Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Краткое содержание

Описан высокопроизводительный анализ для скрининга ферментов. Этот мультиплексный готовый к использованию набор для анализа состоит из предварительно отобранных субстратов C,hromogenic P.olymer H,ydrogel (CPH) и сложных субстратов Inрастворимых C,hromogenic Biomass (ICB). Ферментами-мишенями являются полисахариды, разрушающие эндоферменты и протеазы.

Аннотация

CАрбогидраты active enzymes (CAZymes) выполняют множество функций in vivo и широко используются для промышленной переработки в биотопливной, текстильной, моющей, бумажной и пищевой промышленности. Более глубокое понимание CAZymes важно как с фундаментальной биологической, так и с промышленной точки зрения. В природе существует огромное количество CAZymes (особенно у микроорганизмов), и сотни тысяч из них были каталогизированы и описаны в базе данных carbohydrate active enzyme (CAZy). Тем не менее, скорость открытия предполагаемых ферментов опередила нашу способность биохимически охарактеризовать их активность. Одна из причин этого заключается в том, что достижения в секвенировании генома и транскриптома, а также связанные с ними инструменты биоинформатики позволяют быстро идентифицировать кандидатов на CAZymes, но технология определения биохимических характеристик фермента развивается медленнее. Чтобы восполнить этот технологический пробел, в статье описывается новый набор для высокопроизводительных анализов на основе нерастворимых хромогенных субстратов. Были получены два различных типа субстратов: субстраты Chromogenic Polymer H.ydrogel (CPH) (изготовленные из очищенных полисахаридов и белков) инерастворимые субстраты Chromogenic Biomass (ICB) (изготовленные из сложных материалов биомассы). Субстраты CPH и ICB поставляются в 96-луночной высокопроизводительной системе анализа. Субстраты CPH могут быть изготовлены в четырех различных цветах, что позволяет смешивать их друг с другом и, таким образом, увеличивать производительность анализа. Протокол описывает анализ на 96 лунках и иллюстрирует, как этот анализ может быть использован для скрининга активности ферментов, ферментных коктейлей и бульонов.

Введение

Методы добычи геномов и метагеномов быстро развивались в последние годы, как и стратегии со средней и высокой пропускной способностью для клонирования и экспрессии рекомбинантных ферментов. Кроме того, значительно расширились биоинформационные ресурсы и связанные с ними депозитарии, такие как (CAZy)^1,2. Тем не менее, существуют значительные проблемы, связанные с использованием разнообразия микробных ферментов в промышленных целях, и эмпирическое определение активности ферментов в настоящее время стало серьезным узким местом. Например, подсчитано, что, используя современные методы, мы можем с уверенностью прогнозировать активность не более 4% белков в базе данных CAZy. Несмотря на то, что существует множество методов мониторинга активности ферментов, все они имеют некоторые ограничения. Хорошо зарекомендовавшие себя методы, основанные на хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, доступны для оценки активности олигомерных фрагментов гликозилгидролазы (ГР)^3,4. Однако эти подходы трудоемки и, как правило, имеют низкую пропускную способность. Методы, основанные на измерении редуцирующих сахаров, такие как анализы динитрозалициловой кислоты⁵ и анализа Нельсона-Сомоги⁶, широко используются для оценки активности ГР. Однако эти анализы имеют ограниченную производительность и могут быть подвержены побочным реакциям. Отдельные хромогенные полисахаридные субстраты, такие как азурин сшитый (AZCL), широко используются для определения активности ферментов, но покупка всех субстратов по отдельности и ручное распределение порошков субстрата в тестовой пластине может быть обременительным и дорогостоящим⁷.

