Методическая статья

Сравнение методов Хост клеточных белков Удаление табака с помощью Бланшировка интактных растений или путем термической обработки экстрактов

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 августа 2016 г.

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

В этой статье

Краткое содержание

Три тепла представлены методы осаждения, которые эффективно удалить более 90% белков клетки-хозяина (НСР) из экстракта табака до любой другой стадии очистки. Завод НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C.

Аннотация

Растения не только обеспечивают продуктов питания, кормов и сырья для человека, но также были разработаны в качестве экономичной системы производства для биофармацевтических белков, таких как антитела, вакцин-кандидатов и ферментов. Они должны быть очищены от биомассы растений, но хроматографические стадии мешают высокие концентрации белков клетки-хозяина (НСР) в растительных экстрактах. Тем не менее, большинство НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C, облегчающих последующую очистку целевого белка. Здесь три метода представлены для достижения осаждению тепла табака ВДС в или интактными, листьев или экстрактов. Побледнение неповрежденных листьев можно легко встроить в существующие процессы, но может оказать негативное влияние на последующих стадиях фильтрации. Обратное верно для осаждения тепла листьев экстрактов в сосуде с мешалкой, которая может улучшить производительность последующих операций, хотя и с основными изменениями в конструкции технологического оборудования, таких какГомогенизатор геометрии. И, наконец, установка теплообменника хорошо характеризуется с точки зрения условий теплообмена и легко масштабировать, но очистка может быть затруднена и может быть негативное влияние на емкость фильтра. Подход дизайн-оф-экспериментов могут быть использованы для идентификации наиболее релевантных параметров процесса, влияющих на удаление HCP и восстановление продукта. Это облегчает применение каждого метода в других платформ экспрессии и определения наиболее подходящего метода для данной стратегии очистки.

Введение

Современные системы здравоохранения все больше зависят от биофармацевтических белков 1. Производство этих белков в растениях является предпочтительным из - за низкой нагрузки патогена и большую масштабируемость по сравнению с традиционными системами экспрессии 2-4. Тем не менее, ниже по течению обработки (DSP) растительного происхождения, лекарственных средств может быть сложной задачей, поскольку подрывные процедуры извлечения приводят к высоким бременем частиц, мути превышающей 5000 нефелометрическая единиц мутности (модулей NTU), и клетка-хозяин белка (HCP) концентрации часто превышает 95 % [м / м] 5,6.

Сложные процедуры осветления необходимо удалить дисперсные частицы 7-9, но хроматографию оборудование является менее дорогостоящим для работы в режиме связывания-и-Элюции во время первоначального восстановления продукта , если есть более ранний шаг для эффективного удаления ВДС 10,11. Это может быть достигнуто либо путем осаждения белка-мишени с использованием flocculМуравьи 12 или с низким рН 13,14, а также в результате чего НСР в совокупности. Селективная агрегация рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы (RuBisCO), наиболее распространенным НСР в зеленых растениях , таких как табак (Nicotiana аЬасит), может быть ускорена добавлением полиэтиленгликоль 15, но это дорого и несовместимыми с большой -scale производства. Термообработка Было показано , что денатурации и выпадают в осадок более 95% табака ВДС, в то время как кандидаты вакцинных белок малярии , такие как Vax8 остаются стабильными в растворе 16-18.

