Методическая статья

Высокая-контент In Vitro Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform

DOI:

10.3791/54298

⸱

16 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потеря инсулин-продуцирующих β-клеток является центральным признаком диабета. В то время как изучаются различные потенциальные заместительные методы лечения, экспансия эндогенных инсулин-продуцирующих островковых β клеток поджелудочной железы остается привлекательной стратегией. β-клетки имеют ограниченную спонтанную регенеративную активность; Следовательно, важнейшей исследовательской задачей является достижение точного понимания молекулярных путей, которые ограничивают рост β-клеток, и определение лекарств, способных преодолеть эти ограничения. В данной работе представлен автоматизированный метод скрининга первичных клеток с высоким содержанием изображений для идентификации малых молекул, способствующих репликации β клеток. Преодолены некоторые ограничения предыдущих методологий. Во-первых, использование первичных островковых клеток, а не иммортализированной клеточной линии, максимизирует удержание in vivo ограничений роста. Во-вторых, использование культур островковых клеток со смешанным составом, а не β-клеточной линии, позволяет идентифицировать как ограниченные по линии, так и общие стимуляторы роста. В-третьих, этот метод делает практичным использование первичных островков, ограничивающего ресурса, за счет использования формата 384 лунок. В-четвертых, вредная экспериментальная изменчивость, связанная с неустойчивым качеством культуры островковых прокладок, преодолевается за счет оптимизации параметров выделения, диспергирования, гальванизации и культивирования. В-пятых, трудности точного и последовательного измерения низкой скорости базальной репликации островковых эндокринных клеток преодолеваются с помощью оптимизированных параметров иммуноокрашивания, автоматизированного сбора и анализа данных; Автоматизация одновременно повышает производительность и ограничивает систематическую ошибку экспериментатора. Заметными ограничениями этого анализа являются использование дисперсных островковых культур, которые нарушают архитектуру островков, использование островков грызунов, а не человека, и присущие им ограничения пропускной способности и стоимости, связанные с использованием первичных клеток. Важно отметить, что стратегия легко адаптируется для исследований репликации островков человека. Этот анализ хорошо подходит для изучения митогенного действия веществ на β-клетки и молекулярных механизмов, регулирующих рост β-клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диабет включает в себя совокупность расстройств, разделяющих общую конечную точку нарушенного гомеостаза глюкозы. Хотя патогенетические механизмы диабета подтипов различны, они имеют следствием пониженной β-клеточной массы, то есть, потери производства инсулина мощностью 1,2. В настоящее время стратегии лечения диабета полагаются на хроническое введение экзогенного инсулина, фармакологической стимуляции выработки инсулина или повышения чувствительности к инсулину, и редко, трансплантация островков поджелудочной железы или всей поджелудочной железы 3,4. К сожалению, успех этих стратегий является кратковременным и / или не в достаточной степени перепросматривать функцию эндогенного инсулина. Несмотря на полезность разработки метода для стимуляции регенерации β-клеток, ни один такой подход не существует. Следовательно, главная цель исследования диабета заключается в разработке методов для создания новых бета-клеток или расширить эндогенного β-клеточной массы 5 . Хотя регенерации β-клеток из возобновляемых источников , таких как эмбриональные стволовые клетки развивается, безопасность и эффективность проблемы делают преследование альтернативных стратегий, в том числе расширение зрелых бета-клеток, приоритет 6,7. Важно отметить, что основным источником новых бета-клеток в естественных условиях предварительно существующие бета-клеток , а не специализированные клетки - предшественники 8,9. Хотя бета-клетки, кажется, имеют ограниченные возможности репликации, небольшое увеличение массы β-клеток (~ 30%) может быть достаточно, чтобы восстановить гомеостаз глюкозы во многих диабетиков. Кроме того, на месте фармакологической стимуляции массы β-клеток в потенциально недорогой и масштабируемая стратегия лечения. При этом метод скрининга высокого содержания для идентификации и характеристике небольших молекул, которые стимулируют рост β-клеток представлена.

