Влажные химии и пептидный иммобилизации на политетрафторэтилена для улучшенного клеточной адгезии

Различные полимеры , используемые в медицине , которые были утверждены в течение некоторого времени не проявляют повышенную биосовместимость, т.е. отсутствие клеток-липкости, индукцию фиброзной капсулой и тромбообразования, чтобы упомянуть некоторые из них. Взаимодействие между биоматериала и биологической системы происходит в основном на поверхности имплантата. Как следствие этого, исследование сосредоточилось на модификации поверхности для того, чтобы создать соответствующие свойства для требуемого применения, оставляя объемные свойства материала не изменяются. Политетрафторэтилена (ПТФЭ) в качестве физиологически инертный полимер используется во многих областях медицины , таких как грыжа хирургической сетки ^1, медицинские порты ² и, самое главное, сосудистых трансплантатов ^3.

Особенно в крови контактирование ситуации гидрофобный характер PTFE вызывает неспецифическую адсорбцию компонентов плазмы и, как следствие адгезии тромбоцитов, что часто приводит к thrombotiC события и закупорка трансплантата ^4. Кроме того, из ПТФЭ, как и большинство полимеров, не поддерживает клеточную адгезию и покрытие , которое было бы желательным признаком , чтобы вызвать образование полезного слоя эндотелиальных клеток (ЭКС) на внутренней (полостной) поверхности сосудистой трансплантата ^5. Биомиметический эндотелий , как ожидается , выполнять многие из функций его естественного эквивалента, в частности , его антитромбогенные свойства ^6. Общая биомиметический стратегия модификации основана на концепции исключительно наделение материал с клеточной адгезионной способностью, оставляя материалы объемные свойства не изменяются. Кроме того, адгезия тромбоцитов может быть уменьшена за счет включения антиадгезионного (анти-обрастания) признаки ^7. Различные пептиды - в основном полученные из протеинов внеклеточного матрикса - были описаны , что сильно повысить клеточную адгезию путем связывания с клеточными рецепторами, принадлежащий к классу интегринов ^8. БытиеSt известным примером в этом отношении является пептид Arg-Gly-Asp (RGD), который взаимодействует с большинством типов клеток. Другие аминокислотные последовательности распознаются интегринов экспрессируется исключительно на конкретных клетках. Например, Арг-Glu-Asp-Val (REDV) и Тир-Иле-Гли-Ser-Arg (YIGSR) было обнаружено, что связываться с КЧС определенным образом ^9. Ковалентной иммобилизации таких пептидов было проведено на изобилием по своей природе не липких материалов , включая металлы и полимеры ^10,11.

Пористый ПТФЭ, более точно расширен ПТФЭ (ПТФЭ) - наряду с полиэтилентерефталата (ПЭТ) - это наиболее важный материал для производства сосудистых трансплантатов ^12. Установленные физические методы для надлежащего лечения, такие как модификация плазмы ¹³ или фотохимическим методами ^14, затруднены тем , что пористые и / или трубчатые структуры не легко поддается лечению в порах или просвет соответственно. Влажная химияПТФЭ является сложной задачей из-за чрезвычайно инертной природы Fluorin содержащего полимер , который противодействует большинство химических атак ^15.

В этой статье мы опишем сравнительно легкое метод стратегии ковалентной модификации. Адаптировано из процедуры для визуализации ПТФЭ к связыванию, функциональные группы были созданы на поверхности материалов, которые служат в качестве опорных точек для дальнейшего сопряжения биологически активных молекул.

1. Получение натрия нафталинид активизирующего раствора и поверхности активации

Примечание: Проведение реакции в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу. Следуйте общим правилам для сылно растворителей и коррозионные металлы, такие как металлический натрий. Нафталин имеет очень неприятный запах (законсервировать), даже в очень небольших количествах! Если не указано иначе реакции проводят при комнатной температуре. Азид натрия очень токсичен! ТГФ (99,9%, см список материалов) хранился в течение примерно 20% (по объему) молекулярного сита. Отфильтровываю ТГФ с заметным содержанием воды над натрием. Формирование нафталенидом натрия не происходит, если следовые количества воды присутствуют.

