Здесь мы представляем протокол прямого преобразования эмбриональных фибробластов мыши в полностью функциональные и стабильные стволовые клетки трофобласта путем десятидневной сверхэкспрессии Tfap2c, Gata3, Eomes и Ets2.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трофобласта стволовые клетки (TSCS) возникают как следствие первого решения клеточных судеб в развитии млекопитающих. Их можно культивировать в лабораторных условиях , сохраняя при этом способность к самообновлению и дифференцироваться во все подтипы трофобласта линии, что эквивалентно в естественных условиях популяции клеток, приводящее к фетальной части плаценты стебля. Поэтому TSCS предлагают уникальную модель для изучения развития плаценты и эмбриональных против внеэмбриональной решения клеточных судеб в пробирке. От стадии бластоцисты года, особым местом эпигенетическое барьер, состоящий из метилирования ДНК и модификации гистонов плотно отделяет оба родословных. Здесь мы опишем протокол, чтобы полностью преодолеть этот барьер с помощью клонов переходного процесса избыточная экспрессия трофобласта ключевых регуляторов Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 в мышиных эмбриональных фибробластов. Индуцированные трофобласта стволовые клетки способны к самообновлению и почти идентичны БЛАСТОЦИСТНОЙ производных трофобласта стволовых клеток яп по морфологии, экспрессии генов и маркеров метилирования. Функциональная в пробирке и в естественных условиях анализов подтверждают , что эти клетки способны дифференцироваться трофобласт родословная генерации полиплоидных трофобласта гигантские клетки и chimerizing плаценту при введении в бластоцисты. Индукция трофобласт стволовых клеток из соматических тканей открывает новые возможности для изучения генетических и эпигенетических характеристик этой внеэмбриональной линии и предлагает возможность генерировать линии трофобласт стволовых клеток без разрушения соответствующего эмбриона.
Введение
В последнее время, исследование, сравнивая несколько подходов эмбриональных стволовых клеток мыши, чтобы трофобласта превращение стволовых клеток показало, что во всех анализируемых систем, преобразование родословная оставалась незавершенной. Вместо индуцированных стволовых клеток трофобласта (iTSCs) так называемые трофобласта стволовые клетки , как клетки были сгенерированы сохраняя память о клеточной судьбы происхождения 1. Здесь мы следовали другой подход генерации ITSC. По аналогии с прямой индукции плюрипотентных стволовых клеток из мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) 2, iTSCs были непосредственно преобразованы из дифференцированной со....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты мыши были проведены в соответствии с немецким законом защиты животных и по согласованию с одобрения местных комитетов по уходу за институциональное животных (Landesamt FUER Natur, Umwelt унд Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия [одобрение ID номер: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Подготовка СМИ
- Подготовка 293T среды: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) FBS, L-глутамином (2 мМ), пируват натрия (1 мМ), пенициллин / стрептомицин (1x).
- Подготовка MEF среды: DMEM, 10% (об / об) FBS, L-глутамина (2 мМ), 1x несущественные аминокислоты, пенициллин / стрептомицин (1x).
- Готовят ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На блюде , где трансген выражение 4F активизирован, клетки быстро изменить морфологию (сравните рисунок 2А и В). Вокруг день 14 - 21 различных областей transdifferentiated появляются (два примера приведены на рисунке 2В и С). Эти первичные колонии не имеют типичную морфологию TSC; Однако , как только они субкультивироваться, характерные эпителиальной морфологии с плотными краями и яркими границами очень напоминает добросовестных TSC , возникает (.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
4 фактора (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) на основе протокола трансдифференцировка, представленный здесь предлагает надежный метод для создания точно конвертирована iTSCs из эмбриональных фибробластов мыши. Кроме того, способ также применим для послеродовых хвостовых фибробласты, хотя и с падением эффективности по сравнению с эмбриональными фибробластами 3. В целом, качество первичных фибробластов является решающим фактором исхода и ухода трансдифференцировку должны быть приняты, чтобы использовать ранние прохож.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Доксициклина гиклат | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Растворить в стерильном PBS, приготовить исходный раствор 2 мг/мл. Хранить аликвоты при -20°С; C |
| Хлордифосфат соль | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Приготовьте 25 мМ стоковый раствор в стерильной воде для клеточных культур. Хранить аликвоты при -20°С; C |
| Полибрен (гексадиметрина бромид) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Приготовьте стоковый раствор 8 мг/мл в стерильной воде для клеточных культур. Хранить аликвоты при -20°С; C |
| человеческий рекомбинантный фактор роста фибробластов 4 | ReliaTech | 300-131L | Растворить в стерильных 0,1% BSA в PBS, приготовить 25 &микро; г/мл исходного раствора. Хранить аликвоты при -80 °°С; C |
| Гепарин натриевая соль | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Приготовить 1 мг/мл стокового раствора путем растворения в стерильном PBS. Хранить аликвоты при -80°С; C |
| ProFection Система для трансфекции млекопитающих | Promega | E1200 | |
| PBS, без кальция, без магния | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, без глютамина | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красный | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Поли-L-лизин | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Безповерхностно-поверхностно-активный ацетатный фильтр целлюлозы | Corning | 431220 | |
| Заменимые аминокислоты | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Пенициллин стрептомицин | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Пируват натрия | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-глутамин | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-меркаптоэтанол | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО), сорт клеточной культуры | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Мыши B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX | Мыши 6965 | |
| 129S2SV | Чарльз Ривер | 129 |
Ссылки
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
