Методическая статья

Очищенные визуализации эмбрионального и постнатального Сердца в одноклеточные Разрешение

DOI:

10.3791/54303

⸱

7 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протокол для объемного изображения флуоресцентных белков, меченных белком, глубоко внутри интактного эмбрионального и постнатального сердца. Используя методы очистки тканей в сочетании с окрашиванием по всей монте, можно четко и точно визуализировать отдельные флуоресцентные клетки, меченные белками, внутри эмбрионального или постнатального сердца.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одно клоновая трассировка и анализ на уровень целого сердца может определить сердечный поведение и дифференцировку клеток-предшественников во время развития сердца, а также позволяют при изучении клеточной и молекулярной основе нормальных и ненормальных сердечной морфогенеза. Последние новые технологии ретроспективных отдельных клоновых анализов делают исследование сердца формообразования при разовом разрешении клеток осуществимо. Однако непрозрачности ткани и рассеяние света сердца как глубина изображения увеличивается Hinder визуализации целого сердца в одной резолюции клетки. Для преодоления этих препятствий, клиринговую систему целого эмбриона, который может оказывать сердце высоко прозрачной как для освещения и обнаружения должны быть разработаны. К счастью, в последние несколько лет, было зарегистрировано много методик для целого организма клиринговых систем , таких как CLARITY, Sca ле, SeeDB, ClearT, 3DISCO, кубические, DBE, Бабб и ПАКТ. Эта лаборатория заинтересована в клеточных и молекулярных механизмов картыIAC морфогенез. Недавно мы установили одноклеточной родословие трассировку через ROSA26-Cre ERT2; система ROSA26-конфетти , чтобы разреженно клеток меток во время развития сердца. Мы адаптировали несколько целых эмбрионов очистив методик , включая Sca ле и кубика (четкое, беспрепятственное коктейлей изображения мозга и компьютерного анализа) , чтобы очистить эмбрион в сочетании с целой горы окрашиванием к изображению отдельных клонов внутри сердца. Сердце было успешно отображены в одной резолюции ячейки. Мы обнаружили , что Sca ле может очистить эмбриональное сердце, но не может эффективно очистить послеродовую сердце, в то время как CUBIC может очистить послеродовую сердце, но повреждает эмбриональные сердце путем растворения ткани. Методы, описанные здесь, позволят исследование функции генов в одном разрешении клона во время остановки морфогенеза, который, в свою очередь, может выявить клеточные и молекулярные основы врожденных пороков сердца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечный морфогенез является последовательное событие , которое требует пространственно - временной организации четырех различных типов сердечных клеток - предшественников в различных секторах сердца, а также требует множественных генетических регуляторных сетей , чтобы организовать этот процесс для формирования функционального сердца 1,2. Сердечный спецификация, дифференцировка, структурирование, и камера Созревание регулируются кардиогенных транскрипционных факторов 3. Генетическая мутация или посттранскрипционная аберрация этих факторов в сердечных клеток - предшественников может привести либо к эмбриональной летальности или врожденных пороков сердца (ИБС) 4. Изучение сердечной морфогенеза требует понимания присущих структурных деталей в трех измерениях (3D) и одного меченого сердца клеток-предшественников линии отслеживании во время развития сердца будет способствовать пониманию сердечной морфогенеза. Ряд секций на основе методов томографии с высокой разрешающей способностью были разработаны в гое за последние несколько десятилетий в структуре 5,6 органа изображения; Однако эти методы требуют дорогие специализированные инструменты, обширный труд, и не хватает подробной структурной организации в одной резолюции ячейки в финале объемное изображение реконструировано 7,8.