Три различных подхода были использованы для достижения осаждения термически индуцированные табака ВДС: (I) бланширование, т.е. погружение интактных листьев в горячей жидкости, (II) с регулируемой температурой с мешалкой, и (III) , теплообменник ( Рисунок 1) 16. Для неповрежденных листьев, бланширование достигается быстрое и эффективное осаждение ВДС и также легкодля расширения и совместимо с существующими производственными процессами крупномасштабных , которые включают начальный шаг для мытья биомассы растений 19. В противоположность этому , с контролем температуры сосуды уже доступны в некоторых процессах , и может быть использован для термической обработки растительных экстрактов 20, но их масштабируемость и скорость передачи энергии ограничены , так как отношение поверхности к объему резервуаров постепенно уменьшается и становится непригодным в процессе масштабе. Теплообменник представляет собой технически четко определенной альтернативой нагревали с мешалкой , но требует обильный запас нагрева и охлаждения сред, например, пара и холодной воды, а также жестко контролируемой объемной скорости потока , который адаптирован к геометрии теплообменника и СМИ свойствами, например., удельная теплоемкость. В этой статье показано, как все три метода могут быть использованы для осаждения термически индуцированные табака ВДС и растений ВДС в целом. Создание и эксплуатация EACМетод ч в лабораторных условиях могут быть использованы для оценки их пригодности для более масштабных процессов. Основная задача состоит в том, чтобы определить адекватные модели масштаба вниз и рабочие условия для каждой операции, напоминающие устройства и условия, используемые в процессе серийного производства. Данные , представленные здесь , относятся к экспериментов , проведенных с трансгенных растений табака , экспрессирующих вакцины от малярии кандидат Vax8 и флуоресцентный белок DsRed 16, но этот метод также был успешно применен к N. benthamiana растения скоротечно экспрессирующие другие биофармацевтические белки 21.

А дизайн-оф-экспериментов (DOE) подход 22 может способствовать развитию процесса, и флокулянтов 23 также может быть полезным в этом контексте , как описано выше 8. Основное различие между бланширование, нагреваемых сосудов и теплообменников, что бланширование применяется к неповрежденным листьев на ранней стадии процесса, тогда как ВЗее наносят на растительные экстракты (рисунок 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1:. Схема процесса Схема Иллюстрируя реализации трех различных методов Tobacco HCP тепла Осадки Растительный материал промывают и гомогенизируют перед осветлением и очистки. Оборудование для бланширования (красного цвета), могут быть легко добавлены к существующей техники. В противоположность этому , используя перемешанную сосуд (оранжевый) и особенно теплообменник (синий) требуется один или несколько дополнительных устройств и трубок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. культивировать растений табака

  1. Промыть каждую шерсть блок минерал с 1 до 2 л деионизированной воды, а затем 1 л 0,1% [вес / объем] раствора удобрений. Поместите один семени табака в каждом блоке из минеральной ваты и осторожно вровень с 0,25 л раствора удобрений без вымывания семян 16.
  2. Культивировать растения табака в течение 7 недель в теплице с 70% относительной влажности воздуха, 16 ч фотопериода (180 мкмоль сек - 1 м - 2; λ = 400 - 700 нм) и 25/22 ° C свет / темный режим температуры.
  3. Заготавливают все листья, за исключением четырех семядольных листочков, которые расположены у основания стебля растения.

2. Необязательно: Heat Осаждение Бланшировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните действия, описанные в пунктах 2.1 до 2.12, чтобы осадить табака HCPS путем бланширования. Пропустить весь раздел 2, если будет осаждаются НСРв нагретом сосуде (раздел 4) или с помощью теплообменника (раздел 5).

