Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54375

⸱

11 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола - показать протокол для перепрограммирования инфильтрирующих опухоль лимфоцитов меланомы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

Аннотация

Приемные передача ех естественных условиях расширил аутологичных опухоль-инфильтрации лимфоцитов (Tīls) могут опосредовать прочные и полные ответы в значительных группах пациентов с метастатической меланомой. Основными препятствиями такого подхода являются сниженная жизнеспособность переданных Т-клеток, вызванных укорочение теломер, и ограниченное число Tīls, полученных от пациентов. Менее дифференцированные Т-клеток с длинными теломерами бы идеальным Т-клеток подмножеством для приемному клеточной терапии Т, однако, генерировать большое количество этих менее дифференцированных Т-клеток является проблематичным. Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), что самообновлению, поддерживать плюрипотентности, имеют удлиненные теломеры, и обеспечивают неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Здесь мы приводим протокол для создания ИПСК с помощью вирусного вектора Сэндай для трансдукции факторов перепрограммирования в Tīls. Этот протокол генерацииS полностью перепрограммировать, вектор свободных клонов. Эти TIL-производные иПСК может быть в состоянии генерировать менее дифференцированные пациенто и опухоль-специфичные Т-клетки для клеточной терапии приемному Т.

Введение

Клеточная технология перепрограммирования , что позволяет генерировать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью избыточной экспрессии определенного набора факторов транскрипции имеет большие перспективы в области клеточной терапии 1,2. Эти иПСК обладают транскрипционные и эпигенетические особенности и обладают способностью к самообновлению и плюрипотентности, подобно эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) 3-5. Примечателен прогресс в перепрограммирования технологии за последнее десятилетие позволило нам генерировать человеческие иПСК даже из терминально дифференцированных клеток, таких как Т - клетки 6-8. Т - клеточные производные иПСК (TiPSCs) сохраняют ту же переставить конфигурацию Т - клеточного рецептора (TCR) генов цепи как исходных Т - клеток, что позволяет регенерацию антиген-специфических Т - клеток из TiPSCs 9-11.

Почти 80% с меланомой инфильтрации лимфоцитов (Тилсом), полученные из опухоли пациента специфически распознавать опухолевый антигены, ассоциированные с Aй поддерживать цитотоксичность против первоначальных раковых клеток 12. Следует отметить, что было установлено , что экспрессия смерти запрограммированным клеток белок-1 (ПД-1) на Тилсом для идентификации аутологичных опухоле-реактивных репертуар, в том числе мутантным неоантигена-специфических CD8 + лимфоциты 13. Адаптивная передача экс-виво расширенных аутологичных Тилсом в сочетании с препаративных режимами lymphodepleting и системного введения интерлейкин-2 (IL-2) , может привести к существенной регрессии метастатической меланомой в группах пациентов 14. Несмотря на обнадеживающие результаты в доклинических моделях и у пациентов, плохое выживание вливали Т-клеток и наличие иммуносупрессивной путей, по всей видимости поставить под угрозу весь потенциал приемному клеточной терапии Т. Текущие клинические протоколы требуют больших ех естественных условиях манипулирование аутологичных Т - клеток, чтобы получить большое количество. Это приводит к образованию терминально дифференцированных Т-клеток, которые имеют плохую выживаемость, снижение Proliferative потенциала, а также высокие уровни PD-1 15.

Это ограничение приемному клеточной терапии Т теоретически может быть преодолен с помощью ИПСК, которые могут обеспечить неограниченный источник аутологичных Т-клеток для иммунотерапии. Недавно мы сообщали о перепрограммирование меланомой Tīls , выражающую высокие уровни PD-1 от вируса Сендай (SeV) опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус 16. В то время как ретровирус векторы требуют интеграции в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммировать, SEV векторы неинтегрирующих и в конечном счете исключены из цитоплазмы. Перепрограммирование эффективность значительно выше , с системой SeV по сравнению с лентивирусов или ретровирусов векторами 6-8. Кроме того, SEV может специфически перепрограммировать Т - клеток в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), в то время как некоторые Ipsc клоны , порожденные лентивирусов или ретровирусов векторы могут быть из нелимфоидных родословных 6-8. Здесь мы подробнопроцедуры реализованы для выделения и активации меланомы человека Тилсом и для генерации TIL-производных ИПСК с использованием системы перепрограммирования SEV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Пациенты должны дать информированное согласие на участие в Совете по институциональному обзору и человека плюрипотентных стволовых комитет Cell одобрено исследование.

