Методическая статья

Высокая пропускная способность гена Tagging в

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54342

⸱

12 августа 2016 г.

 ,  , 
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

В этой статье

Краткое содержание

Добавление метки к белку — это мощный способ получить представление о его функции. В этой статье мы описываем протокол эндогенной маркировки сотен белков Trypanosoma brucei параллельно, чтобы можно было достичь мечения на уровне генома.

Аннотация

Улучшения в масс-спектрометрии, секвенировании и биоинформатике привели к созданию больших наборов данных потенциально интересных генов. Мечение этих белков может дать представление об их функции, определяя их локализацию в клетке и позволяя идентифицировать партнеров по взаимодействию. Недавно мы опубликовали быстрый и масштабируемый метод создания клеточных линий Trypanosoma brucei, экспрессирующих меченый белок из эндогенного локуса. Метод был основан на полученной нами плазмиде, которая в сочетании с длинной праймерной ПЦР может быть использована для модификации гена для кодирования белка, помеченного на любом конце. Это позволяет помечать десятки белков трипаносом параллельно, способствуя крупномасштабной валидации генов-кандидатов, представляющих интерес. Эта система может быть использована для маркировки белков для локализации (с помощью флуоресцентного белка, эпитопной метки или метки электронной микроскопии) или биохимии (с помощью меток для очистки, таких как метка TAP (тандемная аффинная очистка)). В данной работе мы описываем протокол проведения ПЦР с длинным праймером и электропорации в 96-луночных планшетах с восстановлением и отбором трансгенных трипаносом в 24-луночных планшетах. С помощью этого рабочего процесса сотни белков могут быть помечены параллельно; Это на порядок лучше по сравнению с нашим предыдущим протоколом, и теперь стало возможным мечение на уровне генома.

Введение

Trypanosoma brucei является простейшим паразитом , который вызывает африканский trypanosomasis и Нагана человека у крупного рогатого скота. Т. brucei является идеальным организмом для анализа функции белка за счет сочетания высокого качества генома, многочисленные протеомики и транскриптомике наборов данных и хорошо разработанных молекулярных инструментов 1-3. Достижения в области протеомики и секвенирования привели больших наборов данных , которые выдвигают на первый план потенциально интересных генов 4-6; Тем не менее, многие гены имеют минимальную информацию, связанную с ними в существующих базах данных. Существует, следовательно, потребность в способе с высокой пропускной способностью, чтобы помочь белка функциональную характеристику.

Выражение помеченной белка может дать множество проникновения в суть зависит работа белка. Например, белок, помеченный флуоресцентным белком или эпитоп, может быть локализован с помощью флуоресцентной микроскопии, который дает информацию о том, где ProtEin может оказывать свое биологическое действие. В качестве альтернативы, белок с меткой ПВР 7, 8 или HaloTag Его тег может быть очищен для биохимических анализов и идентификации его партнеров взаимодействия.

Недавно мы разработали надежную методологию мечения T. brucei 9. Это используется длинный праймеров ПЦР для создания ДНК для трансфекции и позволил мечение десятков белков параллельно - значительное усовершенствование существующих протоколов. В настоящее время мы улучшили масштабируемость этого протокола в проциклической формах по порядку величины. Здесь мы представляем наш метод, где мы проводим ПЦР и трансфекции в 96-луночные планшеты, с восстановлением и отбора, происходящего в 24-луночных планшетах. Как сотни белков теперь могут быть помечены параллельно этот метод обеспечивает экономически эффективный и действенный метод мечения весь геном трипаносомы.