  1. Отложите 50 г растительного материала и осуществляют добычу без бланширования (раздел 3). Возьмите пробу этого экстракта в качестве внутреннего контроля в ходе последующего анализа (раздел 7).
  2. Установить водяной бане 8-L рабочий объем, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизоляцией из пенополистирола ведра или аналогичный. Установить регулируемый термостат на водяной бане для последующего контроля температуры (шаг 2.7).
  3. Перенесите всю сборку на магнитную мешалке и помещают магнитную мешалку на водяной бане. Убедитесь в том, что магнитное поле является достаточно сильным, чтобы вращать мешалку.
  4. Окружите мешалку по меньшей мере, четыре опорных плиток, на которых полипропиленовый корзина (шаг 2.6) будут размещены позже во время процедуры бланшировки. Убедитесь , что опорные плитки выполнены из немагнитного материала (например, стальной сплав , содержащий никель нержавеющая) , и что онивыше , чем перемешивающий стержень (рисунок 2).
  5. Добавить 8 л деионизированной воды на водяной бане.
    Примечание:. Использование буфера, например, 50 мМ фосфата натрия (рН 7,5), может повысить урожайность белка - мишени , если количество осадков с низким рН является проблемой.
  6. Поместите 23 х 23 х 23 см полипропилен корзины на опорные плитки и убедитесь, что корзина не мешает вращению на размешать бар и что он полностью погружен в жидкость. При необходимости добавьте дополнительную воду / буфер, пока корзина не будет полностью погружен, а затем удалить корзины снова.
    ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 2.12 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая теплоизолированных перчатки.
  7. С помощью регулируемого термостата, чтобы довести ванну воды до 70 ° C (или температуры, необходимой для проведения экспериментов). Подождите, по крайней мере 15 минут после того, как требуемая температура будет достигнута, чтобы обеспечить всю сборку достиг Thermaл равновесие.
  8. Подготовьте 150 г аликвот из заготовленной листьев табака. Положите одну аликвоту в корзине, избегая при этом необратимое сжатие и повреждение листьев, например, путем разрыва. Избегайте переполнения корзины с растительным материалом или плотной упаковки последнего.
  9. Тщательно, но быстро погрузить корзины в горячей жидкости и поместите его на опорные плитки. Поместите блок из нержавеющей стали на верхней части корзины, чтобы предотвратить плавучесть.
  10. Выдержите листья в течение 5 мин в бланширования жидкости, или выбрать время устраивающего дизайн эксперимента. Монитор температуры жидкости в течение всего периода инкубации.
  11. Осторожно снимите корзины из бланширования жидкости и пусть остаточный слив жидкости из листьев в течение 30 сек. Затем возьмите листья растений из корзины, передать их в блендере и сразу же начать извлечение (раздел 3).
    Примечание: Растения могут храниться в течение длительного периода времени после того, как бланширование и до начала годобыча е, например, более чем на 30 мин на льду или замораживали при -20 ° С в течение нескольких недель была успешно протестирована. Тем не менее, стабильность продукта может снижаться с увеличением сроков хранения и, таким образом, рекомендуется немедленная обработка.
  12. Повторите шаги 2.8 до 2.11 со свежим листом материала, пока весь урожай биомассы не обрабатывается.

3. Белки экстракции из листьев табака

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги включают блендер с вращающимися лопастями. Не работать в блендере ведро в то время как он установлен на блендера двигателя.

  1. Поместите 150 г (сырой массы) заготовленной (этап 1.3) или бланшированные (этап 2.11) уходит в блендере и добавить 450 мл экстракционного буфера (50 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 10 мМ дисульфита натрия, рН 8,0).
    Примечание: Состав буфера экстракции зависит от белка , предназначенных для извлечения , и может , таким образом , требуют корректировки, например, использование другого рН или буфер компонент , такой как Trявляется.
  2. Перемешать листья в течение 3 х 30 импульсов сек с 30 сек перемежаются перерывы. Убедитесь в том, что листья гомогенизируют и не забивают блендера ведро. Остановите блендер и поднимите листья, чтобы предотвратить засорение при необходимости, а затем продолжить гомогенизацию.
  3. Возьмите пробу 1 мл каждого экстракта, который производится для последующего анализа (раздел 7). Если растительный материал бланшируют, перейдите к разделу 6. В противном случае продолжайте с осадками тепла в сосуде (раздел 4) или теплообменник (раздел 5), в зависимости от выбранного экспериментального подхода.

4. Необязательно: Тепло Осадки в перемешиваемом сосуде

Примечание: Провести шаги, описанные в разделах 4.2 до 4.11, чтобы осадить табака ВДС в сосуде с мешалкой. Пропустить весь раздел 4, если НСР были осаждают побледнение (раздел 2) или будет осаждают с помощью теплообменника (раздел 5).