Разнообразие экспериментальных методов в пробирке , могут быть использованы для идентификации генных продуктов и / или молекулы ТНАт способствуют репликации первичного β-клеток. Ранние попытки для измерения индукции репликации β-клеток использовали плода культуры грызун поджелудочных желез или неповрежденные культуры изолированных островковых для измерения [3 H] тимидина, BrdU включение или митотических тела в пределах альдегид-тионина или инсулина , окрашенном населения в ответ на конкретные условия обработки 10, 11. Эти подходы в пробирке и близкие его варианты имеют ряд ограничений. Известные недостатки включают в себя (1) использование эмбриональных клеток , которые, в отличие от зрелых бета-клеток, демонстрируют высокую скорость репликации базальной β-клетки и рост регулируется в различимыми 12; (2) субъективный характер экспериментатора-зависимого судебного решения событий репликации β-клеток; (3) труд и время интенсивного характера экспериментатора-зависимого подсчета событий репликации β-клеток замедл экспериментальную пропускную способность; (4) использование ядерного инкорпорации / пятно / внешний вид, чтобы идентифицировать репликацию дажеTS и не перекрываются цитоплазматический краситель для выявления бета-клеток приводит к приписывание уточненного событий репликации не-β-клеток в бета-клетки.

Совсем недавно зрелые первичные бета-клетки были использованы для оценки влияния трансгенов избыточная экспрессия, а также продукт гена или соединение лечения на репликацию β-клеток 13-16. Тем не менее, эти исследования также полагались на субъективном подсчета событий репликации, цитоплазматический staining- или неспецифических методов идентификации β-клеток и / или трудоемких шагов , которые ограничивают пропускную способность , например, индивидуальный слайд-луночного покрытия клеток или неповрежденной островок парафин и обработка 17. Следует отметить, что человеческий β-клеток методологии скрининга репликации на основе изображений, похожий на тот , представленный здесь, был опубликован 18; Тем не менее, успешное использование этого анализа не было продемонстрировано и использование человеческих островки для первичного скрининга не может быть широко FEAскорее.

Альтернативной стратегией для выявления репликации промотирующее веществ для оценки индукции роста β-клеточных линий. Первоначальные усилия использовали трансформированных бета-клеточные линии , такие как min6 клетки или INS 832/13-клетки 14,19-21. Тем не менее, эти клеточные линии демонстрируют-безудержный рост и имеют мало общего с хорошо дифференцированных -клеток 22. Следовательно, рост индукции мощность минимальна, неясного отношение и иногда трудно пересказать. Улучшенная стратегия для скрининга на основе клеточной линии утилизирует "обратимо трансформировали" клетки, рост арестованы в отсутствие тетрациклина (доксициклин) экспрессия 23,24 антигена -зависимая SV40 T. Тем не менее, неясно, будет ли вернуть эти клетки к "нормальной" β-клеток, как состояние после удаления доксициклина. К сожалению, использование этих клеток дало обобщенные стимулирующие рост соединений, которые, кажется, не имеют немедленного утилиты24. В целом, использование клеточных линий для изучения регуляции роста клеток типа , где отображаются минимальное спонтанную активность репликации может иметь ограниченную применимость.

Репликации скрининга платформы β-клеток , представленные здесь используют зрелые первичные крысы бета-клетки , чтобы сохранить в регуляции роста естественных условиях в максимально возможной степени, островок-клеточные культуры состава смешанного клеточного типа , который позволяет идентифицировать деятельности , способствующих росту LINEAGE-ограниченным, мульти -ну форматирование, чтобы максимизировать пропускную способность и автоматизированный анализ для устранения смещения и облегчить пропускную способность. Успешное использование этой платформы позволило выявить несколько соединений , которые способствуют репликации β-клеток 25,26. Кроме того, исследование было использовано для изучения зависимости структура-активность и химических экспериментов эпистазу обеспечить механистических понимание молекулярной регуляции репликации β-клеток. Представленная платформа была успешно адаптирована FOг лентивирусов RNAi на основе исследование репликации β-клеток дорожками 25. Ограничения анализа включают ограниченный масштабируемость (использование первичных клеток), использование грызуна, а не человеческих островковых клеток (хотя анализ может быть адаптирован для исследования островковых человека), расходы, связанные с изображениями на основе антител и использование первичного островкового, использование дисперсных островках (нарушена островок архитектуры), чтобы облегчить автоматизированное получение изображений и зависимость от наличия автоматизированного микроскопа с приобретением изображения и возможности анализа. Несмотря на то, снисходительный в естественных условиях методики скрининга для выявления генных продуктов или соединений , которые стимулируют регенерацию β-клеток на месте было бы идеально, такая платформа еще не доступна 27. Следовательно, описанная платформа подходит для исследователя, заинтересованного в исследовании большинство аспектов репликации β-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был проведен в соответствии с Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из школы Стэнфордского университета медицины. Описанный протокол масштабируется для выделения островковых клеток из шести 250 - 300 г (8 - 9 недель) самцов крыс Sprague Dawley, которых достаточно для создания 228 лунки 384-луночный планшет для оценки репликации островковых клеток.