Мы разработали новое поколение хромогенных полимерных гидрогелевых субстратов (CPH) на основе красителей хлортриазина, которые при использовании в сочетании с 96-луночной фильтровальной пластиной образуют высокопроизводительную систему анализа. Были разработаны дополнительные субстраты на основе нерастворимой хромогенной биомассы (ICB), которые предоставляют информацию о наличии субстрата в сложных полимерных смесях, таких как те, которые существуют в лигноцеллюлозной биомассе. Каждая подложка может быть изготовлена в одном из четырех цветов, а подложки разных цветов могут быть объединены в одной лунке. В данном протоколе показано, что данная методология может быть применена к широкому спектру полисахаридов и белков, а также потенциал для скрининга ГР, литических полисахаридных монооксигеназ (ЛПМО) и протеаз. Специальные протоколы для использования 96 луночных планшетов и репрезентативные результаты иллюстрируют высокую эффективность наборов субстратов CPH и ICB в качестве инструментов для скрининга ферментов.

Одним из существенных преимуществ описанных наборов для анализа, независимо от субстрата, является то, что наборы готовы к использованию в течение 15 минут, после этапа активации. Это избавляет от необходимости трудоемкой сборки анализа из исходных материалов подложки, как это имеет место при некоторых других методах⁷. Субстраты CPH и ICB обладают отличной хранениею (не менее одного года при комнатной температуре), pH и температурной ^{стабильностью 8} и не требуют специального оборудования или обучения. Анализы CPH или ICB основаны на 96-луночной фильтровальной пластине, в которой протекает реакция с ферментом. Если фермент активен с данным субстратом, образуются растворимые окрашенные олигомеры, образующие окрашенную надосадочную жидкость, которая затем может быть отфильтрована в обычный 96-луночный планшет с помощью вакуумного коллектора или центрифуги ⁸.

Субстраты окрашены красителями хлортриазина, которые поглощаются в диапазоне видимого спектра (VIS), а отдельные цвета (красный, синий, желтый и зеленый) могут быть разрешены с помощью линейной регрессии, если разные субстраты CPH разных цветов смешиваются в одной лунке, и фермент действует более чем на одну субстрат. Полученная пластина с надосадочной жидкостью может быть измерена с помощью стандартного считывателя микротитровальных пластин, способного измерять поглощение в диапазоне VIS. Смешивание различных субстратов с разными цветами в одной лунке увеличивает пропускную способность пробирной системы, в общей сложности до 384 экспериментов в 96-луночном планшете (4 различных субстрата разных цветов на лунку).

Субстраты

CPH предоставляют ценный инструмент для оценки специфической активности фермента, в то время как субстраты ICB используются для оценки способности фермента переваривать компонент в контексте сложных субстратных смесей, с которыми ферменты обычно сталкиваются в биомассе. Несмотря на то, что субстраты ICB не предоставляют информации об индивидуальной специфичности ферментов, они, тем не менее, являются полезными инструментами для оценки коммерческой эффективности ферментов, коктейлей или бульонов.