  1. Установите два 8-L рабочий объем водыванны, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизолированной пенополистирола или аналогичный. В первой ванне, установите регулируемый термостат для последующего контроля температуры (шаг 4.6). Во втором случае, добавляют 5 л деионизированной воды и 2 кг льда для последующего охлаждения (этап 4.9).
  2. Перенести первую ванну воды на магнитной мешалке, и поместите 2-L сосуд из нержавеющей стали в ванну с водой таким образом, что центр судна совмещен с центром мешалке.
  3. Поместите магнитную мешалку в нержавеющей стали судна. Убедитесь в том, что магнитное поле является достаточно сильным, чтобы вращать мешалку.
  4. Наполните ванну водой деионизированной водой до 5 см ниже верхнего края сосуд из нержавеющей стали. Затем заполнить емкость с буфером для экстракции. Поместите пенополистиролом крышку на судне.
    ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 4.9 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая термически иновнерегулируемом перчатки.
  5. Вставьте термометр в сосуд из нержавеющей стали через Suiting отверстие в крышке пенополистирола. Установите температуру водяной бане до 78 ° С и инкубировать всю сборку в течение 15 мин для достижения теплового равновесия. Убедитесь, что температура в сосуде составляет 70 ° С, приблизительно на 8 ° С ниже заданного значения водяной бани.
  6. Если температура в сосуде из нержавеющей стали отличается от 70 ° C, регулировать температуру воды в ванне, соответственно, и позволить системе уравновешивания в течение еще 15 мин. Повторите этот шаг, пока температура в сосуде не 70 ° С или по мере необходимости для эксперимента, и опорожнить сосуд из нержавеющей стали.
  7. Налейте 300 мл экстракта (шаг 3,2) в нержавеющей стали сосуд, пока он еще в водяной бане и запустить таймер. Перемешать экстракта при 150 оборотах в минуту и ​​инкубировать в течение 5 мин. Убедитесь, что экстракт достигнет температуры 70 ° С в течение не менее 2 мин в течение этого периода инкубации.
  8. Удалите ванну с горячей водой из магнитной мешалкой, вынуть сосуд из нержавеющей стали и поместить его в ледяной ведро. Поместите последний на магнитной мешалкой и снимите крышку пенополистирола.
  9. Убедитесь, что гомогенат растение хорошо перемешивают со скоростью 150 оборотов в минуту, поместите термометр в экстракте и инкубировать, пока он не достигнет температуры 20 ° С или температуру, указанную в экспериментальной конструкции.
  10. Повторите шаги 4,7 до 4,9 для всех аликвот. Возьмите пробу 1 мл каждого осажденного нагреванием экстракта после достижения конечной температуры, а затем продолжить с разделом 6.

5. Необязательно: Тепло Осадки в теплообменнике

Примечание: Провести шаги, описанные в разделах 5.2 до 5,12 для осаждения табака HCPS помощью теплообменника. Пропустить весь раздел 5, если НСР были осаждают побледнение (раздел 2) или в нагретом сосуде (раздел 4).