1. Подготовка материала

  1. Подготовьте носитель для нанесения покрытий до начала выделения островковых клеток путем сбора кондиционированной среды клеток карциномы мочевого пузыря крысы 804G поддерживают при слиянии в течение 3 -х дней (20 мл RPMI1640) в 15 см блюдо культуры ткани 28. Стерильный фильтр и магазин (-20 ° С), кондиционированную среду для последующего использования.
  2. Стерилизовать хирургических инструментов (один 12 см Щипцы Зубчатые ткани, один 11,5 см тонкие ножницы, один 14,5 см хирургические ножницы, два 16 см изогнутые щипцы, один 12 см изогнутые кровоостанавливающего, один 12 см скальпелем) и одно сито ткани 30 меш до инициализироватьiating островок изоляции.
  3. Готовят панкреатический раствор пищеварение путем растворения 60%: 40% смесь очищенного класс I: коллагеназы класса II (общая активность коллагеназы 300000 - 400000 единиц) в 60 мл 1x Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением кальция и магния. Нагрузка 10 мл панкреатического буфера пищеварения в 10 мл шприцев (шесть) с 1 "22 G иглы и место на льду.
    Примечание: 10 мл переваривания раствор инъецируют на крысу. Масштаб соответственно.
  4. Приготовьте 4,5 мл анестезирующего коктейля в вытяжном шкафу при смешивании 1,3 мл кетамина (100 мг / мл), 0,2 мл ксилазина (100 мг / мл) и 3 мл ФБС. Подготовьте обезболивающий коктейль в течение 1 часа инициирования выделения островковых клеток.
  5. Приготовьте промывочный буфер путем добавления 25 мл сыворотки новорожденного теленка до 500 мл HBSS. Поместите промывочного буфера на льду для последующего использования.
  6. Готовят 1 бутылка островковых среды , которая находится в 500 мл низкий уровень глюкозы в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5000 ед / мл пенициллина и 5000 мкг / мл стрептомицина.
  7. Готовят островковых функцию среды из раствора функциональность / жизнеспособность (500 мл) с 2% FBS, 2 мМ глутамина, 5 мМ глюкозы, 5000 ед / мл пенициллина и 5000 мкг / мл стрептомицина. Храните функции островковых среды (4 ° C) для последующего использования.
  8. Приготовьте 40 мл блокирующего буфера, добавляя 2,5 мл ослиного сыворотки и 0,12 мл Тритона Х-100 в 37,38 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Хранить блокирующий буфер (4 ° С) для последующего использования.
  9. Получить необходимые антитела до начала протокола.
    Примечание: PDX-1 (TRITC) и Ki-67 (FITC) совместное окрашивание используется для скрининга репликации первичного β-клеток. Для анализа репликации клонального специфических, выполняют иммунофлюоресценции окрашивания дополнительных маркеров идентичности клеток (инсулин, глюкагон, виментина или соматостатина; TRITC) наряду с ядерными (DAPI), PDX (Cy5) и Ki-67 (FITC) окрашивания. Альтернативный представителькация маркеры, например, PCNA, также могут быть использованы.
  10. Подготовить план 228-обработки скважин с каждым условием лечения выполняется в четырех экземплярах. Включите положительности (5-Iodotubercidin [1 мкМ] или дипиридамола [15 мкМ]) и транспортного средства управления (ДМСО 1: 666 разведение) скважин.