1. К раствору 1,4 г (10,9 ммоль) нафталина в 20 мл тетрагидрофурана (ТГФ, сушили над 3 молекулярного сита), добавляют 0,25 г (10,9 ммоль) металлического натрия в завинчивающейся крышкой стеклянный флакон 100 мл, снабженную PTFE- с покрытием магнитной мешалкой.
   Примечание: Dissoluция может быть значительно повышена за счет сокращения натрия на мелкие кусочки и скромные нагрева (35 - 40 ° C). Конечный раствор имеет темный, слегка зеленоватого цвета, и могут храниться в строго сухих условиях.
2. Выбивать PTFE диски диаметром 12 мм из материала толстой фольги 0,5 мм. Марк с одной стороны (например, с использованием штампа письмо удар) и чистый с изопропанолом.
3. Выдержите ПТФЭ образцы по отдельности в растворе активирующего (шаг 1,1) в течение 1 - 2 мин с помощью щипцов. Примечание: Изменение цвета от белого до темно-коричневого указывает на успешное лечение.
4. Затем прополоскать дважды ТГФ и затем изопропанолом.
   Примечание: Решение нафталинид исчерпывается, когда его цвет меняется на водянистой светло-коричневого цвета. Неиспользованный раствор нафталинид (возможно, содержащий металлический натрий) должен быть разложен, медленно добавляя изопропанола перед удалением.
5. Oxidize обработанные образцы в перекиси водорода (30%), содержащего 20% (вес / объем) трихлоруксусной кислоты в течение 3 ч. мытьс водой и высушить. Поверхность теперь имеет небольшой коричневатый внешний вид. Примечание: Включение и результат окисления в резко повышенной смачиваемостью поверхности. Этот вывод был подробно рассмотрен ранее ^14.
6. Лечить окисленные диски с 50% (об / об) гексаметилендиизоцианатом (HMDI) в сухом ТГФ в течение 2 ч, промывают ТГФ и оставить до полного высыхания.
7. Hydrolyze изоцианатные образцы подшипников в воде в течение 2 - 3 ч и сухой. Примечание: Конечный амино-функционализированные поверхности ПТФЭ является гораздо более стабильным, чем по отношению к изоцианату, приносящих образцов и совместим со многими стандартными сшиватели для дальнейшей связи.

2. Пептид иммобилизации

1. Приготовьте раствор 20% (об / об) диэтиленгликоля диглицидиловый эфир (диэпоксидную) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9.
2. Поместите аминируется диски с отмеченной стороной вверх по отдельности в 24-луночный планшет и добавляют 1,5 мл раствора эпоксида. Обеспечить полный охват образцов. Выдержите в течение 2 часов и мыть двараз водой и один раз с карбонатным буфером.
3. Добавляют 50 мкл 0,5 мг / мл пептида (например, REDV) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9 , содержащего 0,01% NaN _3, в нижней части отдельные лунки свежей 24 - луночного планшета и осторожно поместить эпоксидную функционализованных диски вверх -вниз (то есть, отмеченные стороной вниз) на каплю раствора пептида. Убедитесь, что пространство между дном скважины и PTFE диск полностью смачивается из-за капиллярного действия.
4. Выдержите во влажной камере (например, любой закрывающийся пластиковый ящик с плотно закрывающей крышки) с влажной атмосфере (путем размещения бумаги мокрой ткани на дне) , по крайней мере , 3 часа или на ночь.
   Примечание: REDV хотя и введены мотив можно рассматривать как хорошо охарактеризован, скремблированный или обратная аминокислотная последовательность может быть включена в качестве дополнительного отрицательного контроля.
5. Промыть три раза водой и стерилизуют в 50% изопропанол / вода в течение по крайней мере 30 мин. До посева клеток, RINSе образцы в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).