  1. Установить два рабочего объема 8-Lводяные бани, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизоляцией из пенополистирола ведра или аналогичные. В первой ванне, установите регулируемый термостат для последующего контроля температуры (шаг 5.3). Во втором случае, добавляют 5 л деионизированной воды и 2 кг льда для последующего охлаждения (этап 5.10).
    ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 5.9 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая теплоизолированных перчатки.
  2. Заполните первую ванну воды с 8 л деионизированной воды. Установите температуру до 74,5 ° С с помощью термостата. Выдержите сборку в течение 15 мин для достижения теплового равновесия.
  3. Подготовьте изолированный сосуд для хранения путем размещения пластиковый стакан на 0,5 л в пластиковый стакан объемом 1 л и заполнить пробелы с ватой. В качестве альтернативы, использовать посвященный теплоизолированный сосуд с рабочим объемом 0,5 л.
  4. Подключение теплообменника к перистальтического насоса на одном конце и выпускной шланг на флористикуг конец с помощью L / S 24 трубки. Поместите обе трубки заканчивается вместе с термометром в изолированной емкости для хранения и залейте его 300 мл буфера для экстракции (рисунок 2).
  5. Поместите теплообменник в ванну с горячей водой и начать перистальтического насоса со скоростью 300 мл мин - 1. Убедитесь, что полученный в результате температура в сосуде составляет 70 ° С, приблизительно 4,5 ° С ниже заданного значения водяной бани, через 3 мин.
  6. Если температура в изолированном сосуде отличается от 70 ° C, регулировать температуру воды в ванне, соответственно, и позволить системе уравновешивания в течение еще 15 мин. Повторите этот шаг, пока температура буфера экстракции увеличивается от температуры окружающей среды до 70 ° C менее чем за 3 мин, или равно, что требуется для эксперимента, и слейте из нержавеющей стали сосуд.
  7. Выбросите буфера для экстракции из изолированного сосуда, и готовят 300 мл аликвоты растительного экстракта. Заполните изолированный сосуд с одной аликвоте.
  8. Насос растительного экстракта (раздел 3.3) через теплообменник в 300 мл мин -1 в течение 5 мин. Убедитесь, что температура экстракта составляет 70 ° C через 3 мин или равна температуре, определенной в экспериментальной конструкции.
  9. Через 5 мин, поместить теплообменник в водяную баню с охлажденным льдом в то время как экстракт еще закачивается. Выдержите в этой установке до тех пор, пока температура не достигнет ровно 20 ° С, или температура определяется в экспериментальной конструкции.
  10. Снять впускной шланг, соединенный с перистальтическим насосом из изолированного сосуда и продолжают откачки для сбора остаточного тепла осаждают растительного экстракта из внутри теплообменника. Затем остановите насос.
  11. Повторите шаги 5.7 до 5.10 для всех аликвот. Возьмите образец 1 мл каждого теплового высаживают экстракта после достижения конечной температуры, затем переходят на экстрактах в мешок фильтрации (раздел 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После первого цикла через шаги 5.7 до 5.10 не будет никакого буфера экстрактуоткинуть на шаге 5.7.

6. Мешок фильтрации растительного экстракта

  1. Установите рукавного фильтра в соответствующий коробом, которая установлена ​​в корпус фильтра, и обеспечивает механическую опору для гибкого материала фильтра. Поместите 1-литровый сосуд , под корзиной и применять экстракте аликвот (раздел 3.3, 4.10 или 5.11 , в зависимости от выбранного теплового режима) в сумке со скоростью 150 мл мин - 1.
  2. После фильтрации, измерения мутности 1:10 разбавления фильтрата в буфере для экстракции с использованием турбидиметра.
  3. Возьмем образец 1 мл и обрабатывают мешок фильтрата , как это определено в экспериментальной конструкции, например, объемной фильтрации и хроматографии 7,10.