2. Кровоснабжение поджелудочной железы

  1. Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции разведенного раствора анестетика коктейль (0,30 мл / 100 г массы тела). После того, как крыса полностью под наркозом и не реагирует на вредные стимулы, выполнять шейки дислокации.
  2. Поместите эвтаназии крыса в положении лежа на спине (черепно-хвостового ориентации) на стопку бумажных полотенец и распылить брюшной области с 70% этанола.
  3. Откройте брюшной полости с U-разрез (база в лобковой области) и втягивания кожи в ростральной направлении на грудь, чтобы обнажить брюшную полость.
  4. Осторожно возьмите в двенадцатиперстную кишку с помощью двух пар изогнутых щипцов, найдите двенадцатиперстной ввод общей ЪIle протока (сфинктер Одди) и зажать отверстие в двенадцатиперстной сосочка с изогнутым кровоостанавливающего.
  5. Поднимите изогнутую кровоостанавливающего, используемый для фиксации общего желчного протока сосочек и захватить желчный проток ближе к печени с помощью изогнутых щипцов. Используйте тупой диссекции с изогнутыми щипцами, чтобы изолировать и подвергать желчный проток.
  6. Переставьте крыса с головным проксимальных и ноги дистальной.
  7. Вводить иглу общего желчного протока (КБР) в или только дистально по отношению к месту соединения кистозных и общего печеночного протоков поджелудочной с раствором переваривания -loaded 10 мл шприц и медленно вводят 10 мл раствора поджелудочной железы пищеварения. При введении, поддерживают КБР скальпелем. Переставьте иглу, если проток и поджелудочной железы не раздувать.
  8. Удалите завышенные поджелудочной железы с использованием изогнутых щипцов и тонкие ножницы, чтобы отделить его от нисходящей ободочной кишки, кишечника, желудка и селезенки. Поместите завышенные поджелудочную железу на льду в 50 мл пробирку, содержащую 5 мл панкреатический раствор пищеварения.
    Примечание: Для получения максимального выхода островковой, собрать все поджелудочных желез в течение 30 мин и место только 1 или 2 поджелудочных желез в каждой 50 мл переваривания трубки.

3. Диссоциация ПЖ

  1. После того, как все поджелудочных желез собраны, поместите пробирками в ванну воды C 37 ° в течение 15 мин. Аккуратно вихревой трубы через каждые 3 мин.
  2. Через 15 мин, энергично встряхивать ( по вертикали) в трубки 10 раз и добавляют 10 мл холодного буфера для промывки. Энергично встряхните в трубки еще 5 раз и место на льду.
  3. Заполните пробирками до 50 мл холодной промывочного буфера и взболтайте труб 5 раз.
  4. Центрифуга пробирки при 97 мкг при 4 ° С в течение 1 мин и сливают надосадочную жидкость. Будьте осторожны, чтобы не выбивать гранулированной ткани.
  5. Добавить 25 мл промывочного буфера и вновь приостановить ткань, осторожно встряхивая. Повторите шаги 3.4 и 3.5 в два раза больше.
  6. Поместите сито ткани 30 меш по улerile 250 мл химический стакан и залить суспензии ткани на сито. Ополосните переваривания трубку с дополнительными 20 мл промывочного буфера и вылить на сетку. Непереваренные панкреатические и жировые ткани удаляются на этом шаге.
  7. Налейте отфильтрованный материал на две свежие 50 мл пробирки и гранул ткани путем центрифугирования при 97 мкг в течение 1 мин при температуре 4 ° С. Сцеживать супернатант и инвертировать трубки для отвода избыточного буфера.

4. Очистка Островков

  1. Добавьте 20 мл раствора диатризоат холодной polysucrose / натрия (1,119 г / мл плотности) к гранулированной ткани поджелудочной железы. Гомогенно повторно приостанавливать содержимое каждой пробирки, осторожно пипеткой вверх и вниз в пять раз.
  2. Аккуратно наложения раствора диатризоат polysucrose / натрия с 10 мл HBSS. Поддерживать острую раздела жидкость, медленно добавляя HBSS вдоль стенки трубы.
  3. Центрифуга переваривается поджелудочных желез при 560 х г в течение 15 мин (4 ° С) с медленным ускорением и без тормоза.
  4. Колорадоllect Островок слой из интерфейса с использованием 10 мл пипетки и место островки в свежих 50 мл пробирки. Не объединять островки на данном этапе.
  5. Добавить 40 мл промывочного буфера в каждую 50 мл трубки и спина в течение 1 мин при 140 х г при температуре 4 ° С.
  6. Выливают надосадочную жидкость и повторно приостанавливать объединенные островки в 50 мл буфера для промывки путем инвертирования трубок несколько раз. Центрифуга пробирки в течение 1 мин при 97 мкг при 4 ° С, чтобы собирать островки в гранулу.
  7. Слейте промывочный буфер и повторить промывку. Доведите островки в капот культуре ткани и аспирата супернатант.
  8. Повторное приостановить каждую пробирку островками в 6 мл островковых среды.
  9. Передача островки из каждой 50 мл трубки в лунку шесть хорошо блюдо культуры ткани. Вихревой блюдо 6-луночного собирать островки в середину колодца и наблюдать за качество и чистоту островковых под микроскопом.
  10. Вручную собирать островки с использованием 1 мл пипеткой и переносят отборные островки в соседнийлунку, содержащую 6 мл островковых сред. Повторите островок закрученного и собирание чистоты до> 90% достигается.
  11. Передача Очищенный островки до 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 20 мл островковых среды.
  12. Место островки в инкубаторе тканевых культур (37 ° С, 5% СО 2) в течение ночи (Фигура 1А).
  13. При подготовке металлизированный островковых клеток, пальто лунки 384-луночного планшета с 40 мкл 804G кондиционированной среды на лунку. Выдержите в течение ночи в инкубаторе тканевых культур.