3D объемные изображения на уровне одной клетки обеспечивает средство для изучения дифференцировки клеток - предшественников и клеточного поведения в естественных условиях 7. Тем не менее, рассеяние света ткани остается основным препятствием для визуализации клеток и структур в 3D глубоко внутри интактного сердца. Липиды являются основным источником рассеяния света, а также удаление липидов и / или корректировки разности показателей преломления между липидами и окружающих их областей являются потенциальными подходы к повышению прозрачности ткани 8. За последние несколько лет, был разработан ряд методов клиринговых ткани, которые уменьшают прозрачность ткани и рассеяние света, как Бабб (бензиловый спирт и бензиловый бензоате смеси) и DBE (тетрагидрофуран и dibenzylether); но в этих методах, тушение флуоресценции остается проблемой 8-10. Растворитель на основе гидрофильных методы, такие как SeeDB (фруктоза / тиоглицерин) и 3DISCO (дихлорметан / dibenzylether), сохраняют флуоресцентные сигналы, но не оказывают весь орган прозрачный 7,8,11. Для сравнения, метод ЯСНОСТЬ ткани клиринговые делает орган прозрачным, но это требует специализированного устройства электрофореза для удаления липидов 8,12, как это делает ПАКТ (пассивная техника ясности), что также требует гидрогель вложения 7,13. Для получения более подробной информации о всех доступных методов тканевой очистки, обратитесь к таблице 1 в Ричардсона и Лихтман и др. 7.

В 2011 году , Хама и др. Обнаружили по счастливой случайности гидрофильную смесь 'Le SCa фирмы ' (мочевина, глицерин и тритон Х-100 смесь) , что делает мозг мыши и зародыша transparлор при полном сохранении флуоресцентные сигналы от меченных клонов 14. Это позволяет визуализации интактного мозга на глубине нескольких миллиметров и крупномасштабной реконструкции нейрональных популяций и прогнозов на субклеточном резолюции. Susaki и др. дальнейшее улучшение Sca ле путем добавления аминоспирты и разработал 'КУБИЧЕСКИЕ' (четкое, беспрепятственное коктейли визуализации мозга и компьютерного анализа) способ очистки ткани, что позволило увеличить фосфолипидов солюбилизации, сокращение времени клиринговую и позволило многоцветной флуоресцентной визуализации 8. В настоящем исследовании, воспользовавшись Sca ле и кубические методы клиринговых ткани и высокое разрешение 3D оптический секционирования, отдельные клоны внутри сердца во время кардиогенеза были прослежены с помощью Rosa26Cre ERT2 15, R26R-конфетти 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19 и Rosa26-mTmG (mTmG) 20 линий мыши. Сочетание метода целом крепление окрашивание (WMS) разработан ранее 21,22 с тканевых методами клиринговых далее разрешенное для окрашивания других белков в маркированных клонов и для изучения их поведения в 3D - мерную контексте. Сочетание очистки ткани и ЗЦМ позволяет для лучшего понимания роли различных генов и белков во время развития сердца и этиологии врожденных пороков сердца. Этот протокол может быть применен для изучения другой дифференцировки клеток-предшественников, клеточного поведения и органа морфогенеза события в процессе разработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) в Олбани Медицинский Колледж по и осуществляется в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Решение Препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Конфетти 16, αMHC-Cre 17 и Rosa26-mTmG (mTmG) 20 линий мышей были приобретены коммерчески cTnT-Cre 18 был подарок от доктора Jiao в Университете штата Алабама Nfatc1-Cre.. был подарок от доктора бен Чжоу в колледже Альберта Эйнштейна медицины 19. Мышей подвергали эвтаназии путем ингаляции диоксида углерода в закрытой камере в течение не менее 60 секунд, после физических средств проверки смерти по двусторонним торакотомии, обезглавливание или цервикальной дислокации.