Протокол

1. хромогенного анализа с CPH субстраты в 96-луночный планшет формата

1. Активация набора для анализа пластины
   1. Активация фильтра 96-луночного (содержащий синий CPH-ксилана) набор для анализа пластины (список материалов) путем добавления 200 мкл раствора, полученного активации (с комплектом) в каждую лунку с последующим 10 мин инкубации при комнатной температуре без перемешивания.
   2. Применение вакуума с помощью вакуумного коллектора (с распорной блок внутри и любого стандарта, прозрачный 96-луночный планшет в виде коллекции пластины), чтобы удалить из дошедших до нас активирующего раствора. Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин для этого шага вместо вакуумного коллектора.
   3. Вымойте КПВ субстратов путем добавления 100 мкл стерильной воды и применять вакуум (или центробежной силы) для удаления стабилизатора. Повторите этот шаг еще два раза и планшеты теперь готовы к использованию.
2. ферментной реакции
   Примечание: Всегда включайте буферв одиночку в качестве отрицательного контроля, и, если возможно, ранее охарактеризованными ферментами в качестве положительных контролей. Используйте статистически необходимое количество повторов. КПВ субстраты стабильны при рН от 3,0 до 10,0 и от общего объема раствора конечного буфера фермента в каждую лунку, не должна превышать 180 мкл. Экстракт из растений или культуральный бульон также может быть использован вместо очищенного раствора фермента.
   1. Добавьте 150 мкл 100 мМ натрий - ацетатного буфера, рН 4,5 , и 5 мкл эндо -cellulase раствора (до конечной концентрации 1 ед / мл) в каждую лунку набора для анализа пластины.
   2. Поместите продукт пластину (ясный-луночный планшет совместим с читателем Микротитровальный пластины) под набор для анализа пластины для сбора любой потенциальной утечки из реакционной пластины при сотрясении.
   3. Выдержите набора для анализа пластины при температуре 25 ° С в течение 30 мин в горизонтальном шейкере при 150 оборотах в минуту.
      Примечание: Смешивание реакции в набор для анализа пластины во время инкубации имеет решающее значение для достижения последовательного и репроприводима результат. CPH субстраты стабильны до 90 ° C. Время инкубации должна быть увеличена до 24 часов при испытании культуральных бульонах, содержащих неизвестные концентрации фермента с CPH субстратов. Следует отметить, что соответствующие периоды инкубации зависят от активности фермента (ов), но в общем случае, если не обнаружено активности в течение 24 часов, вполне вероятно, что фермент не будет ухудшать тестируемый субстрат. Активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахаридами КПВ субстрата в растворимые хромогенных олигосахариды, которые видны в виде окрашенного супернатанта.
   4. Поместите чистую тарелку продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри.
   5. Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа). Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин.
      Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции теперь в продукте пластины для дальнейшего анализа ⁸ .
3. Обнаружение и Количественное
   1. Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку продукта пластины примерно одинакова при визуальном осмотре.
   2. Измерить оптическую плотность сбора пластины при 595 нм для синего CPH-ксилана, используя планшет-ридер.
   3. При выполнении анализа данных, вычесть буфера только отрицательные контрольные значения из значений из скважин, где был добавлен фермент. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках ^8.

2. хромогенного анализа с МКТ Подложки в формате 96-луночного

1. ферментной реакции
   1. Добавляют 150 мкл 100 мМ ацетата натрия буфера, рН 4,5 , и 5 мкл 31 ед / мл эндо -xylanase раствора в каждую лунку набора для анализа пластины , содержащей красный МКТ-пшеничной соломы (конечная концентрация фермента в скважине: 1 ед / мл) ,
      Примечание: Набор для анализа пластины (96-луночного фильтр плАтес содержащие ICB субстраты) производятся, как описано в литературе (см перечень материалов). МБК субстратами являются стабильными в буферах при рН в диапазоне между рН 3,0 до 10,0. Всегда включать только буфер в качестве отрицательного контроля, коммерческие ферменты в качестве положительного контроля и использовать статистически соответствующее количество копий.
      1. Не активировать ICB субстраты, как пластины CPH подложки, но удалить стабилизатор промывкой три раза с 100 мкл воды, а затем с помощью вакуумной фильтрации или центрифугирования.
   2. Поместите пластину продукта под пластиной подложки для сбора любой потенциальной утечки из пластины подложки при сотрясении.
   3. Инкубируйте реакции при 25 ° С, встряхивая при 150 оборотах в минуту в течение 2 часов.
      Примечание: активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахариды в ICB субстрата в растворимые олигосахариды, которые видны как цветная супернатанта. ICB субстраты стабильны до 90 ° C. Инкубационный тIME должен быть увеличен до 24 часов, если неочищенные ферменты, такие как культуральных бульонов используются.
   4. Поместите пластину продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри.
   5. Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа) или использовать центрифугу для фильтрата продукта из набора для анализа пластины в лунку продукта пластины.
      Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции в настоящее время в коллекции пластины для дальнейшего анализа ^8.
2. Обнаружение и количественное определение
   1. Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку для сбора пластины приблизительно одинакова при визуальном осмотре.
   2. Измерить оптическую плотность сбора пластины при 517 нм для красного ICB-пшеничной соломы с использованием планшет-ридера.
   3. При выполнении анализа данных - вычесть буфер - только отрицательные контрольные значения из значений из лунок, где ферментбыл добавлен. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках ^8.
      Примечание: В случае скрининга неизвестных ферментов, мы предлагаем сделать серию разбавления, чтобы получить более подробные данные о динамическом диапазоне активности фермента.