5. Дисперсия и покрытие из островковых клеток

  1. На следующий день, аккуратно отсоединить островковых клеток от 10 см чашку с клеточным скребком и передавать островки в 50 мл пробирку.
  2. Гранул островки центрифугированием в течение 1 мин при 22 мкг при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант.
  3. Промыть островки с 20 мл теплого PBS и переливать, как указано выше.
  4. Повторное приостановить островки в 0,25% трипсина (150 мкл на поджелудочной железе у крыс) И инкубируют при температуре 37 ° С в течение 10 мин. Пипетка островки вверх и вниз 10 раз, используя 1 мл пипетку через 5 и 10 мин инкубации.
  5. Через 10 мин оценивают пробу 20 мкл трипсином островках под микроскопом, чтобы обеспечить полное переваривание и подсчитывать островковых клеток с помощью гемоцитометра. Если непереваренные Островки остаются, продолжают инкубацию еще в течение 3 - 5 мин и пипеткой вверх и вниз 10 раз больше. Повторите по мере необходимости.
    Примечание: Типичный выход ~ 125000 - 150000 островок клеток на крысу.
  6. Удалить 804G кондиционированной среды покрытием 384-луночного планшета из инкубатора и удалить носитель с использованием 12-луночного коллектора аспиратора.
  7. Приостановка островковых клеток при плотности 45000 клеток на мл в островковых функции среды и пластины 70 мкл (3,150 клеток) на лунку с многоканальной пипеткой (Фиг.1В).
    Примечание: Поскольку бета-клетки, расположенные в наружных скважин, как правило, мигрируют в направлении периметра использовать пластины строк C до N и столбцов 4до 21 к пластине 228 скважин с островковых клеток, выделенных из 6 крыс.
  8. Поместите пластину в культуральную инкубаторе ткани в течение 48 часов, чтобы позволить адгезию клеток.