1. Выделение и культура Tīls

  1. Получить материал опухоли, которая не требуется для гистологического диагноза из основных закупок патологии службы / ткани. Поместите 20-100 г образцов опухоли в 50-мл пробирку с 30 мл сбора опухолевые сред (таблица 1).
  2. Рассеките твердый, твердый, нормальная ткань опухоли образца из хрупких и / или кровавых некротических областей с помощью ножниц. После удаления некротических тканей, используйте ножницы, чтобы пропустить через мясорубку образец как можно меньше.
  3. Диссоциируют фарша образца, в одной клеточной суспензии с использованием диссоциатора и опухолевый диссоциации набора (человека) в соответствии с инструкциями изготовителя. Суспензию фильтруют с 70 ячейки фильтра мкм, который установлен на 50 мл трубки и промыть сетчатый фильтр 2 раза2 мл среды RPMI 1640.
  4. Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 10 мл клеточных сред T (таблица 1).
  5. Готовят раствор градиента двухступенчатый такие как Ficoll (градиент раствора) в 50-мл пробирку, с более низкой ступени 10 мл 100% раствора градиента и средней ступени 30 мл 75% раствора в градиенте разбавленным фосфатным Дульбекко буферный солевой раствор, без кальция, магния нет (D-PBS (-)).
  6. Слой клеточной суспензии (со стадии 1.4) на растворе градиента (со стадии 1.5). Центрифуга при 400 мкг при 20 ° С в течение 45 мин.
  7. Собирают слой, содержащий обогащенные Тилсом на границе раздела между 100% -го раствора градиента и 75% -го раствора градиента в 50 мл пробирку. Развести слой раствора с обогащенными Тилсом добавлением 20-30 мл D-PBS (-).
  8. Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют TIL-обогащенную фракцию в 10 млклеточных сред T.
  9. Культура фракция (из шага 1.8) с 2 мл среды Т - клеток и 6000 МЕ / мл рекомбинантного человеческого (РЗ) IL-2 в 6-луночный планшет при 37 ° С, 5% СО 2.
  10. Изменение половину средств массовой информации на 5-й день после начала культивирования и через каждые 2-3 дня после этого.
  11. Разделение клеток в соотношении 1: 2 без трипсином после мягко суспендирующие, удвоение числа скважин при достижении 80-90% сплошности. Добавление половины объема (1 мл) свежих Т-клеточных сред и рИЛ-2 при 6000 МЕ / мл.

2. Приготовление митомицин-С-обработанного SNL Feeder клеточной пластинки

  1. Культура SNL фидерных клеток в 10 мл SNL питатель клеточных сред (таблица 1) на 0,1% желатин покрытием 10 см чашку с вплоть до 80-90% слияния (3-4 × 10 6 клеток) достигается.
  2. Добавить 310 мкл 0,4 мг / мл митомицина C раствора непосредственно в SNL питателя для культивирования клеток Петри и инкубируют при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в течение 2 ч и 15 мин. Аспирируйте ПРЕССЫе промыть клетки дважды 5 мл D-PBS (-).
  3. Добавить 0,5 мл 0,25% трипсина / 1 мМ ЭДТА и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин для диссоциации клеток. Добавить 4,5 мл питатель клеточных сред SNL для нейтрализации и повторно приостанавливать клетки в одной подвеске.
  4. Передача клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 200g в течение 5 мин. Аспирируйте средства массовой информации и подсчета клеток с помощью гемоцитометра после ресуспендирования в 10 мл SNL питателя клеточных сред.
  5. Пластина 1,5 х 10 6 клеток на лунку фидерных клеток SNL на 10 см чашку и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2. Используйте фидерные клетки SNL в течение 3-х дней.

3. Генерация ИПСК Используя вирус Сендай (SeV) Вектор

  1. Урожай Тилсом (с шага 1.11) и активировать 5 х 10 5 клеток Тилсом с пластинчатым переплете мышиного CD3 анти-человеческий (1 мкг / мл) и растворимого мышиного антитела против человеческого CD28 (5 мкг / мл), с чрИЛ-2 (6000 МЕ / мл) в 2 мл клеточных сред Т в 6-луночный планшет в 37 ° С, 5% СО 2 в течение 5 дней.
  2. Урожай Tīls (со стадии 3.1) в 15 мл пробирку с помощью пипетки и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра.
  3. Реактивируйте 1 × 10 5 клеток Тилсом с пластинчатым переплете мышиного CD3 анти-человеческий (1 мкг / мл) и растворимого мышиного антитела против человеческого CD28 (5 мкг / мл), с рИЛ-2 (60 МЕ / мл) в 500 мкл перепрограммирования сред (таблица 1) на лунку в 24-луночный планшет при 37 ° с в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов. Подготовьте 3 скважины для SeV инфекции: Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус (1 хорошо); SeV инфекция (GFP: зеленый флуоресцентный белок) (1 хорошо); и количество клеток (1 лунку).
  4. Через 24 часа (из шага 3.3), подсчет числа клеток с помощью гемоцитометра и определить объем каждого вируса для различных (3-20) кратностью инфекции (МВД). Удалить один набор вируса Сендай векторных трубок от -80 ° C хранения. Растаяйте векторы SEV быстро на водяной бане (37 ° C) и поместите их на лед.
    Объем вируса (мкл)= MOI (CIU / ячейка) х количество клеток / титр вируса (CIU / мл) × 10-3 (мкл / мл)
  5. Добавьте расчетные объемы каждого из четырех векторного вируса Сендай трубок, которые по отдельности, проведенных Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус путем добавления смеси векторов SEV при 10-20 MOI в средствах массовой информации, в том числе активированного Тилсом.
  6. Для определения эффективности трансдукции, добавьте вычисленные объемы SeV-GFP в скважину активированных Тилсом.
  7. Поместите блюдо (из шага 3.5 и Шаг 3.6) в термостате при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов. Через 24 часа оценивают эффективность инфекции использованием Тилсом инфицированных SeV-GFP под флуоресцентным микроскопом.
  8. Собирают клетки (со стадии 3.5) в 15 мл трубки. Центрифуга при 200g при комнатной температуре в течение 5 мин.
  9. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 0,5 мл чЭСК сред с Предстоятель ES клеточной среды и основного фактора роста фибробластов (bFGF, 4 нг / мл).
  10. Передача суспензии в 10 см блюдо, которое Contàмодули митомицин-С обработанных фидерные клетки SNL в 10 мл чЭСК средах. Изменение СМИ чЭСК каждый день до тех пор, пока колонии выращивают.
  11. Примерно в 18-й день до 21, удалить фидерные клетки SNL вокруг колоний под микроскопом с помощью 10-мкл наконечник в чистом столе.
  12. Наскребать колонии с помощью 10-мкл наконечник и передавать их с помощью 200-мкл наконечник в 100 мкл ИПСК сред на лунку 96-луночного планшета для культуры ткани с. Пипеткой вверх и вниз в 2-3 раза, чтобы разбить колонии на мелкие комки со средним размером 50-100 мкм.
  13. Перенести небольшие сгустки в 6-луночных культуральных планшетах с митомицином-С-обработанных клеток фидерных SNL (со стадии 2) в 2 мл на лунку ИПСК сред с основного фактора роста фибробластов (bFGF, 4 нг / мл). Изменение ИПСК СМИ каждый день.
  14. Передача ИПСК в 6-луночных культуральных планшетах со свежими митомицин-С-обработанных фидерных клеток SNL с 1 мг / мл коллагеназы IV каждые 5-6 дней. Подготовьте 2 скважины на пластинах каждого клона для Immunostaining.
  15. Определить полное перепрограммирование каждого клона путем иммуногистохимического окрашивания плюрипотентности маркеров (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 и Oct3 / 4) 1.
    Примечание: Для дальнейшей оценки потенциала плюрипотентности, подтверждают , что полностью перепрограммировать линии IPSC могут дифференцироваться в трех зародышевых слоев путем эмбриоидного формирования тела и дифференциации анализа или анализа формирования тератомы 16.
  16. Убедитесь, что полностью перепрограммировать линии IPSC демонстрируют нормальный кариотип путем цитогенетического анализа.
  17. Для формирования тератомы, впрыснуть недифференцированной TIL производный IPSC (1 х 10 6) суспензии в 100 мкл DMEM , содержащей 10% FCS в подкожную ткань 6-8 недельных самок мышей NOD / SCID. Пятно секции тератомы с гематоксилином и эозином.

4. Иммунофлуоресценции Окрашивание ИПСК для SSEA3, SSEA4, TRA1-60 и TRA1-81

  1. Мытье иПСК с 1 мл PBS и фиксируют ИПСК с 1 мл 4% годовыхraformaldehyde раствор в течение 10 мин. Удалите 4% раствора параформальдегида и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза.
    Примечание: Будьте осторожны при использовании параформальдегида, потому что он является токсичным.
  2. Предварительно обработать ИПСК с блокирующим буфером (таблица 1) в течение 30 мин. В то же время, разбавленные первичные антитела (крысы против человеческого SSEA3, мышиное анти-человеческий SSEA4, мышиное анти-человеческий TRA1-60, и мышиное анти-человеческий TRA1-81) 1:50 в 1,5% раствор козьей сыворотки, разбавленные PBS и Тритон -100 (общий объем: 1 мл).
  3. Удалите блокирующий буфер (таблица 1). Добавьте разбавленный раствор первичного антитела и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. В то же время, развести вторичного антитела (анти-IgG мыши и IgM или анти-крысу IgM) 1:50 в 1,5% раствор козьей сыворотки.
  4. Удалить разбавленный раствор первичного антитела и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый в течение 5 мин. Добавьте разбавленный раствор вторичного антитела и инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре в темном помещении.
  5. Удалите разбавленный раствор вторичного антитела и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый из которых в течение 5 мин. Обратите внимание на ИПСК с иммунофлюоресценции микроскопии.