Результаты

С высокой пропускной способностью и мультиплексирование способность данного анализа основан на нерастворимый полимер хромогенный (или белок) гидрогеля (CPH) подложках, расположенных в 96-луночные фильтровальные планшеты. Ферменты, так и отрицательные элементы управления добавляются в набор для анализа пластины (рис 1А) и ферменты , деградируют соответствующую подложку , продуцирующих цветной супернатант (Фигура 1В). После завершения реакции, супернатант переносили в пластинчатое изделие ясно-луночного и оптическую плотность можно измерить непосредственно с помощью спектрофотометра , подходящий для 96-луночные планшеты (рис 1C).

Пример ответа дозы СРН-арабиноксилана к ксиланазы при различных концентрациях фермента (0,00 - 0,75 ед / мл), показан на рис 1D , где уменьшением концентрации фермента можно наблюдать визуально. Более подробное спектрофотометрический Quantфикация может быть использован для построения поглощения в зависимости от концентрации фермента (рис 1E). Интенсивность сигнала соответствует активности фермента. Воспроизводимость анализа показана Столбики ошибок (стандартная ошибка среднего значения, SEM, из трех реплик). Более детальные эксперименты по воспроизводимости этого анализа опубликованы в другом месте ^8.

Рисунок 1. Ксиланазная лечение СРН-арабиноксилана. А) показана схема набора для анализа пластины с КПВ субстратом (например, CPH-арабиноксилан) загружают в 96-луночных лунки фильтрационного планшета непосредственно перед добавлением ферментов , 1 и 2 , и буфер -только контроль (фермент 1 имел эндо -xylanase активность); Б) Деградация CPH-арабиноксилана ферментом 1 получают цветной супернатант с) при вакууме при содействии filtratиона супернатантов в к пластинчатому изделию, абсорбция измеряется спектрофотометрически; D) , пластина продукт , содержащий продукты реакции после обработки СРН-арабиноксилана в 4 -х различных цветов с различными концентрациями эндо -р-1,4-ксиланазы в 100 мМ ацетатный буфер натрия, рН 4,5 в течение 60 мин при комнатной температуре, д . ) Количественная продуктов реакции из D с помощью спектрофотометрии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Существуют различные варианты использования этого анализа в ферментной скрининга. Один из вариантов заключается в использовании 96-луночного планшет, содержащий различные полисахариды для скрининга, например, небольшое количество (очищенного) эндо -enzymes с неизвестной активностью. В этом случае результат покажет, какие полисахаридами являются degradв состоянии с помощью фермента-мишени. Чтобы показать этот принцип, эндо -cellulase тестировали против различных CPH субстратов при 25 ° C. Три различные концентрации фермента (0,5 Ед / мл, 1,0 ед / мл и 5 ед / мл) инкубировали в течение 30 мин. Результат хорошо виден в табличке (фиг.2А). Лист продукт для этого эндо -cellulase предоставленного поставщиком определяет побочный активность для ксилоглюкана (тамаринд), ячменя бета-глюкан, глюкоманнан, Birchwood ксилана и низкую боковую активность для галактоманнану. В соответствии с этим, деятельность в дополнение к целлюлазы была обнаружена против CPH-бета-глюкан (ячмень), CPH-ксилоглюкан (тамаринд), CPH-ксилана (букового) и низкой активностью в отношении CPH-галактоманнану (рис 2B). Глюкоманнан не был протестирован. Те же CPH субстраты были переварены коммерческими доступными ферментами (три различные концентрации фермента: 0,1 ед / мл, 0,5 ед / мл и 1,0 ед / мл) использовали в качестве положительного контроля, при тех же самых условиях, чем предыдущийэксперимент. Все основы были деградирует с помощью положительного контроля фермента и интенсивность сигнала увеличилась , соответствующая более высокой концентрации фермента (фиг.2с).