Протокол

1. 96-луночного Long Праймер PCR

  1. Предварительное замораживание 96-луночный ПЦР охладитель в -80 ° C морозильнике.
  2. В 10 мл пробирку, подготовить мастер - микс: 2 100 мкл DDH 2 O, 105 мкл ПЦР - класс ДМСО, 105 мкл 10 мМ дНТФ, 105 мкл pPOT шаблон (25 нг / мкл) 9, для общего объема 2415 мкл на пластины ,
  3. Алиготе 23 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета ПЦР.
  4. Добавьте 2 мкл 100 мкМ праймеров, объединенных в каждую лунку с использованием загружен P20 12 каналов многоканального пипетку. Уплотнительное кольцо с пленкой, место пластины на предварительно охлажденный охладителем PCR и позволяют заморозить в течение как минимум 20 минут при температуре -80 ° С.
  5. В 10 мл пробирку, готовят Master Mix B: 2,048 мкл DDH 2 O, 525 мкл 10х буфера, 52,5 мкл полимеразы для общего объема 2626 мкл на чашку.
  6. Снять пластину и ПЦР кулер от -80 ° C морозильнике.
  7. С помощью пластины еще на охладителе ПЦР, добавить 25 мкл Master Mix B на верхней части замерзалаN Мастер-микс для общего реакционного объема 50 мкл. Это время критично, и должна быть завершена до Mix А может растаять. Уплотнительную пластину с пленкой.
  8. Установить амплификатор следующим образом: 94 ° С в течение 10 мин, затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 65 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 2 мин с последующим конечным продленного периода от 72 & deg; С в течение 7 мин ,
  9. Загрузите пластину ПЦР после того, как блок достиг 94 ° С.

2. Проверка 96-луночного Long Primer ПЦР

  1. Литой большое 1% (вес / объем) агарозном геле в трис-ацетатном ЭДТА (ТАЕ) проточном буфере с 4 х 28-луночных гребенок давать гель с 4-мя рядами скважин. Align альтернативные зубы гребенки с кончиков многоканальной пипеткой 12 канала. Осторожно погрузите гель в ТАЕ буфере работает после того, как будут загружены полосы.
  2. Нагрузка 1 кб ДНК лестницы в 1 - й и 28 - й скважины каждой строки.
  3. Использование P20 12 каналов многоканального пипетку, перенесите 2 мкл продукта ПЦР режectly на каждую дорожку геля (фиг.1А). Делайте это быстро, чтобы уменьшить возможность загрязнения ампликонов.
    1. Загрузите продукты ПЦР из ряда А пластины ПЦР в нечетных полосах 1-го ряда геля (A1 - полоса 3, A2 - полоса 5 ...... A11 - полоса 23, А12 - дорожка 25) и загрузить продукты ПЦР из ряда в пластины ПЦР в четных дорожках 1 - го ряда геля (B1 - полоса 4, A2 - полоса 6 ...... B11 - полоса 24, B12 - дорожка 26).
    2. Загрузите ПЦР-продуктов из ряда C и D пластины ПЦР с использованием той же схеме, как описано выше, с ряда C в нечетные полосы и строки D в четных дорожках. Продолжайте загрузку шаблона до тех пор, каждую лунку пластины ПЦР не загружен на гель. загрузка ДНК буфер не требуется, чтобы загрузить этот гель.
  4. Поместите гель в проточной бак и заполнить бак с TAE работает буфер, пока гель не погружен в воду. Запуск при 100 В в течение 30 мин ивизуализировать с помощью УФ-просвечивания. Смотрите рисунок 1B для примера геля.
    Примечание: ПЦР-продукты можно хранить при -20 ° C в течение нескольких недель до трансфекции

