Method Article

Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

DOI:

10.3791/54277

⸱

July 25th, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол прямого преобразования эмбриональных фибробластов мыши в полностью функциональные и стабильные стволовые клетки трофобласта путем десятидневной сверхэкспрессии Tfap2c, Gata3, Eomes и Ets2.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трофобласта стволовые клетки (TSCS) возникают как следствие первого решения клеточных судеб в развитии млекопитающих. Их можно культивировать в лабораторных условиях , сохраняя при этом способность к самообновлению и дифференцироваться во все подтипы трофобласта линии, что эквивалентно в естественных условиях популяции клеток, приводящее к фетальной части плаценты стебля. Поэтому TSCS предлагают уникальную модель для изучения развития плаценты и эмбриональных против внеэмбриональной решения клеточных судеб в пробирке. От стадии бластоцисты года, особым местом эпигенетическое барьер, состоящий из метилирования ДНК и модификации гистонов плотно отделяет оба родословных. Здесь мы опишем протокол, чтобы полностью преодолеть этот барьер с помощью клонов переходного процесса избыточная экспрессия трофобласта ключевых регуляторов Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 в мышиных эмбриональных фибробластов. Индуцированные трофобласта стволовые клетки способны к самообновлению и почти идентичны БЛАСТОЦИСТНОЙ производных трофобласта стволовых клеток яп по морфологии, экспрессии генов и маркеров метилирования. Функциональная в пробирке и в естественных условиях анализов подтверждают , что эти клетки способны дифференцироваться трофобласт родословная генерации полиплоидных трофобласта гигантские клетки и chimerizing плаценту при введении в бластоцисты. Индукция трофобласт стволовых клеток из соматических тканей открывает новые возможности для изучения генетических и эпигенетических характеристик этой внеэмбриональной линии и предлагает возможность генерировать линии трофобласт стволовых клеток без разрушения соответствующего эмбриона.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последнее время, исследование, сравнивая несколько подходов эмбриональных стволовых клеток мыши, чтобы трофобласта превращение стволовых клеток показало, что во всех анализируемых систем, преобразование родословная оставалась незавершенной. Вместо индуцированных стволовых клеток трофобласта (iTSCs) так называемые трофобласта стволовые клетки , как клетки были сгенерированы сохраняя память о клеточной судьбы происхождения 1. Здесь мы следовали другой подход генерации ITSC. По аналогии с прямой индукции плюрипотентных стволовых клеток из мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) 2, iTSCs были непосредственно преобразованы из дифференцированной со....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты мыши были проведены в соответствии с немецким законом защиты животных и по согласованию с одобрения местных комитетов по уходу за институциональное животных (Landesamt FUER Natur, Umwelt унд Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия [одобрение ID номер: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Подготовка СМИ

  1. Подготовка 293T среды: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) FBS, L-глутамином (2 мМ), пируват натрия (1 мМ), пенициллин / стрептомицин (1x).
  2. Подготовка MEF среды: DMEM, 10% (об / об) FBS, L-глутамина (2 мМ), 1x несущественные аминокислоты, пенициллин / стрептомицин (1x).
  3. Готовят ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На блюде , где трансген выражение 4F активизирован, клетки быстро изменить морфологию (сравните рисунок 2А и В). Вокруг день 14 - 21 различных областей transdifferentiated появляются (два примера приведены на рисунке 2В и С). Эти первичные колонии не имеют типичную морфологию TSC; Однако , как только они субкультивироваться, характерные эпителиальной морфологии с плотными краями и яркими границами очень напоминает добросовестных TSC , возникает (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4 фактора (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) на основе протокола трансдифференцировка, представленный здесь предлагает надежный метод для создания точно конвертирована iTSCs из эмбриональных фибробластов мыши. Кроме того, способ также применим для послеродовых хвостовых фибробласты, хотя и с падением эффективности по сравнению с эмбриональными фибробластами 3. В целом, качество первичных фибробластов является решающим фактором исхода и ухода трансдифференцировку должны быть приняты, чтобы использовать ранние прохож.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Доксициклина гиклатSigma-AldrichD9891-10GРастворить в стерильном PBS, приготовить исходный раствор 2 мг/мл. Хранить аликвоты при -20°С; C
Хлордифосфат соль Sigma-AldrichC6628-25GПриготовьте 25 мМ стоковый раствор в стерильной воде для клеточных культур. Хранить аликвоты при -20°С; C
Полибрен (гексадиметрина бромид)Sigma-Aldrich107689-10GПриготовьте стоковый раствор 8 мг/мл в стерильной воде для клеточных культур. Хранить аликвоты при -20°С; C
человеческий рекомбинантный фактор роста фибробластов 4ReliaTech300-131LРастворить в стерильных 0,1% BSA в PBS, приготовить 25 &микро; г/мл исходного раствора. Хранить аликвоты при -80 °°С; C
Гепарин натриевая сольSigma-AldrichH3149-10KUПриготовить 1 мг/мл стокового раствора путем растворения в стерильном PBS. Хранить аликвоты при -80°С; C
ProFection Система для трансфекции млекопитающихPromegaE1200
PBS, без кальция, без магнияThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640, без глютаминаThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
Трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красныйThermoFisher Scientific25300-054
Поли-L-лизинSigma-AldrichP4707
Фетальная бычья сывороткаHycloneSH30071.03IR
Безповерхностно-поверхностно-активный ацетатный фильтр целлюлозыCorning431220
Заменимые аминокислотыThermoFisher Scientific11140-035
Пенициллин стрептомицинThermoFisher Scientific15140-122
Пируват натрия ThermoFisher Scientific11360-039
L-глутамин ThermoFisher Scientific25030-24
2-меркаптоэтанолThermoFisher Scientific31350-010
Диметилсульфоксид (ДМСО), сорт клеточной культурыPanreac AppliChem GmbHA3672,0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA Addgene19780
Мыши B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7JAXМыши 6965
129S2SVЧарльз Ривер129

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

Related Articles