Рисунок 2. Восемь различных CPH субстратов инкубировали при перемешивании при 25 ° С в течение 30 мин. A) Продукт пластины из различных субстратов CPH переваривают с эндо -cellulase, при различных концентрациях. В) Количественное деятельности и различные побочные активности эндо -cellulase. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения трех реплик C) активности различных коммерческих ферментов к соответствующему CPH подложке (эндо-целлюлазы и 2-HE-целлюлозы;. E-LAMSE и CPH-pachyman, CPH-курдлан, CPH- β-глюкан (ячмень); E-XYAN4 и CPH-ксилана, E-XEGP и СРH-ксилоглюкан, E-BLAAM и CPH-амилозы, E-BMACJ и CPH-галактоманнановый; все ферменты из Megazyme). Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения двух реплик. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Нерастворимые хромогенная биомасса (ICB) подложки являются полезным дополнением к хромогенного субстрата репертуара, поскольку они сохраняют частично естественное расположение полисахаридами в стенках клеток растений, которые являются основным компонентом биомассы. CPH и ICB субстраты используются в нашем примере для анализа секретируемые ферменты Phanerochaete Chrysosporium при культивировании в жидкой среде. Установка пластины из набора для анализа пластины показан на фигуре 3А, с 19 CPH подложек и 5 МКТ субстратов (4 лунки для каждой подложки, рис 3B). П. Chrysosporium был cultivatред в течение трех дней, а затем супернатант культуры анализировали. Таким образом, 125 мкл 200 мМ буфер переносили в каждую лунку и по 25 мкл супернатанта культуры добавили. Три различных значения рН были протестированы с использованием буферного раствора ацетата натрия , рН 4,0, натрий - фосфатного буфера рН 6,0 или при рН 8,0 (3С). Планшет инкубировали в встряхивании (150 оборотов в минуту) при 25 ° С в течение 2 часов.

Продукты реакции были переведены на табличке (рис 3D) и проанализированы. П. Chrysosporium полученных ферментов для расщепления различных глюканов, крахмал и ксиланов (рис 3e). Более низкие сигналы могут быть обнаружены для arabinan гемицеллюлоз (сахарная свекла) и пектинового галактана, а также для RGI (сои). Ферменты, синтезируемые были более активны в кислой среде (рН 4,0), чем в нейтральной или слегка щелочной среде (рН 8,0). Нижняя активность по отношению к МКТ субстратов (рис 3F)показывает, что, когда Полисахариды в более естественном контексте, эффективность фермента не то же самое, как с чистым полисахарида, и именно поэтому ICB субстраты демонстрируют более реалистичное представление о ферментативной эффективности, если она была применена к сырой или предварительно обработке растительного материала.

Рисунок 3. Скрининг супернатанта культуры из 3-дневного возраста жидкой культуры Phanerochaete Chrysosporium с использованием мульти подложки планшет, содержащий 19 CPH и 5 ICB субстратов. А) схема установки плиты с 4 -х скважин для каждой отдельной подложки (серый фон = CPH субстраты, оранжевый фон = ICB субстраты). B) Изображение планшета для анализа , содержащей подложку. C) Схема , показывающая условия буфера , используемого в этом эксперименте (200 мМ ацетат натрия , рН 4,0, натрия фосфат рН 6,0 и фосфата натрия , рН 8,0). D) , изображение продукта пластины после того, как 2 ч при 25 ° С. Е) спектральной поглощательной способности были обнаружены при 517 нм и наносили на график для каждой отдельной подложки СРН и F ) результаты ICB субстратом для соответствующих ферментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Хромогенные субстраты могут быть также использованы для изучения синергического эффекта при использовании смеси различных цветных CPH субстратов в одной скважине и анализом реакционной надосадочной жидкости после обработки с использованием одиночных ферментов или энзимов коктейли.