6. Островок-клеточная культура Лечение, Фиксирование и Окрашивание

  1. Подготовьте 200 мкл транспортных средств и соединений (условия обработки выполняются в четырех экземплярах) в 2 раза концентрации в функции островковых среды. Расположить соединения в стерильный 96-луночный планшет для облегчения многоскважинных пипетированием.
  2. Осторожно снимите островок среды с 12-луночного коллектора аспиратора и заменить функции островковых среды (35 мкл / лунку) с помощью пипетки 12-луночного. Удалить и заменить носитель из одной строки в то время , чтобы ограничить риск сушки (рис 1C).
  3. Начинать лечение путем передачи 35 мкл / лунку растворах соединений 2x. Возвращение пластины в инкубатор для лечения продолжительностью 48 ч.
  4. После 48 часов лечения, переливать средства массовой обработки опрокидыванием планшета.
  5. Аккуратно промывать островковых клеток с 50 мкл на лунку 1x PBS (1 мин). Добавьте PBS с помощью пипетки многоканальный.
  6. Декантируйте PBS и зафиксировать клетки, путем добавления 50 мкл на лунку холодного 4% параформальдегида (PFA), разведенного в 1x PBS. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  7. Промыть клетки три раза (5 мин каждый) опрокидыванием планшета, чтобы удалить PFA и осторожно добавляя 60 мкл PBS на лунку, как указано выше.
  8. Приготовьте 15 мл раствора антигена извлечения путем смешивания 14,25 мл формамида, и 0,75 мл 0,15 М цитрата натрия (рН 6). Сделать извлечения раствора антигена непосредственно перед использованием.
  9. Удалить PBS из лунки опрокидыванием планшета и добавляют 60 мкл раствора извлечения антигена в каждую лунку. Нагревают пластину в ванне 70 ° C воды в течение 45 мин. Поместите нагревательный блок в верхней части пластины во время этой инкубации, чтобы предотвратить коробление мульти-луночного планшета с.
    Примечание: Вода должна быть на полпути пластины юбка; планшет не должен быть погружен в воду.
    10. Удалить пластину из водяной бане и дайте ему остыть в течение 20 минут при комнатной температуре. Убедитесь в том, что пластина не деформироваться при визуальном осмотре.
  10. Вымойте клеток с 60 мкл на лунку 1x PBS три раза (5 мин каждый раз). Добавить PBS с многоканальным пипетку и переливать PBS опрокидыванием планшета.
  11. С помощью пипетки многоканальный добавить 40 мкл на лунку блокирующего буфера и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите блокирующий буфер опрокидыванием планшета и декантации.
  12. Добавьте 40 мкл мышиного антитела против человеческого Ki-67 (1: 200) и козьего антитела против человеческого PDX-1 (1: 100) антитела, разбавленного в блокирующем буфере, в каждую лунку и инкубировали при 4 ° С в течение ночи.
  13. На следующий день, сливают раствор анти-тела и промыть клетки с 1x PBS три раза (5 мин каждая), как описано выше. Слейте PBS.
  14. Добавить 40 мкл на лунку разводили (1: 200) биотинилированного осла против мышиного IgG и родамин-конъюгированного с ослиного анти-IgG козьего в блокирующем буфере. Инкубировать в течение 1 часапри комнатной температуре.
  15. Вымойте клетки с 1x PBS три раза, 5 мин каждый. Добавьте 40 мкл разведенных (1: 400 в блокирующем буфере) флуоресцеина-конъюгированный стрептавидин в каждую лунку. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
  16. Вымойте клетки с 1x PBS три раза, 5 мин каждый. Добавить 40 мкл на лунку DAPI (300 нМ в блокирующем буфере), и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  17. Вымойте клеток с 1x PBS в два раза и оставить клетки в 40 мкл 1x PBS. Планшет теперь готов для анализа.

Анализ репликации 7. β-Cell

Примечание: Протокол анализа должен быть установлен для высокого скрининга микроскопа контента, используемого для измерения репликации β-клеток. В своей простейшей композиции, этот протокол представляет собой анализ двухцветного где тождеством маркер используется для определения бета-клеток (PDX-1 + -клеток) и маркер репликации (Ki-67) используется для определения клеточного деления событий.

  1. Определение объектов (бета-клетки), основанные на averagе интенсивность флуоресценции PDX-1 окрашивания (549 нм фильтра) в пределах приблизительной окружности (длина: ширина <1,6) в пределах ожидаемой площади пикселя ядра β-клеток (рис 2А).
  2. Далее, установить параметры для выявления событий репликации (Ki-67-положительности) на основе средней интенсивности флуоресценции (485 нм фильтра) в пределах PDX-1 + области (рис 2B).
    Примечание: Время экспозиции должны быть установлены, чтобы позволить сравнения интенсивности пикселей через изображения. Параметры протокола анализа регулируют таким образом, что машина вызовы последовательно исключает неспецифическое окрашивание, мусора и клеточных агрегатов, которые могут отрицательно повлиять на качество данных.
  3. Анализ минимум 500 бета-клеток на лунку, чтобы максимизировать точность и предел изменчивости.
    Примечание: Индекс репликации базальный β-клеток в островковых культурах крыс, как ожидается, будет 0,5 - 3%. Как правило, 40 изображений на лунку, более чем достаточно, чтобы идентифицировать 500 -клеток.
  4. Перед анализомвся пластина, анализировать выбранный отрицательности (ДМСО обработанных) и положительного контроля (5-iodotubercidin [1 мкМ] или дипиридамола [15 мкМ]) -обработанной скважин для оценки достоверности протокола анализа. При анализе правильно установлено, положительные соединения управления вызывают по крайней мере двукратное увеличение доли репликации бета-клеток.
  5. Прочитайте всю пластину после того, как протокол анализа проверяется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки бета-клетки или репликацию α-клеток, необходим протокол анализа четыре цвета. Во-первых, объекты идентифицируются с помощью DAPI окрашивания (Channel 1, 386 нм). Далее, бета-клетки (событие 1) подсчитываются: объекты , которые со-экспресс PDX-1 + (канал 2, 650 нм) и пери-ядерный инсулин (канал 3, 549 нм). Впоследствии, тиражирование бета-клетки (событие 2) подсчитываются: бета-клетки (событие 1) , которые совместно выражают Ki-67 (канал 4, 485 нм) (рисунок 3...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные методы исследования молекулярных путей, которые контролируют рост β-клеток и регенерации являются важными инструментами для исследователей диабета. При этом, крыса-островок на основе скрининга платформа для идентификации и характеристики малых молекул стимуляторы репликации β-клеток представлена.