7. Анализ проб

  1. Измеряют количество общего растворимого белка (TSP) с помощью метода Бредфорд 24,25.
    1. В трех экземплярах, пипеткой 2,5 мкл каждого образца в отдельные лунки96-луночного планшета. Включает восемь стандартов бычьего сывороточного альбумина (БСА) в трех экземплярах , охватывающих диапазон от 0 - 2000 мкг мл -1.
    2. Добавить 200 мкл реагента Брэдфорда в каждую лунку и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, но достаточно осторожно, чтобы избежать образования пузырьков.
    3. Инкубировать в течение 10 мин при 22 ° С и измеряют оптическую плотность при длине волны 595 нм в спектрофотометре. Вычислить концентрацию TSP в образцах на основе стандартной кривой, проходящей через опорные точки БСА.
  2. Количественно Vax8 с помощью поверхностного плазмонного резонанса 26.
    1. Настройка поверхности плазмонного резонанса прибор с 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) проточном буфере (10 мМ HEPES, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1500 мМ хлорида натрия, 0,05% об / об полисорбат 20, рН 7,4) и смонтировать карбоксиметилированная декстран чип поверхности в устройство. Используйте главную функцию, чтобы промывать систему и начать ручного запуска со скоростью потока 30мкл мин -1 в течение проточных ячеек 1 и 2. Вводят 30 мМ хлористого водорода в два раза в течение 60 секунд с 60 сек перемежаются инъекции 25 мМ гидроксида натрия.
    2. Подготовьте 200 мкл 500 мкг мл -1 мАт 5,2 раствора в 10 мМ ацетата натрия (рН 4,0). Оттепели гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) , и N -hydroxysuccinimide (NHS) Флаконы и отцентрифугированы при 16000 х г в течение 1 мин. Смешайте 70 мкл EDC 70 мкл НГС и передать в пластиковом флаконе 7 мм.
    3. Активация Карбоксиметилированное декстран поверхность поверхности чипа путем инжекции смеси EDC / NHS над проточных кювет 1 и 2 в течение 10 мин при скорости потока 10 мкл мин -1.
    4. Установить путь потока течь только ячейки 2. Пара мАт 5,2 путем введения его в течение 15 мин со скоростью 10 мкл мин -1.
    5. Переключение канала потока для потока ячеек 1 и 2 и вводят этаноламина в течение 7 мин при скорости 5 мкл мин -1 , чтобы дезактивировать поверхность. Tкурица вводят 30 мМ хлористого водорода в два раза в течение 60 секунд с 60 сек перемежаются инъекции 25 мМ гидроксида натрия.
    6. Вводят образцы и MSP1 - 19 стандартов со скоростью 30 мкл мин -1 в течение 180 сек. Убедитесь в том, что концентрация Vax8 составляет 50 - 1000 нг мл -1. Подготовка предварительных разведений в HEPES-солевой буферный раствор, содержащий ЭДТА и полисорбат 20 (HBSEP), если это необходимо.
    7. Вычитание пиковый сигнал потока ячейки 1 от такового потока через измерительную ячейку 2 и использовать разность для расчета концентрации Vax8 в образцах на основе сигнала МПВ 1 - 19 инъекций с известной концентрацией белка 500 нг мл -1.
    8. Регенерация поверхности чипа после каждого образца или MSP 1 - 19 инъекций за счет воздействия 30 мМ хлористого водорода в течение 60 с при скорости потока 30 мкл мин -1.
  3. QUANTIFY Dsred методом флуоресцентной спектрометрии
    1. В трех экземплярах, 50 мкл каждого образца в отдельные лунки черного половинной А.Р.еа 96-луночного планшета. Включает шесть Dsred стандартов , охватывающих диапазон от 0 - 225 мкг мл -1.
    2. Измерьте флуоресценции в двух экземплярах с использованием 530 ± 30 нм фильтра возбуждения и фильтра излучения на 590 ± 35 нм в спектрофотометре. Вычислить концентрацию DsRed в образцах на основе стандартной кривой, проходящей через опорные точки DsRed.
  4. Определение распределений частиц по размерам
    1. Промыть кювета с 1 мл изопропанола и затем с помощью 2 мл деионизированной воды для удаления частиц пыли. Пипетировать 850 мкл образца в кювету.
    2. Поместите кювету в дзета-потенциал и анализатора размера частиц. Откройте «Программное обеспечение» и начать измерение вручную с "белок" в качестве материала и «PBS» в качестве диспергатора. Выберите температуру 25 ° С, а время уравновешивания 180 сек.
    3. Выберите "DTS0012" ячейку и измерьте 173 ° обратного рассеяния. Проверьте "авто" FUNCTиона для измерения длительности и выбрать три измерения с не перемежаются задержки.