В следующем примере , показанном на фиг.4, красный CPH-целлюлоза и желтые CPH-ксилана субстратов смешивали вместе при приблизительно фасОтношение Al в 96-луночных лунки фильтрационного планшета. На фиг.4А показаны окрашенные продукты реакции после обработки 1 ч при комнатной температуре, без фермента (контроль), целлюлоза CEL (2 ед / мл), ксиланазы Xyl (1 ед ​​/ мл) и смесь обоих ферментов (3 реплицируется для каждого подхода) в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5. Для анализа, продукт реакции количественно спектрофотометрически путем сканирования спектра поглощения от 350 нм до 700 нм (рис 4б). Часто в одиночку визуальный осмотр может дать указание о том, действует фермент на одной или нескольких подложек, однако регистрируются спектры поглощения , вытекающие из различных красителей также могут быть решены с помощью простой линейной регрессии ⁸ , чтобы дать более точное представление о степени деградации каждого подложка из смеси.

Использование CPH субстраты в виде смесей существенно повышает пропускную способность анализа, что позволяет ОПЗeening против до 4-х различных субстратов в одном эксперименте (одна скважина). В примере, показанном четыре различных субстратов, используемых: синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH-пектиновые галактановый (люпин). Расположение пластины подложки показан на рисунке 4C и изображение планшета для анализа на рис 4D. Реакцию проводили в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5 в течение 30 мин при 25 ° С и 150 оборотах в минуту. Первые одиночные ферменты с увеличением концентрации фермента были протестированы с соответствующей СРН подложке (рис 4д) и окрашенного супернатанта был получен , как ожидалось в табличке (рис 4F, строка 1А - 12D). Ряд E содержал два различных CPH подложки желтый CPH-ксилана и синий CPH-β-глюкан, которые разлагаются при различных соотношениях соответствующих ферментов эндо -xylanase и эндо -glucanase. После завершения реакции, результат visibле в табличке: цвет продукта реакции был темно - зеленый-синий, когда более эндо -glucanase присутствовал (рис 4F, 4E-6е) и превратилась в зажигалку желто-зеленого цвета, при увеличении концентрации эндо -xylanase ( Рисунок 4F, 10-12E). То же самое наблюдается в строке F, где две подложки красный CPH-пектиновые галактановый и желтый CPH-ксилана деградировали с эндо -galactanase и эндо -xylanase. Все четыре разные цветные CPH подложки присутствовали (рис 4F, 1G-12F) и одиночные ферменты деградирует соответствующий CPH субстрат и путем добавления дополнительных ферментов сочетание окрашенных продуктов реакции было получено.

Рисунок 4. Сочетание двух различных CPH субстратов, красный CPH-целлюлоза и желтый CPH-ксилана, обрабатывают различными ферментами.) Реакции супернатантов после обработки двух подложек с эндо -cellulase (КВЖД) или эндо -xylanase (Xyl) или обоих ферментов. B) спектры поглощения супернатантах реакции. Комбинация из четырех различных субстратов CPH обрабатывают различными ферментами C) Схема подложки пластины , содержащей КПВ субстраты:. Синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH- пектиновые галактановый (люпин) D) Изображение планшета для анализа , содержащего различные подложки CPH Е) Схема продукта пластины , показывающий соотношение количества добавленных ферментов (номинальной концентрации (НК):.. Glu = 1 ед / мл эндо -glucanase, Xyl = 1 ед / мл эндо -xylanase, Amy = 5 ед / мл эндо - амилазы и гал = 0,5 ед / мл эндо -galactanase). F) изображение продукта пластины после 30 - минутной инкубации при 25 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