3. 96-луночного Трансфекция

  1. Используйте T. brucei проциклической форма клеточная линия SMOXP9 10 для этой процедуры и расти в СДМ-79 средств массовой информации , содержащей 10% FCS 10.
  2. С помощью 1 × 10 7 клеток на трансфекцию ( в общей сложности 1,1 × 10 9 клеток) , когда мечения на N - конце белка и 2 х 10 7 клеток на трансфекцию ( в общей сложности 2,2 х 10 9 клеток) , когда мечения на С - конце белок. Поддерживать клетки в середине бревна (1,2 х 10 6 -1 × 10 7 клеток / мл) в течение нескольких дней до трансфекции и сбора клеток для трансфекции при плотности 5-8 х 10 6 клеток / мл.
  3. Разрешить замороженные продукты ПЦР для трансфекции оттаивают при комнатной температуре.
  4. Граф клеток с использованием гемocytometer или автоматический счетчик клеток.
  5. Гранула необходимое количество клеток в нескольких труб 50 мл при 800 мкг в течение 10 мин.
  6. После центрифугирования супернатант и отбрасывания клетки вновь суспендируют в 10 мл модифицированный cytomix (0,8 мМ EGTA, 24 мМ КСl, 0,15 мМ CaCl 2, 10 мМ калий - фосфатного буфера рН 7,6, 25 мМ HEPES-KOH рН 7,6, 2,6 мМ MgCl 2, 0,5% (вес / объем) глюкозы, 100 мкг / мл БСА, 1 мМ гипоксантина, 144 мМ сахарозы) на пробирку. Перенос всех растворов клеточных в одну пробирку и снова вращаться со скоростью 800 мкг в течение 10 мин.
  7. После центрифугирования, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в 23 мл модифицированного cytomix для конечной концентрации 5 × 10 7 клеток / мл.
  8. В то время как клетки вращаются, добавляют 1 мл SDM-79 средств массовой информации в каждую лунку 4 х 24-луночные планшеты для тканевых культур. Этикетка пластины AD и нарисуйте кольцо вокруг хорошо A1 на каждой пластине в перманентным маркером, чтобы помочь ориентации пластины.
  9. Подключите обработчик пластины к электропоратора. На electroporaтор блок установки напряжения до 1500 В, длительность импульса до 100 мкс, а число импульсов до 12 и интервал импульса до 500 мс. На обработчике пластины, установите счетчик импульсов в 1. Это гарантирует, что что электропораторе будет применяться один импульс для каждого из 12 столбцов для электропорации пластины.
  10. Использование Р200 12 каналов многоканальной пипетки перенос т ПЦР-реакции с пластины ПЦР в 96-луночных планшетах одноразовых электропорации, 4 мм, зазор.
  11. Когда клетки были центрифугировали и снова суспендировали до конечной концентрации 5 х 10 7 клеток / мл (этап 3.7), переносят в резервуар реагента. Пипетка 200 мкл раствора клеток в каждую лунку планшета с использованием электропорации Р200 12-канальный многоканальную пипетку, смешать с ПЦР-продукта с помощью пипетки.
  12. Использование ткани удалить все капли из верхней части пластины, чтобы избежать короткого замыкания.
  13. Нанесите герметизирующую пленку, представленную в упаковке пластины к верхней части пластины электропорации, позitioning его так, чтобы оставить отверстия для электродов, раскрытых в верхней и нижней части каждой колонки. Избегайте покрытия, поднятые точки, используемые для направления пленки.
  14. Загрузите электропорации пластины в обработчик пластины и закройте крышку. Нажмите 'Pulse' на блоке электропораторе.
  15. После электропорации, быстро передавать клетки из 96-луночного электропорации пластины до 4 х 24-луночных культуральных планшетах. Для передачи ячеек, использовать Р200 12-канальный многоканальную пипетку с любой другой наконечник без вести таким образом, что остальные 6 советов на одной линии с 6 рядами на культуральную чашку ткани 24-луночного. Передача электропорации клетки в 96-луночных планшетах electroporations в заранее определенной схеме 24-луночных культуральных планшетах (фиг.2А).
  16. Приготовьте наконечники пипеток P200 - для каждого 96-луночного трансфекция подготовить 2 коробки 96 советов с любой другой колонке удалены.
    1. Передача скважины A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 на электропорации 96-луночного планшета вномерного знака, ряд А 24-луночных тканевых культуральных планшетах, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 в строке B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 в строке C и D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 в строке D. После передачи каждого набора из 6 лунок из 96-луночного планшета на 24-луночный планшет, лунки в 96-луночный планшет, затем промывают сред из соответствующих лунок в 24- луночного планшета и промывку затем переносят обратно в лунки в 24-луночного планшета.
    2. Передача скважин Е1 / Е3 / E5 / E7 / E9 / Е11 на 96-луночного электропорации пластины на 24-луночный планшет B ряд А, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 в строке В, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 в строке C и H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 в строке D. После передачи каждого набора из 6 лунок из 96-луночного планшета на 24-луночный планшет, лунки в 96 -Ну пластины затем промывают сред из соответствующих лунок в 24-луночный планшет и промывную затем передается обратно в лунки в 24-луночный планшет.
    3. Передача скважины A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 на электропорации 96-луночного планшета к 24-луночного планшета C ряд А, B2 / B4 / B6 / B8 / В10 / В12 в строке В, С2 / С4 / C6 / C8 / С10 / С12 в строку C и D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 в строке D. После передачи каждого набора из 6 лунок из 96 -Ну пластины к 24-луночный планшет, лунки в 96-луночный планшет, затем промывают сред из соответствующих лунок в 24-луночный планшет и промывную затем передается обратно в лунки в 24-луночный планшет.
    4. Передача скважин Е2 / Е4 / Е6 / Е8 / Е10 / Е12 на 96-луночного электропорации пластины на 24-луночный планшет D ряд А, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12, в строке В, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 в строке C и Н2 / Н4 / Н6 / Н8 / Н10 / Н12 в строке D. После передачи каждого набора из 6 лунок из 96-луночного планшета на 24-луночный планшет, лунки в 96- -Ну пластины затем промывают сред из соответствующих лунок в 24-луночный планшет и промывную затем передается обратно в лунки в 24-луночный планшет.
  17. Использование инвертированного фазового контрастного микроскопа, исследовать 1 и из каждого столбца, чтобы проверить клетки. Там будет представлять собой смесь живых и мертвых клеток сзначительное количество остатков клеток. Живые клетки можно отличить от мертвых клеток, так как они будут яркими под фазово-контрастной микроскопии и будет двигаться.
  18. Поместите 24-луночные планшеты в чистой пластиковой коробке с крышкой, которая образует герметичное уплотнение. Поместите коробку в 28 ° C инкубатора.
  19. Между 6-8 ч позже, добавьте 1 мл SDM-79 с 10% FCS, содержащей 2x селективный антибиотик в каждую лунку. По нашему опыту, клеточные линии, где гены помечаются на N-конце устойчивы к более высокой концентрации селективного лекарственного средства. Таким образом, используя бластицидин в качестве примера, мечение на N-конце требует конечной концентрации 20 мкг / мл бластицидин и мечение на С-конце требует конечной концентрации 10 мкг / мл бластицидин.
    Примечание: трансгенные клеточные линии станут видны 9-10 дней после трансфекции.
  20. Проход по крайней мере в два раза в свежем наркотиков и средств массовой информации до проведения анализа. На фиг.2В показаны результаты типичного 96-луночного transfeфикция для мечения 96 различных белков на N-конце. Оценка каждой лунки с помощью фазовой контрастной микроскопии, чтобы определить, если он содержит здоровые, лекарственной устойчивостью клеток. Здоровая и содержит преимущественно (<95%) высоко активные клетки, которые являются яркими в фазу контракта микроскопии. Дальнейший анализ с помощью микроскопии эпифлуоресцентной или вестерн-блоттинга требуется, чтобы определить, является ли этот белок был успешно помечено.