5. Иммунофлуоресценции Окрашивание ИПСК для Oct3 / 4

  1. Мытье иПСК с 1 мл PBS и фиксируют ИПСК с 1 мл 4% -ного раствора параформальдегида в течение 10 мин. Удалите 4% раствора параформальдегида и промыть ИПСК с PBS 3 раза.
  2. Добавить пермеабилизирующего буфера (таблица 1) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Удалить буфер пермеабилизирующего и добавить блокирующем буфере (таблица 1).
  3. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. В то же время, разбавленные первичное антитело (мышиное анти-человеческий Oct3 / 4) в соотношении 1:50 в блокирующем буфере.
  4. Добавьте разбавленный раствор первичного антитела и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
  5. Удалить разбавленный раствор первичного антитела и промыть ИПСК с 1мл PBS 3 раза, каждый в течение 5 мин. В то же время, дилютневая вторичное антитело (козий против мышиного IgG / IgM) 1: 100 в блокирующем буфере.
  6. Добавьте разбавленный раствор вторичного антитела и инкубируют при комнатной температуре в темном помещении в течение 45 мин.
  7. Удалите разбавленный раствор вторичного и промыть ИПСК с 1 мл PBS 3 раза, каждый из которых в течение 5 мин. Обратите внимание на ИПСК под иммунофлюоресценции микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показан обзор процедуры , которая включает первоначальное расширение меланома Тилсом с рИЛ-2, который с последующей активацией анти-CD3 / CD28 и переноса гена Oct3 / 4, Klf4, Sox2 и с-Мус в Тилсом для генерации ИПСК. Как правило, Tīls по культуре с чрИЛ-2 начинают формироваться сфер 21-28 дней после начала культивирования. На данный момент, Тилсом готовы быть активирован с анти-CD3 / CD28 - . Фиг.2а Тилсом, по культуре с рИЛ-2 на 21 -й день,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы показали протокол для перепрограммирования меланомы Tīls к ИПСК по SeV-опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Такой подход, с помощью системы SEV перепрограммировать Т - клетки, дает преимущество не встраивается метода 7.

Предыдущее исследование показало , что система перепрограммирование SeV была очень эффективной и надежной , чтобы перепрограммировать не только фибробласты , но и Т - клетки периферической крови 7,17.<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Дебору Постифф и г-жу Жаклин Барикдар из Центра закупок тканей и доктора Синди ДеЛонг из Лаборатории ядра плюрипотентных стволовых клеток в Мичиганском университете за ее техническую помощь. Это исследование было поддержано финансированием стартапов Мичиганского университета и грантами от Центральной хирургической ассоциации, Американского колледжа хирургов, Альянса по исследованию меланомы и NIH/NCI (1K08CA197966-01) для F. Ito.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
щадящий MACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
щадящий диссоциатор MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Набор для диссоциации опухоли, человекMiltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Life technologies11875-093
Falcon 70 мкм Клеточный фильтрBD352350
BD Falcon 50мл Конические пробирки с кнтрифугомBD352070
IMDMLife technologies12440053
сыворотка AB человекаLife technologies34005100
L-глютамин (200mM)Life technologies25030-081
2-меркаптоэтанол (1000x, 55mM)Life technologies21985-023
Пенициллин-стрептомицин Life technologies15140-122
гентамицинLife technologies15750-060
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-02
D-PBS (-)Life technologies14040-133
рекомбинантный человеческий (rh) IL-2Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Очищенный NA/LE мышиный античеловеческий CD3BD555329
очищенный мышь NA/LE античеловеческий CD28BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife technologies15630-080
N-ацетилцистеинCumberland Фармацевтические корпорацииNDC 66220-207-30
Планшеты для культуры тканей Falcon (6-луночные)Планшеты
Falcon (24-луночные)Corning353047
Sendai вирусный векторDNAVEC
SNL фидерные клеткиCell Biolabs, IncCBA-316
митомицин CSIGMAM4287растворимый в воде (0,5 мг/мл)
желатинSIGMAG1890
основной фактор роста фибробластов (bFGF)Технологии жизниPHG0264
для культуры тканей Corning 353046

Ссылки

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
  4. Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
  5. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  6. Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  7. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  8. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  9. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
  10. Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
  11. Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
  12. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
  13. Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
  14. Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
  15. Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
  16. Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11(2016).
  17. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  18. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
  19. Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Векторы на основе вируса Сендайрепертуар Т-клеточных рецепторовсреда для культивирования эмбриональных стволовых клеток человекафидерные клетки SNLобработанные митомицином Cрекомбинантный интерлейкин-2 человекафлуоресцентная микроскопияанализ кариотипаформирование тератомы
Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.