подложка	Источник
CPH-2-гидроксиэтил-	N / A
(CPH-2-ОН-целлюлоза)
CPH-амилопектина	картошка
CPH-амилозы	картошка
CPH-arabinan	сахарная свекла
CPH-арабиноксилан	пшеница
CPH-казеина	бычьего молоко
CPH-хитозан	животного происхождения
CPH-курдлан	Alcaligenes фекальный
CPH-декстрана	Leuconostoc SPP.
CPH-галактоманнановый	рожковое дерево
CPH-ЛАМИНАРИН	ламинарии
CPH-lichenan	Исландский мох
CPH-метилцеллюлозы	N / A
CPH-pachyman	Poria Кокосовые
CPH-пектиновые галактановый	картошка
CPH-пуллулановый	Aureobasidium пуллуланы
CPH-rhamnogalacturonan I (RG I)	картошка
CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal) *	картошка
CPH-rhamnogalacturonan	соевые бобы
CPH-ксилана	букового
CPH-ксилоглюкан	тамаринд
CPH-β-глюкан из ячменя	ячмень
CPH-β-глюкан из овса	овсяной
CPH-β-глюкан из дрожжей	дрожжи
ICB-Arabidopsis	Розетка листьев из Резуховидка Таля Col-0 ( для взрослых растений)
Семена ICB-Arabidopsis	Резуховидка Таля
ICB-жома	Saccharum officinarum (высушенный взрослого растения, стебель и листья)
ICB-кристаллическая целлюлоза (фильтровальная бумага)	коммерческие бумаги Ватман 3MM Chr хроматографии
Семена ICB-пажитника	Trigonella SPP. Семена
ICB-пеньки	Конопля SPP. (Высушенный взрослого растения, стебель и листья)
Семена ICB-люпин	Люпин узколистный семена
ICB-пыльцевой П. луговой	Phleum луговой пыльца
ICB-ель	Picea SPP. (Милиствол дерева заполненной)
ICB-табак	листья из Nicotiana benthamiana (молодое растение)
ICB-пшеничной соломы	Triticum SPP. (Высушенный взрослое растение, стебель и листья)
ICB-Ива	Salix SPP. (Высушенный взрослое растение, ствол дерева измельченный)
ICB-Сорго	Сорго SPP. (Уходит от взрослого растения)
* (β-1,4-D-галактановый боковые цепи , удаленные с эндо -β-1,4-D-galactanase)

Таблица 1. Список доступных хромогенного Полимерный гидрогель (CPH) и нерастворимые Хромогенная Биомасса (ICB) субстратов.

Обсуждение

Мы используем новое поколение разноцветных CPH и МКТ субстратов , которые основаны на chlorotriazine красителей (полный список подложек в таблице 1) расположены в специально созданных коммерческого набора для анализа. Ферментативного расщепления субстратов дает мелкие, растворимые, окрашенные продукты , которые могут быть обнаружены в растворе для анализа и может быть определена количественно с помощью ридера ⁹ пластин. Этот анализ предназначен для оценки эндо -Актерское ферментов и чувствительность анализа аналогичен подход, использующий azurine поперечно сшитую (AZCL) подложках ^10, в то время как другие способы доступны для экзо -Актерское ферментов ^11,12. Ограничение этого набора для анализа заключается в выявлении эндо -enzyme активности, а CPH, а также ICB подложки не разлагаемые на экзо -enzymes , скорее всего , из - за стерических затруднений , возникающих из красителя и сшивающих молекул ^8.