Результаты

В этом представительном трансфекцией праймеры были сконструированы с использованием TagIt Сценарий Perl 9 и синтезированный на коммерческой основе . 96-луночный ПЦР проводили и проверки , как описано (фиг.1А); В этом примере, 95/96 ДЗП были успешными (Фигура 1В). По нашему опыту, повторяя неудачные реакции либо с исходными грунтовок или повторно синтезируется праймеров не приводит к успешной ПЦР.

Ампликонов переносили в 96-луночных планшетах электропорации для электропорации (фиг.2А) и затем переносили в 24-луночные культуральные планшеты для восстановления и селекции. После достаточного времени, чтобы позволить происходить отбор, лунки оценивали по выживаемости перед дальнейшим анализом. В этом примере, 88/96 скважины (92%) были положительными после отбора 15 дней.


Рисунок 1: Проверка длинных праймеров ПЦР (A) Шаблон для переноса продуктов ПЦР из 96-луночного ПЦР планшета в агарозном геле для проверки ПЦР.. (Б) представитель 96-луночный ПЦР гель проверки для мечения 95 генов на N - конце, и 1 ампликона , не содержащий 5 'ориентации гомологии выступать в качестве отрицательного контроля в трансфекцией. Образцы наносили на 1% (вес / объем) гель агарозы и решен при 100 V в течение 30 минут. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-1
Рисунок 2: 96-луночного электропорации и выбор (A) Шаблон для переноса электропорации клеток из 96-луночного электропорации Plat.е в 24-луночных культуральных планшетах. (В) схематическое изображение , показывающее типичный живой / мертвый скоринг после 15 дней селекции в 24-луночных планшетах. Зеленый представляет собой успешную трансфекцию, серый представляет собой хорошо только с мертвыми клетками. В этом примере, 88/96 (92%) скважин содержали успешно трансфицированные паразитов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Заметное улучшение в чувствительности протеомики и методов транскриптомике в последние 5-10 лет предоставил ценные данные о тысячах генов и их продуктов. Тем не менее, инструменты для решения функции этих белков не поспевают.