  1. Подготовка тамоксифен. Растворите 10 мг тамоксифена в 10 мл подсолнечного О.И.л. После того, как он полностью не растворится, аликвоты и хранят при -20 ° С.
  2. Готовят забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Растворите Na 2 HPO 4 (1,41960 г), КН 2 РО 4 (0,24496 г), NaCl (8,0669 г) и КСl (0,20129 г) в 1 л дистиллированной воды и доведения рН до 7,4.
  3. Готовят PBST: 0,1% Tween-20 в PBS, раствор путем растворения 100 мкл Tween-20 в 100 мл PBS.
  4. Подготовка блокирующего буфера. Сделать 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) блокирующего раствора растворением 3 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл PBST, содержащем 0,2% Tween-20.
  5. Подготовьте CUBIC-1 (реагент 1). Смешайте 25 мас% мочевины, 25 мас% N, N, N ', N'-тетракис (2-гидроксипропил) этилендиамина и 15 мас% Тритон Х-100 в дН 2 O.
  6. Подготовка CUBIC-2 (реагент 2). Смешайте 50 мас% сахарозы, 25 мас% мочевины, 10% вес 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol и 0,1% (об / об) Тритона X-100 в дН 2 O.
  7. Готовят ле A2 количество присадок SCA: 4 М мочевины, 10% вес / об глицерина и 0,1% вес / об Triton X-100 в дН 2 O. Доводят рН до 7,7.
  8. Приготовьте Sca ле B4: 8 М мочевины и 0,1% вес / об Тритон Х-100 в дН 2 O. Доводят рН до 8,7.
  9. Готовят Sca ле 70: 4 М мочевины, 70% вес / объем глицерина и 0,1% вес в дН 2 O. / об Тритона Х-100

2. Тамоксифен Индукционная, Эмбрион Выделение и фиксация

  1. Тамоксифен Индукционные и Эмбрион Изоляция
    1. С помощью изогнутой трубки подачи утвержденного протокола (ACUP 13-12007), через желудочный зонд самки мышей R26Cre ERT2 конфетти (закупорки R26Cre ERT2 мышей - самцов) с 10 мкг / г тамоксифена в день эмбрионального развития E7.75 33. В день эмбрионального 9.5 (E9.5) или E10.5, усыпить самок мышей с CO 2 и цервикальной дислокации.
    2. После проверки смерти мыши (смотрите раздел 1 Note), откройте брюшную полость мыши с ножницами и рассечь из рога матки, удалить слои маточной трубы с помощью ножниц и пинцета и повторноаренда эмбрионов от 23,24 маточной трубы.
      1. Перенос эмбрионов в чашку Петри, содержащую PBS (рН 7,4). Под микроскопом рассекает, удалите не-эмбриональных слоев (хориона, желтка и амнион) с помощью пинцета.
    3. С помощью пинцета и ножниц, собирать самок мышей и эмбрионов хвоста образцы для генотипирования , как сообщалось ранее 22. С помощью пластмассовой пипетки перенос каждого эмбриона на лунку 48-луночного планшета, содержащего 1 мл 1х PBS.
    4. Под флуоресцентным микроскопом, идентифицировать GFP / RFP / CFP положительных эмбрионов с помощью инвертированного микроскопа с камерой. Отслаиваться перикард с помощью пинцета и повернуть сердца / эмбриона с помощью изогнутых пинцета, чтобы определить количество флуоресцентных клонов с обеих сторон сердца с GFP / RFP / CFP фильтров. не требуется никаких сокращений.
  2. После выявления GFP / RFP / CFP положительных эмбрионов, быстро мыть эмбрионов в два раза (2 мин каждый) с 1x PBS в гое 48 хорошо пластины на шейкере при комнатной температуре (RT). Это позволит удалить лишнюю кровь.
  3. Закрепить эмбриона / эмбрионального сердца с использованием 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре. Время фиксации зависит от эмбрионального возраста и ткани размера. Для E9.5 фиксации эмбриона в течение 2 ч при комнатной температуре. Поздние эмбриональные стадии эмбрионов требуют больше времени фиксации, которая даже может быть продлен до 24 часов для послеродового сердца.
    ВНИМАНИЕ: параформальдегид токсичен, избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочки.
  4. После фиксации, вымыть эмбриона / сердце в 48 луночного планшета в два раза (10 мин каждый) с 1x PBS на шейкере при комнатной температуре. Это удаляет избыток PFA из эмбриона / сердца. Эмбрионы затем дополнительно обрабатываются для всей горы окрашивания и очистки ткани.

3. Всего горе Окрашивание

Примечание: После того, как PFA фиксации эмбриона / сердце подвергается всем горе окрашивания следующим образом.

  1. Проницаемыми эмбриона / сердце в 48 луночного планшета с использованием 1 мл 0,1% PBST в течение 2 часов на шейкере при комнатной температуре.
  2. После пермеабилизации, погружают зародыш / сердце в 1 мл блокирующего буфера, в течение 2 часов или в течение ночи на шейкере при температуре 4 ° С.
  3. Опустить эмбриональной / сердце к клеточно-специфической PECAM эндотелиальной антител (CD31), разбавленным (1: 100) в 0,3 мл блокирующего буфера в течение 48 часов на шейкере при температуре 4 ° С.
  4. Вымойте эмбриона / сердце с помощью PBST 5 раз, 30 мин каждый раз при комнатной температуре на шейкере. Это удаляет избыток неспецифическое связанного первичного антитела из ткани.
  5. Погрузитесь эмбриона / сердце в Alexa Fluor 647 козьего анти-крысиного вторичным антителом, разведенным (1: 1000) в 1 мл блокирующего буфера в течение 48 часов на шейкере при температуре 4 ° С.
  6. Повторите шаг 3.4 для промывки вторичного антитела.
  7. После фиксации эмбриона / сердце с 4% PFA в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере и дважды промывают PBS 5 минут каждый.
  8. Пятно зародыш / сердце с окрашивающим ядра 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (разведенного в PBST при ОБОГАЩЕНИЯРацион 0,01 мг / мл) в течение 10 мин на шейкере при комнатной температуре. Последующие с двумя PBS промывками 5 мин каждый.

4. Эмбрион / сердце Клиринг с Sca л е или метод с кубическим

Примечание: После того, как вся гора окрашивания, эмбрион / сердце подвергается либо Sca ле или метода КУБИЧНОЙ клирингового ткани. Выбор способа зависит от размера ткани и эмбриональном возрасте. Для E11.5 или более раннего возраста эмбрионов, использование Sca л е способ очистки ткани, в то время как для более старых эмбрионов или послеродовых сердца является предпочтительным методом КУБИЧЕСКИЙ клиринг ткани.

  1. Масштаб ткани Клиринговый Метод
    1. Выдержите зародыш / сердце с 1 мл ВОС л раствора е A2 в сцинтилляционный флакон (заворачивали в алюминиевую фольгу) , периодически слегка встряхивая (вручную) в течение 48 ч при температуре 4 ° С.
    2. После того, как Sca л е А2 инкубации инкубировать эмбриона / сердце 1 мл Sca л раствора е B4 при 4 ° С в одном флаконе с редкими осторожном встряхивании для anotее 48 ч.
    3. Выдержите эмбриона / сердце еще 48 ч с 1 мл Sca л е 70 при 4 ° С при периодическом осторожном встряхивании. Маунт-эмбрион с использованием 90% глицерина (смотри раздел 5.1).
  2. CUBIC ткани Клиринговый Метод
    1. Для всего сердца эмбриона / КУБИЧНОЙ очистки, погрузить каждого эмбриона / сердце в 1 мл КУБИЧНОЙ-1 с редкими осторожном встряхивании в течение 48 ч при температуре 37 ºC 7. Через 48 ч заменить раствор с тем же объемом свежей КУБИЧНОЙ реагента 1, и инкубируют образец еще в течение 48 ч при 37 ° С при периодическом встряхивании с рукой.
    2. Вымойте кубическая-1 обработанную сердца / эмбриона с 1x PBS несколько раз при комнатной температуре при осторожном встряхивании с рукой. Это удаляет избыток раствора КУБИЧЕСКИЙ-1.
    3. После того, как вымывание CUBIC-1 с PBS, погружают / эмбрионов сердца в кубическом-2 раствора (1 г на эмбриона / сердца) в течение 48 ч при 37 ° С с редкими осторожном встряхивании с рукой. Это следует эмбриона / сердце для монтажа с использованием глицерина (смотри раздел 5.2).

5. Пример монтажа и обработки изображений

Примечание: Очищенные зародыши или органы в Sca л е 70 или кубического-2 раствора могут быть отображены непосредственно со шкалой 70 и кубические-2 раствора в качестве носителя изображения, соответственно. Тем не менее, принимая во внимание уязвимость эмбриональных образцов очищающих реагентов, если образцы не будут отображены сразу, но сохраняются в долгосрочной перспективе, хранить образцы в 90% глицерина соответствии с приведенным ниже протоколом.

  1. Непосредственно погрузить Sca ле очищается образец в 1 мл 90% глицерина и хранят при температуре 4 ° С до визуализации.
  2. Промыть Кубическую обработанного образца с 1x PBS в два раза, 5 мин каждый и последовательно инкубирование образца с 1 мл 30%, 50%, 70% и 90% раствора глицерина каждый в течение 30 мин.
  3. Для получения изображений, переноса образца к стеклянным дном чашки Петри с минимальным количеством 90% глицерина и изображения клонов с помощью конфокального микроскопа, снабженного двумя возможностями фотонов.
  4. Изображение сердца или эмбрионов в глицерине с 10X / 0,3 NA, A 25X / 0,8 NA погружения, или 40X / 1.2 NA воды корректирующие линзы объектива а. Изображение DAPI с помощью 2-фотонной возбуждение от когерентного титана: хамелеона лазера сапфира. Выбор микроскопа и объектива будет зависеть от цели экспериментов, например , для супер-разрешением, легкий лист флуоресцентного микроскопа может быть использован.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация очищенную эмбриональное сердце

Позвоночной формирование сердца является spatiotemporally регулируется морфогенетического процесса и зависит от организации и дифференциации клеток - предшественников из четырех различных источников 1. Клетки из первого сердца области кардиального полумесяца сбросит к вентральной срединной линии, чтобы сформировать линейную сердечную трубку. Клетки из второго поля сердца, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение эмбриона является очень важным шагом. E9.5 эмбрионов очень хрупкие и небольшие по размеру, поэтому дополнительные следует позаботиться, чтобы не повредить структуры эмбриона / сердца во время изоляции. Не связанные с эмбриональными дополнительные слои, огибающие эмбриона / сердце следует осторожно удалить, особенно при визуализации всего эмбриона. Это позволяет проникновение антител и очистки смеси глубоко внутри эмбриональных тканей, а также помогает в устранении фонового сигнала при визуализации. Множественн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лаборатории M.W. за научную дискуссию. Эта работа поддержана грантами AHA [13SDG16920099] для M.W. и грантами Национального института сердца, легких и крови [R01HL121700] для M.W. Изображения были получены в центре визуализации в Медицинском колледже Олбани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2′,2′ '-нитрилотриэтанол Sigma Aldrich90279
4% параформальдегида в PBSAffymetrix19943
BSAFischer Scientific 
N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксипропил) этилендиамин Сигма Олдрич122262
фосфатный буфер физиологический растворСигма ОлдричP5368-10ПАК
Тритон X-100Sigma AldrichT8787
МочевинаSigma AldrichU-1250
СахарозаSigma Aldrich84097
ГлицеринSigma AldrichG8773
ТамоксифенSigma AldrichT5648
Подсолнечное маслоSigma AldrichS5007
Tween 20Sigma AldrichP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 
Alexa Fluor 647 InvitrogenA-21247
DAPI ядерный красительSigma AldrichD9542
37oC ИнкубаторThermoscientific FischerHeratherm, компактные микробиологические инкубаторы
48 лунок планшетыCell Treat229148
аналитические весыMetler ToledoPB153-S/FACT
Confocal микроскопZeissZeiss 510 конфокальный микроскоп
Disecting MicroscopeUnitronZ850
Флуоресцентный микроскопZeissObserver. Z1
Germinator 500 Стерилизатор со стеклянными шарикамиCellPoint ScientificGER-5287-120V
Источник светаSCHOTTACE I
Пара ножницFine Science Tools14084-08
Чашка Петри 60 мм x15 мм ТПП Техно Пластмассовые Изделия АГ93060
Рокер II  Платформа RockerBoekel Scientific260350
Сцинтилляционные трубкиFischer Scientific 03-337-26
Пипетка трансфернаяSamco Scientific202
ПинцетFine Science Tools11251-20
BP16000550274

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
  2. Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
  3. Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
  4. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
  6. Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  9. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916(2012).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
  18. Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
  19. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
  20. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  21. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  22. Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
  23. Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
  24. Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
  25. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  26. Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
  27. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
  28. Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
  29. Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
  30. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
  31. Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
  32. Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
  33. Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
  34. Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
  35. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ScaLeCUBIC

Похожие статьи