Анализ проводят в 96-достл формат и индивидуальные реакции происходят в скважинах. Реакция должна быть тщательно перемешана в плите, чтобы получить воспроизводимые данные. Полученные супернатанты фильтруют в табличке, где поглощение каждой лунки может быть определена количественно с помощью оптической плотности спектрометрией. Основные принципы и расположение анализа показаны на рисунке 1. Анализ состоит из аналитического планшета (96-луночный фильтровальный планшет а) с подложками, и после инкубации с ферментами, надосадочную жидкость фильтруют через в четком луночного планшета и оптические плотности считывают обеспечивая полуколичественный измерение ферментной специфичности и активности. Было показано, что этот скрининг тест с использованием CPH субстраты могут быть также использованы в агаровой формате пластины, где растворимые продукты реакции создать цветной ореол после инкубации в течение ночи. ⁸

Наборы анализа могут быть использованы для скрининга очищенные ферменты и их возможные побочные действия, как показано вРисунок 2. Побочные действия могут возникать из одного фермента и его беспорядочном специфичности , но и с тем , что образец анализировали представляет собой смесь различных ферментов и их синергический эффект должен быть изучен. Кроме того, как было показано в предыдущих исследованиях, что ферментные коктейли, кишечную флору ¹³ и культуральные бульоны из грибов ^8, а также эндогенный фермент , растений и бактерий (неопубликованные данные) могут быть использованы в качестве источника фермента.

ICB субстраты решения сложных смесей компонентов клеточной стенки часто встречаются в промышленных процессах пробоя биомассы. Эти подложки предназначены для оценки наличия полисахарида и предоставить информацию о том, как эффективно оптимизировать коктейли деградации для более эффективного выхода деградации. Как показано на рисунке 3 CPH и ICB подложки могут быть использованы в ферментной скрининга бок о бок - показывая огромное количество информации о специфичности фермента А.Н.d активность в обоих контексте предпочтительного субстрата (CPH) и более природный комплекс, содержащий другие компоненты в дополнение к предпочтительным субстратом более близко имитируя макромолекулярная сборка обнаруживаемых в природе (ICB). Использование нескольких цветов позволяет одновременного обнаружения различных ферментативных активностей против нескольких субстратов, что увеличивает высокую пропускную способность и multiplexity анализа. Спектры различных красителей может быть решена путем простой линейной регрессии и в большинстве случаев активность мульти-субстрат можно наблюдать при визуальном осмотре в одиночку. Имитируемый примером такого эксперимента и его результаты изображено на рисунке 4.

Этот анализ инструментов и универсальность его применения очень хорошо подходит для скрининга первого уровня ферментов и культуры бульонов с неизвестными деятельности. Наиболее важными аспектами этого анализа являются его высокая пропускная природа, настраиваемость, простота использования и гибкость. Имея это в виду, ше полагают, что этот новый набор инструментов позволит значительно улучшить и ускорить процессы фермента скрининг на промышленных объектах, а также научных приложений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
планшеты	для анализа Glycospot		индивидуальный набор для анализа раствор
активации субстратов CPH
350 мл ресивер пластина спейсер блок для вакуумного коллектора	Pall Corporation	5015	спейсер
блок 96-луночный MultiScreen HV фильтрующая пластина, 0,45 &; m, прозрачная, нестерильная	пластина	для анализа миллипор	MSHVN4510
96-луночные микропланшеты, полипропилен	Greiner Bio-One	651201	сборная пластина после промывки подложек
Nunc MicroWell 96-Well микропластины	Thermo Scientific	269620	пластина продукта
Мембранный насос MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	вакуумный насос, используемый с вакуумным коллектором
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	горизонтальный шейкер
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-луночный планшетный абсорбционный считыватель
Вакуумный коллектор	Pall Corporation	5017	вакуумный коллектор
endo-целлюлаза (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	целлюлаза [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanaza [man]
endo-β-1,3-глюканаза (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-глюканаза [glu]
endo-β-1,4-D-галактаназа (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	галактаназа [gal]
endo-β-1,4-ксиланаза M4 (Aspergillus niger)	Мегазим	E-XYAN4	ксиланаза [xyl]
endo-ксилоглуканаза (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	xyloglucanaза [xg]
α-амилаза (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	амилаза [amy]