Пометка белок облегчает многочисленные эксперименты, чтобы определить свою функцию. Например, белок может быть слит с флуоресцентным белком в различных цветовых решениях, чтобы способствовать локализации и совместной локализации исследований. Теги разработаны для электронной микроскопии, такие как APEX2 или miniSOG 11,12, позволяют ультраструктурную локализации меченого белка. Метки к биохимии, такие как ТАР тег и ProtC-TEV-Prota (PTP) тег 7,13 возможность очистки комплексов , связанных с белком для идентификации партнеров по связыванию или в пробирке биохимических анализов.

Конкретные шаги, которые имеют решающее значение для успеха protocола: включение ДМСО в Master Mix ПЦР 1, замерзание PCR Master Mix 1 до добавления Master Mix 2, использование коммерческой полимеразы в Master Mix 2 и модификации буфера cytomix электропорации. По нашему опыту, необходимо использовать двойное количество ячеек для C терминала мечения трансфекциях, как для N терминала мечения трансфекциях для достижения аналогичной пропорции положительных скважин. Таким образом, все шаги должны быть выполнены, как описано.

Этот метод только, вероятно, будет успешным, когда трансфекцию насекомого проциклической формы трипаносом. Кровоток формы имеют более низкую эффективность 14 трансфекции, к тому же они, вероятно, умирают во время выбора из - за зависящей от плотности токсичности , которая не связана с селективным препаратом. Таким образом, наш предыдущий протокол представляет текущую наилучшую технологию для мечения кровотока формы трипаносом 9. Также вероятно, что трансЭффективность фекции будет варьироваться в зависимости от конкретного трипаносом изолята. Этот протокол был оптимизирован с использованием 927 SMOX проциклической формы - другие штаммы могут потребовать дополнительной оптимизации. Меры, которые могут увеличить вероятность успеха включают: увеличение количества ПЦР-ампликонов, увеличение числа клеток, включенных в трансфекции.

Мы представляем метод, где сотни белков могут быть помечена параллельно. Это облегчит крупномасштабные исследования по локализации и взаимодействия, дополняя существующие большие наборы данных и оказывает неоценимую информацию для сообщества. Грунтовка шаблоны доступны по запросу и список шаблонов плазмид доступна: http://www.sdeanresearch.com/

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

SD был поддержан стипендией сэра Генри Уэллкома [092201/Z/10/Z]. Эта работа финансировалась за счет грантов Wellcome Trust [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] профессору Киту Галлу. Мы хотели бы поблагодарить профессора Кита Галла за полезные беседы и идеи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ОлигонуклеотидLifeтехнологии только дляудаления соли (не используйте дополнительную очистку)
ДМСОРошВходит в комплект Expand HiFi PackДолжен быть ПЦР
класса dNTPлюбой авторитетный
Expand HiFi полимеразаRoche11759078001
BTX ECM830Harvard ApparatusElectroporator
Манипулятор HT-200Гарвардский аппаратHT-200Работает с 96-луночными электропластинами
MOS 96 ELECTROPLATE 4 ммГарвардский аппарат45-0452Электропластина для 96-луночной электропорации
Бластицидин S ГидрохлоридМелфорд3513-03-9
Гигромицин bЗолото Инвивогенant-hg-1
ФлеомицинМелфордP0187
225 см TC Колба, скошенное горлышко, фенольная крышкаAppletonwoodsBC006
24 луночные культуральные пластиныAppletonwoodsBC017
Eppendorf® ПЦР Охладитель, безледовая система холодного хранения для 96 луночных планшетов и ПЦР-пробирокSigma AldrichZ606634-1EA
96-луночный Multiply® ПЦР-планшет с боковой юбкойSarstedt72.1979.203

Ссылки

  1. Kelly, S., Reed, J., et al. Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci. Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).
  2. Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).
  3. Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA. RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).
  4. Alsford, S., Turner, D. J., et al. High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome. Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).
  5. Alsford, S., Eckert, S., et al. High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance. Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).
  6. Mony, B. M., MacGregor, P., et al. Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei. Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).
  7. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology. Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Los, G. V., Encell, L. P., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  9. Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids. Open biol. 5 (1), 140197(2015).
  10. Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor. Open biol. 2 (2), 110037(2012).
  11. Lam, S. S., Martell, J. D., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).
  12. Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS biology. , (2011).
  13. Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination. Eukaryotic Cell. , (2005).
  14. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96TAP

Похожие статьи