В то время как большинство аспектов этого протокола легко выполняются опытными исследователями, несколько шагов требуют определенной техники. Во-первых, во время островковых изоляц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIDDK DK098143 и DK101530 от NIH (JPA), Стэнфордского научно-исследовательского института детского здоровья Spectrum (CHRI) и SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
250 г мужской Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 см зубы тисуэ щипцыFine Science Tools11021-12
11,5 см тонкие ножницыFine Science Tools14058-11
14,5 см хирургические ножницыFine Science Tools14001-14
16 см изогнутые щипцыFine Science Tools11003-16
12 см изогнутый гепостатFine Science Tools13011-12
12 см ручка скальпеляFine Science Tools10003-12
Тканевое сито-30 мешBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375 000 единиц CDAVitaCyte005-1030
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (Ca++ и Mg++)Gibco24020-117
Кетамин HCl (200 мг/20 мл)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10для приготовления анестезирующего коктейля 
Ксилазин (5 г/50 мл)LLOYDNADA# 139-236для приготовления обезболивающего коктейля 
Histopaque 1077SigmaH-1077для получения histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119для создания histopaque 1100
Сыворотка для новорожденных телят 500 млHycloneSH30118.03
Сбалансированный раствор соли ХэнксаHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose HycloneSH30021.01
 Mediatech99-768-CV
RPMI1640 медиа HycloneSH30096.01для изготовления кондиционированной среды
804G клеточная линия рака мочевого пузыря крысыДоступно по запросудля изготовления кондиционированной среды
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированнаяGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Пенициллин (5,000 МЕ/мл/Стрптомицин (5 мг/мл) MP Biomedicals1670049
Формамид 500 млFisher BioReagentsBP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 мл (pH 6.0)Vector LaboratoriesH-3300для изготовления 0,15 М раствора ситтрата натрия
Декстроза, безводныйEMD ХимикатыDX0145-1для приготовления 1 М раствора глюкозы
Nomal Donkey Serum (порошок)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Мышиное антитело против человека Ki67BD Biosciences556003
козье антитело против человека PDX-1R& D SystemsAF2419
Поликлональное антитело против инсулина морской свинкиDako2016-08
Поликлональное антитело против глюкагона кроликаDako 2014-06
Поликлональное антитело против соматостатинакролика Dako2011-08
Поликлональное куриное антитело против виментинаabcam ab24525
Biotin-SP-конъюгированное, Donkey Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 конъюгированный InvitrogenS32354
Родамин-конъюгированный Donkey Anti-Goat IgG;Jackson ImmunoResearch705-025-147
Родамино-конъюгированный ослик против морской свинки IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
Родамин-конъюгированный Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-конъюгированный Donkey Anti-Guinea Pig IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-конъюгированный Donkey Anti-Goat IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-конъюгированный Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-конъюгированный Donkey Anti-Chicken IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Одноразовый резервуар для реагентов 25 млSorenson BioScience39900
384 лунка, черный/прозрачный, обработанный культурой тканейпланшет BD Falcon353962
96 лунка, черный/прозрачный, обработанный тканевой культурой планшетCostar3603
Многоканальный пипетторCostar4880
12-канальный вакуумный аспираторDrummond3-000-096
Скребок для ячеекFalcon353085
водяной бане Isotemp модель 2223 Прибор для скрининга с высоким содержанием золота от Fisher Scientific
: ArrayScan VTIThermo Scientific
Решение для функциональности и жизнеспособности

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600(2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ki 67384

Похожие статьи