3. Посев Cell

1. Grow HUVECs с использованием процедур культивирования клеток стандарт ^17,18.
2. Поместите пептидные-конъюгированные образцы с модифицированной стороной вверх в 24-луночные планшеты. Использование необработанной PTFE дисков в качестве контроля.
3. Семя 5 х 10 ⁴ HUVECs в 2 мл среды на лунку и инкубировать в течение 4 ч при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в инкубаторе.
4. Удалите диски, промойте тщательно, чтобы удалить клетки и неприкрепленные передавать на свежий 24-луночного планшета. Добавляют 2 мл свежей среды и инкубировать в течение требуемого периода (например, 24 часа в сутки, 1 ш и т.д.). Изменение средних каждые два дня.
5. Подготовка исходного раствора 1 мг / мл кальцеином AM в диметилсульфоксиде (ДМСО).
6. После выращивания клеток удаления среды, промывают PBS и добавляют PBS , содержащего 1 мкл / мл кальцеин-АМ краситель (например, 1 мкл исходного раствора на мл PBS). Аккуратно агитировать и incubatе при 37 ° С в течение 45 мин в темноте.
7. Мытье с PBS и немедленно принять микрофотографии на флуоресцентный микроскоп оснащен стандартными FITC фильтрами (Ex 488 нм, Em 515 нм). С помощью 100-кратным увеличением. Выполните трехкратном повторе из немодифицированного, а также обработанные образцы.
8. С помощью программного обеспечения ImageJ определить площадь колонизировали клеток. В качестве альтернативы подсчитывать клетки вручную или с помощью ImageJ. Оба метода дают аналогичную информацию о прикрепленном и роста клеток на соответствующих поверхностях.

Результаты важнейших химических стадий реакции контролировали с помощью ИК - спектроскопии (рис 1). Первоначальная активация нафталенидом натрия порождает двойные связи - и в незначительной степени - ОН-функциональные возможности. Сигнал, указывающий С = С связей исчезают при окислении, что дает Несущая поверхность почти исключительно к гидроксильным группам групп. Анализ дальнейших стандартных шагов конъюгации здесь не показаны. Изменения цвета за счет активации и окисления находятся в согласии с ожидаемой химии, которая используется: конъюгированные системы двойной связью , как ожидается , будет коричневатые и его результаты потери в яркости (Рисунок 2). Кроме того, возможным результатом активации и окисления на морфологию поверхности была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Практически не пагубный эффект лечения не наблюдалось (рисунок 2).

рисунках 3 и 4 показаны результаты REDV-иммобилизации на рост эндотелиальных клеток. В то время как практически нет адгезии клеток и пролиферации не происходит на необработанном материале модификация сильно поддерживает колонизацию в течение двух недель. Вышеописанное для клинического применения (то есть, сосудистые трансплантаты), модификация была тождественно выполняется на исходном материале из коммерчески доступного трансплантата , изготовленного из вспененного ПТФЭ с аналогичными результатами в течение периода продолжительностью в одну неделю (рисунок 5).

Рисунок 1. ИК - спектроскопия PTFE. Лечение нетронутого PTFE (А) приводит к образованию двойных связей , и в определенной степени гидроксифосфонатов функций (B). В дальнейшем С = С связи снижаются из - за окисления (C Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Оптический внешний вид голой и поверхности активированного PTFE. (A) В то время как необработанного PTFE (слева) появляется белый, активация с помощью нафталинид натрия дает темно - коричневатый цвет (средний) , который слегка отбеленную при окислении (справа). Неочищенные (В) и окисленного PTFE (C) образцы дополнительно исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (увеличение: 2,000X). Диски диаметром 12 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Количественное покрытия клеток с помощью анализа ImageJ. Клеточный рост на голое PTFE (A, C,Е) и на REDV-конъюгированные поверхностей полимера (В, D, F) , выраженная в процентах охвата общей площади. Иммобилизованные пептид ясно дает начальную адгезию (B) и поддерживает колонизацию в течение 2-недельного периода (D, F). Triplicate определений, среднее ± стандартное отклонение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. эндотелиальные клетки выращивают в течение 1 недели на расширенном PTFE. Структура ПТФЭ показана с помощью сканирующей электронной микроскопии (A). Результаты, полученные на пористом материале в соответствии с результатами, полученными для плоского образца из ПТФЭ. В отличие от нескольких клеток, обнаруженныхна незащищенного материала (В) , модифицированной поверхности (С) обеспечивает отличную субстрат для роста клеток. Шкала баров 100 мкм для A, B и C соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Схематическое изображение химической модификации ПТФЭ с использованием мокрого лохимические. Двойные связи , сгенерированные обработкой Na-нафталинид окисляются в результате ОН-функциональными возможностями . Гидроксил-реактивный диизоцианат затем иммобилизовали и гидролизуют с амином. Наконец бифункциональный диэпоксид применяется к сопряжем REDV пептида с использованием N-концевой аминогруппы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.