клинической диагностике и прогнозировании различных заболеваний. MicroRNAs уже известно, обладают всеми качествами биомаркеров и было показано в различных исследованиях 14-17 лет. В данном исследовании мы показали быстрый и простой простой способ изолировать микроРНК из плазмы HDL. Обычные градиенте плотности методом ультрацентрифугированием изоляции ЛОНП, ЛНП и ЛВП зависит от точного отбора проб плазмы, точного приготовления буферного раствора, измерение плотн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана, полностью или частично, грантами NIH R01 AA 020758-04, U01DK 061731-13 и T32 DK 007150-38 AJS и T32 DK 007150-38 AA. Это оригинальная работа, которая не рассматривается в других местах для публикации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластиковый вакуумер Лаванда K2EDTA тубы Becton, Dickinson and Company366643
центрифугаThermo Scientific, Sorvall Legend X1R 
Денситометр 75004261 Densito 30PXMettler ToledoMT51324450
решение ExoQuick Invitrogen4484451
Поликарбонат толстостенная ультрацентрифугаThermo ScientificO3237
Sorvall WX100 ультрацентрифуга Thermo Scientific46902
Жир красный 7B Сигма-Олдрич201618
&бета;-меркаптоэтанол Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Центробежные фильтрующие устройства 10KMilliporeUFC901008
Amicon Ультрацентробежные фильтрующие устройства 3KMilliporeUFC800308
QuickGel Lipo kit Хелена Лабораториз 3344,3544T
Стандарты липопротеинов человека для ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВПLipoTrol; Helena Laboratories5069
Буфер для подготовки репс Хелена Лабораториз 3100
RNeasy MinElute вращающиеся колонны Анализатор Qiagen
NanoDrop 1000Thermo Scientific
miScript II RT Kit Qiagen218161
CFX96 Touch Система для детектирования ПЦР в реальном времениBioRad
miRNeasy Serum/Plasma KitQIAGEN217184
miScript Primer AssayQIAGEN141078139
miScript SYBR Green PCR Kit QIAGEN218073
miRNeasy сыворотка/плазма для контроля шиповQIAGEN219610
NaOHSIGMA-ALDRICH
480878 0.20 µ М стерильный шприцевой фильтрSIGMA-ALDRICHZ227536

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  2. Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
  3. Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
  4. Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
  5. Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
  6. Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
  7. Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
  8. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  9. Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
  10. Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
  11. Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
  12. Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
  13. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
  14. Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
  15. Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
  16. Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
  17. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
  18. Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
  19. Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
  20. Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи