Методическая статья

Метод Targeted Выделение клеток с помощью стеклянной поверхности функционализации

DOI:

10.3791/54315

⸱

20 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает настраиваемую функционализацию поверхности системы дестиобиотин, стрептавидин и APTES с целью выделения конкретных типов клеток, представляющих интерес. Кроме того, в данной рукописи рассматриваются приложения, оптимизация и верификация этого процесса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из факторов, ограничивающих принятие и развитие персонализированной медицины, является невозможность разработки диагностических инструментов для исследования индивидуальных нюансов выражения от пациента к пациенту. Современные методологии, которые пытаются разделить клетки, чтобы заполнить эту нишу, приводят к нарушению физиологической экспрессии, что делает метод разделения бесполезным в качестве диагностического инструмента. В этом протоколе мы описываем функционализацию и оптимизацию поверхности для захвата и высвобождения клеток. Эта функционализованная поверхность объединяет биотинилированные антитела со стеклянной поверхностью, функционализированной аминосиланом (APTES), дестиобиотином и стрептавидином. Высвобождение клеток облегчается за счет введения биотина, позволяющего вспомнить и очистить клетки, захваченные поверхностью. Это высвобождение осуществляется путем нацеливания на вторичную группу дестиобиотина, что приводит к гораздо более щадящей парадигме высвобождения. Это снижение агрессивных реагентов и сил сдвига уменьшает изменения в клеточной экспрессии. Функционализованная поверхность захватывает до 80% клеток в одноклеточной смеси и продемонстрировала 50% захвата в двухклеточной смеси. Исследуется применение этой технологии к ксенотрансплантатам и исследованиям по разделению рака. Также описаны методы количественной оценки для верификации поверхности, такие как считыватель пластин и анализ ImageJ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современные стендовые подходы разделения клеток (например, сортировка 1 флуоресценция активированных клеток, лазерная захвата микро-рассечение 2, иммуно-магнитного шарика разделения 1) может занять несколько часов подготовки и сортировки. Эти большие временные масштабы могут влиять на физиологические уровни реагирования и экспрессии, в результате анализов , которые не являются репрезентативными физиологической реакции 3. Необходимы системы, которые могут быстро и эффективно изолировать специфические типы клеток, не нарушая рецептор-уровни клеточной поверхности с целью улучшения выделения клеток и обогащения для биомедицинских применений. Таким образом, логическое обоснование нашего подхода заключается в том, чтобы разработать мягкий подход для выделения клеток.

"Лаборатория на чипе" Концепция предлагает обещание порядков быстрее выделения клеток (ч-к-минут), и чаще всего включает в себя захват клеток на поверхность и отпускание клетки или внутриклеточной ConteNTS через физические 4,5 или химическими методами 6. Хотя эти подходы предлагают несколько преимуществ , таких как определение экспрессии белка 7,8, определение экспрессии РНК 9-11 или даже обеспечивая клетки для культуры в пробирке 12,13, многие из этих методов не может быть переведен в диагностике таких как клеточного рецептора профилированием из - за их не-физиологических условиях. Ферментные подъемные средства , такие как коллагеназы могут также влиять на эти величины 14,15 рецепторов, а это означает методы количественной оценки клеточного рецептора , которые используют эти подъемные агенты не будут генерировать точные физиологические данные. Клеточный лизис предотвращает дифференциацию между носителями поверхностных рецепторов, и те , которые ранее были усвоены 16. Этот протокол описывает быстрый и мягкий подход для выделения клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка поверхности стекла и приготовления реагентов

  1. Поместите стеклянную поверхность в плазменной машине кислорода в течение 5 мин при 50% мощности, чтобы очистить его.
  2. Приготовьте раствор восстановленного (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) 2,5 мл 2%, путем добавления 50 мкл APTES и 2,45 мл этанола в конической трубе.

2. APTES и DSB Функционализация

  1. Добавьте раствор APTES к поверхностям. Пипетка 150 мкл на лунку в течение 8-луночные планшеты. Пипеток 100 мкл на лунку для 24-луночные планшеты. Пипетировать 1,1 мл для стеклянной посуды 60 х 15 мм. Покрытие поверхности для предотвращения испарения и неравномерное распределение раствора APTES. Поместите поверхности на платформе шейкера в течение 50 мин при комнатной температуре, что создает равномерное распределение слоя APTES.
    Примечание: APTES является аминосилан, который образует первый слой поверхности. При использовании другого поверхность, эвристически определить объем раствора, необходимого для покрытия поверхности.
  2. Выберите температуру печи, а поверхности находятся на шейкере: Нагревают до 55 & deg; С в течение 2 ч в течение 8-луночные планшеты и 24-луночные планшеты. Тепло стекла только блюда до 90 ° С в течение 1 ч.
  3. Промыть поверхности с этанолом.
    1. Администрируйте количество этанола, требуемого реферирования на основе на поверхности, используемой. Добавьте 150 мкл этанола в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Добавьте 125 мкл этанола в каждую лунку 24-луночных планшетах. Добавить 1,1 мл этанола для стеклянной посуды.
    2. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Промыть два раза больше при использовании этанола.
      Примечание: Если какой-либо из стеклянных пластин забоя скважины имеют любой пластик в них, не нагревать их выше 65 ° С, так как пластик начнет плавиться и деформироваться.
  4. Сухой газ 100% азота, распределяемой из бака. Поместите поверхности в одостопочтенный
  5. Приготовьте 2,5 мл раствора D-desthiobiotin (DSB) путем объединения 1,5 мг / мл DSB в 37.5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), и 5 мг / мл 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), в 2462.5 мкл 0,1 М гидрата 4-morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) (рН 6) буфера. Затем объединить оба решения.
  6. Добавить 1 мкл 2 & beta; меркаптоэтанола, через 15 мин в раствор для гашения реакции между DSB и EDC. Удалить горячие APTES функционализированные стеклянных поверхностей из печи. Подождите 5-10 минут для стеклянных поверхностей для охлаждения.
  7. Добавить MES буфер поверхность для полосканий, используя данные, основанные на поверхности. Добавьте 150 мкл MES-буфер в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Добавьте 125 мкл MES-буфер в каждую лунку 24-луночных планшетах. Добавить 1,1 мл MES буфер для стеклянной посуды.
  8. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно 70 ° угол, так что наконечник непосредственно не указалв поверхность. Промыть два раза больше с буфером MES.
  9. Нанесите раствор DSB на поверхности, чтобы позволить им инкубировать. Добавьте 150 мкл раствора DSB на лунку в течение 8-луночные планшеты. Добавьте 100 мкл раствора DSB на лунку на 24-луночные планшеты. Добавить 1,1 мл для стеклянной посуды DSB раствора.
  10. Поместите DSB покрытые стеклянные поверхности на влажным бумажным полотенцем внутри чашки Петри. Накройте крышкой и инкубировать в 4 ° C холодильнике в течение 18-24 ч.

3. Стрептавидином Функционализация

  1. Промойте каждую поверхность стекла три раза 1 мл 1.0x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS). Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Развести стрептавидин (SAV) исходного раствора до 0,4 мг / мл (рекомендуется).
    Примечание: PBS, изотонический, поэтому он может быть использован в качестве средства для разбавления и ополаскивания. PBS, используется в качестве растворителя для САv, и, следовательно, не будет влиять на способность SAV связываться с поверхностью.
  2. Применяют 0,4 мг / мл раствора САВ равномерно на поверхности таким образом, чтобы тонкий слой форм в нижней части стекла, выбрать количество раствора, основанного на поверхности. Для 8-луночные планшеты, добавляют раствор САВ 150 мкл 0,4 мг / мл на лунку. Для 24-луночные планшеты, добавляют раствор САВ 100 мкл 0,4 мг / мл на лунку. Для стеклянной посуды, добавляют 1,1 мл 0,4 мг раствора SAV / мл.
  3. Накройте и перемещать пластины на 14 см чашку Петри, чтобы сохранить влагу. Выдержите чашку Петри в холодильнике в течение 18-24 ч.
    Примечание: Необходимо использовать последовательные объемы APTES, DSB и SAV на каждой поверхности.
  4. Промойте каждую поверхность стекла в три раза с 150 мкл PBS для удаления SAV. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
  5. Смочите бумажное полотенце жIth де-ионизированной воды и поместите бумажное полотенце плоский в 14 см чашку Петри, окружающих пластины для удержания влаги в лунках. Накройте чашку Петри, содержащую лунки. Выдержите чашку Петри в 1-го уровня (BSL-1) холодильник 4 ° C по биобезопасности, пока не понадобится.

4. Ячейка захвата и освобождения

  1. Начнем с T175 колбу (ы) клеток, предназначенных для эксперимента. Аспирируйте носитель из колбы (ов). Промойте оставшиеся носители с 5 мл PBS при комнатной температуре. Отберите ПБС из колбы (ов).
  2. Добавьте 10 мл неферментативного подъемным агента, такого как для диссоциации клеток раствора, к Т-175 колбу клеток. Поместите колбу в инкубаторе в течение 6 минут, чтобы обеспечить для подъема клеток из колбы.
  3. Через 6 мин, добавляют 10 мл холодного Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS; см Перечень материалов), чтобы инактивировать подъемное средство. Выньте 20 мкл клеток для подсчета количества клеток в растворе с использованием гемоцитометра.
    Примечание: В зависимости от функционироваtionalized поверхности, используемые в эксперименте захвата, количество клеток необходимо меняется. Для получения функционализированных 8-луночные планшеты, используют 300000 клеток на лунку. Для получения функционализированных стеклянной посуды, используют 1,1 миллиона клеток. Для функционализированных 24-луночные планшеты, рекомендуется 125000 клетки. Более подробную информацию о подсчете клеток содержится в Приложении.
  4. Повторите шаги 4.1- 4.3 для другой колбе клеток, если меньше клетки присутствуют, чем это необходимо для эксперимента. Смешайте суспензии клеток и повторного подсчета клеток, чтобы получить общее количество клеток в растворе.
  5. Спин вниз суспензии клеток в центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы получить осадок концентрированных клеток. Найти соответствующее количество HBSS , чтобы добавить к суспензии клеток , чтобы получить концентрацию 1 × 10 6 клеток на мл, затем аспирата супернатант из осаждали клетки, и добавьте расчетный объем. Этот объем можно рассчитать с помощью уравнений в приложении.
  6. Пипетка вверх и вниз (растирают) суспендирование тысе клетки в растворе и снижают клеточный комков в растворе, что может уменьшить связывание антитела. Разделить сотовую раствор в отдельный контрольных и экспериментальных решений. Просмотр Дополнительный файл для компонентов и расчетов.
  7. Добавьте биотинилированные антитела к соответствующим решениям клеток, как это описано в Дополнительной файл. Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С на конец сравнению с аналогичным периодом конца миксером.
    Примечание: В случае клеток MCF7GFP, 0,5 мг / мл hIgG или 0,5 мг / мл по HLA-ABC антител рекомендуется. Для RAW макрофаги, 1 мг / мл mCD11b рекомендуется на половину объема для учета различий разбавления. Для пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs), 0,5 мг / мл рекомендуется hCD31.
  8. Промыть функционализированного поверхность стекла с HBSS. Для этого эксперимента, 8-луночный планшет рекомендуется.
    1. Добавьте 150 мкл HBSS в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Промыть два раза больше, используя HBSS. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины.Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Держите холод при 4 ° С.
  9. Добавьте растворы клеточных в лунки и подождать 45 мин для клеток инкубировать на льду на шейкере. Сделать раствор биотин в стерильной HBSS с использованием вычисленных объемов, как описано в Приложении.
  10. Удалите раствор клеток из стеклянных скважин с помощью HBSS.
    1. Аккуратно пипеткой 150 мкл HBSS в каждую лунку. Затем пипеткой вне HBSS. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
    2. Повторите еще два раза. После промывки добавляют HBSS в лунки, чтобы сохранить клетки влажным.
  11. Добавить 150 мкл 20 мМ раствора биотина для каждого соответствующего выпуска скважины, а затем ждать 20 минут, чтобы для реакции.
  12. Вспоминайте неспецифически связанного клеткис промывкой HBSS, как указано выше, а затем, если с использованием флуоресцентно меченых клеток, перейти к флуоресцентного изображения клеток. Также изображение живые клетки в колбу (в качестве контроля для сравнения с клетками в лунку). При использовании зеленого флуоресцентного белка (GFP), трансфектированных клеток, возбуждение будет 470 нм, а излучение будет 515 нм.

5. Оптимизация Антитело: Антитело титрование

  1. Начните с подъема клетки из Т75 или Т175 колбу, как описано в шаге 4.1- 4.3.
    Примечание: Эти объемы откалиброван на 24-луночные планшеты, но могут быть изменены в соответствии с любых стеклянных поверхностей функционализированный посредством эвристического тестирования. Представитель титрование антител показан на рисунке 1.
  2. Граф клеток с использованием гемоцитометра, а затем спином вниз раствор клеток в конической трубе при 500 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Развести клетки до 1 миллиона клеток на мл, используя расчеты, описанные в Приложении.
  3. Разделить 1 мИллион клеток на мл раствора в шести различных растворов 500 мкл в различных центрифужные пробирки для антитела (Ab) решений.
    1. Развести антитела маточного раствора до 10 мкг / мл, 1 мкг / мл, 100 нг / мл, 10 нг / мл, 1 нг / мл. Создание элементов управления с помощью 100 мкл буфера (Stain азид PBS + 1% натрия + 1% БСА) и 500 мкл клеток для контроля, без Ab в нем. Для контроля заготовки (Нет Ab и нет клеток), не используйте раствор 300 мкл PBS.
      Примечание: ВНИМАНИЕ: Азид натрия является чрезвычайно токсичным, взрывчатые вещества, и крайняя следует соблюдать осторожность при его использовании. Пожалуйста, обратитесь к листам безопасности (MSDS) и использовать соответствующее оборудование для обеспечения безопасности.
  4. Объединение и инкубировать решения Ab с растворами клеток в конец сравнению с аналогичным периодом конца смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Промыть функционализованных 24-луночные планшеты с HBSS три раза. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пиPette примерно 70 ° угол, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
  5. Аликвотные 125 мкл каждого образца раствора в соответствующие APTES, ОУС, и SAv функционализированные хорошо. Инкубируйте при 4 ° С или на льду в течение 45 мин на поверхности стекла. Промыть поверхность с помощью HBSS три раза для удаления неспецифически прикрепленных клеток. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Не смывать нижний ряд, а те элементы управления.
  6. Добавьте 150 мкл HBSS в каждую хорошо промывают, поставить 24-луночные планшеты на льду, а затем использовать планшет-ридера для измерения флуоресценции GFP клеток (485 нм возбуждения / эмиссии 528 нм).

6. Оптимизация Cell: Cell титрование

  1. Поднимите клетки, как указано в пунктах 4.1 -4.3.
  2. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Спин вниз клетку таклюция в конической трубе при 500 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Развести клетки до 1 миллиона клеток на мл.
    Примечание: Более подробную информацию об использовании гематоцитометре можно найти в Приложении.
  3. Пипетка 1,6 мл из клеточного раствора для 1,6 миллиона клеток акций и место в конической трубе. Пипетировать 800 мкл клеток из клеточного раствора для 800000 клеток запаса и место в конической трубе. Пипетка 80 мкл из клеточного запаса для 80000 клеток акций и место в конической трубе. Пипетка 8 мкл из клеточного запаса для 8000 клеток акций и место в конической трубе.
    Примечание: Концентрации приведены на 8 измерений плашки, повторить при необходимости. Пример вывода пластины показан на рисунке 2.
  4. Возьмите четыре растворы и вращаются в центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Повторное приостановить все растворы в 400 мкл HBSS.
  5. Добавить 1,6 мкл 100 нг / мл антитела к 1600000 клеток на складе, 0,8 μл до 800000 клеток на складе, и 0,5 мкл на все другие акции. Выдержите антитела в течение 30 мин, в конце концов, через конец миксере в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Промыть функционализированного стеклянную поверхность с HBSS три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: луночный планшет функционализованный 8 рекомендуется для микроскопии количественной оценки, в то время как функционализированные 24-луночный планшет рекомендуется для планшет-ридер количественной оценки. Концентрацию антител на 8000 клеток на складе не была снижена, чтобы позволить фактором, ограничивающим поверхности захвата, чтобы не быть отсутствие антител в растворе, а захваченной свойства поверхности.
  6. Применить 150 мкл растворов образцов в каждую лунку. Нанести 1600000 клеток запас в первую колонну скважин с левой стороны. Примените 800000 клеток запас на второй колонке слева. Примените 80000 клеток запас в третьей колонке слева. Наконец применить 8000 клеток запас до последнего столбца. Инкубировать в течение 45 мин при 4 ° С на качалке.
    Примечание: 1,6 миллионаклетка запас служит в качестве самой высокой концентрации испытываемого, и в два раза превышает количество клеток, которые обычно используют в экспериментах разделения клеток (600000 клеток на лунку) 800000 клеток запас служит в качестве контроля для эксперимента, так как это типичная клеточная концентрация который используется в экспериментах отделения клеток (3000000 клеток на лунку). 80000 клеток запас служит разбавлении десятикратном испытать для более низких концентраций для клеточного захвата (30000 клеток на лунку). 8000 клеток запас служит сто кратное разведение, чтобы использовать в качестве теста для проверки нижнего предела клеточного разделения (3000 клеток на лунку).
  7. Смойте HBSS три раза. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Соберите все стирок.
  8. Изображение клетки по флуоресцентным микроскопом, при использовании 8-луночных планшетов, фотографировали друг сюрлица, и применять 150 мкл биотина на каждой поверхности в течение одного часа при 4 ° С на качалке. Через один час полоскать биотин выпуска скважин с HBSS, 3 раза, как и раньше. Соберите все промывок из скважин для подсчета с гемоцитометра и изображением высвобождения скважин.
  9. Применить 150 мкл 20 мМ раствора биотина избытка в соответствующие биотин высвобождения скважин в течение 1 часа, при использовании 24-луночные планшеты, а затем промыть те, лунки 3 раза HBSS. 24 количественной оценки луночных планшетов, используя планшет-ридер. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток из всех собранных также стирок.

Анализ 7. Изображение

Примечание: Программный пакет ФИДЖИ (http://fiji.sc/Fiji) рекомендуется для анализа изображений. Изначально изображения были преобразованы в черно-белое изображение, а затем яркость / контраст был изменен, чтобы выявить клетки.

  1. Загрузите изображение и преобразовать в оттенки серого, нажав на вкладку изображение, а затем прокрутите страницу вниз до "Type", а затем нажав4; 8 бит ".
  2. Увеличьте контрастность изображения, нажав на вкладку изображения, а затем прокрутки "Настройка". Нажмите на кнопку "Яркость и Контраст", а затем использовать полосы прокрутки, чтобы сделать клетки выделяются. При использовании флуоресцентных изображений, инвертировать изображения, чтобы сделать клетки более определенным.
  3. Загрузите плагин на ImageJ называется ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) для анализа изображений.
  4. Открыть ITCN. Когда появится диалоговое окно, которое предлагает пользователю с несколькими параметрами, чтобы оценить размер ячейки, установить минимальную ширину ячейки интерес в первую очередь. Нажмите кнопку "Detect Dark Пикс", если изображение люминесцентная и клетки затемнены.
  5. Установите пороговое значение в 2 первоначально, а затем нажмите кнопку "Count". Недавно подсчитаны версия изображения будет отображаться с красными точками очерчивания, где клетки были подсчитаны.
  6. Регулировка порога и ширины параметр, чтобы получить более точные данные по сотовой опреденг размер "ячейки". Примечание: Количество подсчитанных клеток будет в диалоговом окне справа. Изменение параметров даст различное количество подсчитанных клеток.
  7. Продолжайте перебирать порога и ширины параметров, пока хорошая оценка не будет достигнута по количеству клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот протокол , мы покажем захват клеток (рис 3а) и высвобождение клеток (рис 3C) клеток MCF7GFP, а также живые клеточные элементы управления (рисунок 4). Мы количественно захват клеток, а 60% и 80% были освобождены (3С). Когда мы расширили этот подход к смеси RAW 264.7 макрофагов и клеток MCF7GFP, 50% макрофагов RAW были захвачены (рис. 3D) и 80% RAW макрофаги релиз с 20 мМ биотина (ри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Улучшение методов выделения клеток способствует научных исследований в структурно-функциональных отношений в нейробиологии 18, стволовых клеток программирования в регенеративной биологии и ангиогенных сигнализации в сосудистой биологии 19. Действительно, первичная культура клеток 20 (например, HUVECs) в сосудистой биологии в основном осуществляется за счет использования методов выделения клеток. Изоляции клеток также в последнее время используется для количественного потока (qFl...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Американское онкологическое общество, Иллинойсское отделение (282802) и Национальный научный фонд CBET (1512598) за финансовую поддержку. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Дяньвэнь Чжан из Института Бекмана Университета Иллинойса за обучение в области микроскопии. Наконец, мы хотели бы поблагодарить Джареда Уэдделла, Стейси Чен и Спенсера Мамера за содержательные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(3-Аминопропил) триэтоксисилан (APTES)Acros Organics919-30-2Используется для изготовления 2% раствора APTES
Плазменный очиститель PicoDienerModel 1Очищает поверхности и позволяет связывать PDMS со стеклом
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Используется в качестве механизма высвобождения на поверхности клеточного захвата.
диметилсульфоксид (ДМСО)Британскиефармацевтические дома (BDH)BDH1115-1LPРастворяет DSB в растворе
1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC)Thermo-Scientific5 г: 22980<бр/> 25 г: 22981Активирует карбоновые кислоты и позволяет связывать белки с поверхностью стекла.
8-луночный предметный стекал без покрытияBD FalconСлучай 24: 354118
Случай 96: 354108		Используется в клеточных экспериментах с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss, таких как эксперименты по первоначальному захвату и количественному определению высвобождения
Стеклянное дно 24-луночных планшетовMatTekP24G-0-13-FИспользуется в клеточных экспериментах с использованием планшетного ридера, таких как эксперименты по титрованию антител и клеточного титрования
МеркаптоэтанолScience Lab60-24-2Используется для гашения реакции между EDC и
DSB 4-Morpholinoethanasulfonic acid Hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Используется для изготовления 0,1 M MES буфера для использования в реакции EDC
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Используется для отверждения слоев PDMS и APTES.
Шейкер Titramax 1000Heidolph13-889-420Используется для обеспечения равномерного распределения APTES по поверхностям.
1x Стрептавидин 5 мг [e7105-5мг]Proteo Chem9013-20-1Биотин-связывающий белок. Может вызвать раздражение.
Стеклянная тарелка 5 смFisher Scientific08748AИспользуется в исследованиях HUVEC, а также в будущих исследованиях профилирования.
Чашка Петри 14 см с крышкойSigma-AldrichZ717231Используется для хранения функционализируемых образцов и их транспортировки.
Клетки MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Хранятся в жидком азоте
RAW264.7 Мышиные макрофагиATCCTIB-71Подарены нам из лаборатории Смита в Университете Иллинойса. Хранится в жидком азоте.
TrypLELife Technologies12605036хранить в 100 мл при комнатной температуре
Dulbecco' s модифицированный Eagle mediumCell Media Facility в Школе химических наук UIUC50003PCПоставщик: Corning Nonminacids
Cell Media Facility в Школе химических наук UIUC25-025-CIУже добавлен в DMEM по установке. Поставщик: Corning.
Скребокдля клеток Fisher Scientific12-565-58Маленький 23 см 50 пак
Раствор для диссоциации клетокCorningMT-25-056CIИспользуется для неферментативного подъема клеток для использования в клеточных экспериментах
ГемацитометрHausser02-671-54Используется для подсчета клеток для количественного определения клеточных растворов и эффективности захвата и высвобождения.
БиотинAmresco58-85-5Используется для высвобождения клеток с поверхности.
HBSSСоздан по рецептуН/ДИспользуется для поддержания жизнеспособности клеток в суспензии, а также для промывки поверхностей с неспецифическим связыванием. Адаптировано из Протоколы Колд-Спринг-Харбор: В 500  мл, используйте 4  g NaCl, 0,2  г KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 и 0,5  г глюкозы. Добавьте воду DI, чтобы добраться до 500 мл процедите, а затем поставьте в холодильник.
Антитело HLA-ABCBioLegend311402Антитело, используемое для захвата клеток MCF7gfp
антитело hIgGBioLegendHP6017Антитело, используемое для захвата клеток MCF7gfp
MCF7 GFPCell BiolabsAKR-211Линия люминального рака молочной железы, которая была трансфицирована зеленым флуоресцентным белком.
Ассорти кониковThermo-Scientific15мл: 12-565-26850/15 мл пластиковые коники для хранения растворов и аликвот.
Вращатели мини-трубок (концевой миксер)Fisher Scientific05-450-127Используется для инкубации антител и смешивания других клеточных растворов с целью смешивания
Axiovert 200M (флуоресцентный микроскоп)Инвертированный флуоресцентный микроскоп Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M.
Обессоливающие колонны ZebaThermo-ScientificPI-87770Используются для очистки новых биотинилированных антител после использования набора для биотинилирования. Инструкции предоставлены по адресу: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificИспользуется для биотинилирования антител, чтобы обеспечить их интеграцию с поверхностью захвата
Планшетный считывательBioTekSynergy HTX Multimode ReaderИспользуется для количественного измерения интенсивности флуоресценции в экспериментах по титрованию.
, Клетки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cell Capture ReleaseBiotinylated AntibodiesDesthiobiotin StreptavidinAPTES Surface TreatmentCell Isolation MethodFluorescence Imaging AnalysisFlow Cytometry DownstreamTumor Angiogenesis ScreeningPersonalized Medicine Diagnostics

Похожие статьи