    4. Исследовать от размера частиц пиковую профиль распределения, как только измерение завершено путем выбора трех измерений образца с точки зрения эксперимента. Выберите вкладку "Volume" PSD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тепло осаждение клеток табака белков хозяина побледнение
Побледнение процедуру, описанную в разделе 2. был успешно использован для осаждения HCPS из листьев табака с 70 ° C, уменьшая ПБО 96 ± 1% (п = 3) при восстановлении до 51% белка-мишени Vax8, тем самым увеличивая его чистота от 0,1% до 1,2% перед хроматографическим разделением 16. Также можно было восстановить 83 ± 1% (N = 3) флуоресцентного белка DsRed, увеличивая его чистоту от 3,3% до 64,1%. Побледнение...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Три метода для осаждения тепла , описанные выше , могут эффективно удалить табака HCPS до какого - либо хроматографической стадии очистки 16,17. Они дополняют другие стратегии , которые направлены на увеличение первоначальной чистоты продукта, например, гуттация 29, rhizosecretion 30 или центробежной экстракции 31,32, все из которых ограничены секретируемых белков. Тем не менее, тепло на основе метода могут быть использованы только в значимым образом, если целевой бел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность доктору Томасу Радемахеру, Александру Боесу и Веронике Бейс за предоставление трансгенных семян табака, а также Ибрагиму Аль Амеди за выращивание табачных растений. Авторы выражают благодарность д-ру Ричарду М. Твайману за помощь в редактировании, а также Гювену Эдгу за предоставление ссылки на MSP1-19. Эта работа была частично профинансирована за счет гранта Европейского исследовательского совета «Future-Pharma», предложение No 269110, внутренних программ Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Фонд будущего Фраунгофера) и Fraunhofer-Gesellschaft в рамках гранта No. Привлечь 125-600164.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2100P Портативный турбидиметрHach4650000
Комплект аминной муфтыдля мутации GE HealthcareBR100050 Комплект стружекодробления SPR
Автоклавная корзинаNalgene6917-0230Корзина для бланширования листьев
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR устройство
Bio Cell Analyser BCA 003 R& D с 3D ORMSequipn.a.Анализаторразмера частиц
БлендерWaring800EGБлендер
BP-410Furh2632410001Рукавный фильтр
Центрифуга Центрифуга 5415DEppendorf5424 000.410Центрифуга Центрифуга
Пробирка 15 млLabomedic2017106Реакционная пробирка Пробирка
для центрифуги 50 мл самостоятельнаяLabomedic1110504Реакционная трубка
CM5 чипGE HealthcareBR100012 Чип для измерений SPR
Кювета 10 x 10 x 45Sarsted67.754Кювета для Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEпрограммное обеспечение
ДинатрийфосфатCarl Roth GmbH  4984.3 Мультимедийная составляющая
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Удобрение
Forma -86C ULT морозильная камераThermoFisher88400Морозильная камера
Теплица n.a.n.a.Длявыращивания растений
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 смGrodan102446Rockwool block
Twentey-loop теплообменник (длина 4,8 м)н.а. (по индивидуальному заказу)н.а.Heat
теплообменник HEPESCarl Roth GmbH9105.3Компонент медиа
K200P 60DPall5302303Глубинный фильтрующий слой
KS50P 60DPallB12486Глубинный фильтрующий слой
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Термостат водяной бани
L/S 24MasterflexSN-06508-24Трубка
mAb 5.2American Type Culture CollectionHB-9148Vax8 специфическое антитело
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Перистальтическая помпа
MiraclothLabomedic475855-1RФильтровальная ткань
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-метр / кондуктометр
Osram холодный белый 36 ВтOsram4930440Источник света
ФитотронIlka Zelln.a.Длявыращивания растений
Дисульфит натрияCarl Roth GmbH8554.1Компонент среды
Хлорид натрияCarl RothGmbH P029.2Компонент среды
Сосуд из нержавеющей стали; 0,7 кг 2,0 л; высота 180 мм; диаметр 120 ммн.д. (по индивидуальному заказу)н.а.Контейнердля выпадения тепла
Synergy HTBioTekSIAFRTФлуоресцентный и спектрометрический считыватель планшетов
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Корпус фильтра
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS Измерение распределения частиц по размерам
Программное обеспечение Zetasizer v7.11Malvernn.a.Softwareдля работы с устройством Zetasizer Nano ZS

Ссылки

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи