Методическая статья

Слоистые альгината конструкты: Платформа для совместного культивирования разнотипных клеточных популяций

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54380

⸱

7 августа 2016 г.

 ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

Инженерия и анализ несущих тканей с гетерогенными клеточными популяциями все еще остаются сложной задачей. В данной работе мы описываем метод создания бислойных альгинатных гидрогелевых дисков в качестве платформы для совместного культивирования различных клеточных популяций в рамках одной конструкции.

Аннотация

Многие несущие ткани обладают структурно и функционально различными областями, обычно сопровождающимися различными клеточными фенотипами с дифференциальными характеристиками механовосприятия. Инженерия и анализ этих типов тканей остаются сложной задачей. Слоистые гидрогелевые конструкции дают возможность исследовать взаимодействие между несколькими клеточными популяциями в рамках одной конструкции. Альгинатные гидрогели биосовместимы и позволяют легко изолировать клетки после экспериментов. В данной статье мы опишем метод разработки двухслойных альгинатных гидрогелевых дисков небольшого размера. Этот процесс поддерживает высокую жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток человека в процессе формирования, и эти слоистые диски могут выдерживать неограниченное циклическое сжатие, обычно используемое для стимуляции hMSCs, подвергающихся хондрогенезу. Эти слоистые конструкции потенциально могут быть масштабированы для включения дополнительных уровней, а также использоваться для разделения популяций клеток первоначально после наслоения. Эта двухслойная платформа для культивирования альгинатного гидрогеля может быть использована для различных целей, включая инженерию и анализ клеток несущих тканей и кокультур других типов клеток.

Введение

Компрессионные ткани несущие нагрузки, такие как суставного хряща или межпозвоночных дисков состоят из областей разнородных тканей, которые имеют решающее значение как для биомеханической функции и соответствующей механо-трансдукции в ткани. Мало того, что клеточная организация и функции различны в разных регионах, но внеклеточной матрицы (ECM) также разнообразны по составу и организации. Например, суставной хрящ состоит из трех основных зон с различной морфологии клеток, механической функции и ECM. Различия в их ECM приводят к дифференциальным несущие нагрузки обязанностей; поверхностный слой в основном вовлечен в ответ на растяжение для загрузки, в то время как средние и глубокие зоны, в основном отвечают за ответ на сжатие 1. Точно так же, в межпозвоночный диск, гель-подобный студенистое ядро ​​окружено пластинчатые пульпозное и клетки в этих двух различных областей испытывают различные типы биофизических раздражителей2. В этих типах тканей, клеток и внеклеточных матриц внутри слоев ткани взаимодействуют друг с другом , как ткань подвергается и реагирует на механические силы.

Рекапитуляция таких гетерогенных тканевых структур остается проблемой в тканевой инженерии и регенеративной медицины, и наше понимание их биологическое значение ограничено. Существует необходимость культивирования платформ для анализа слоистые ткани, а также совместное культивирование различных популяций клеток в пределах одной конструкции. В суставном хряще тканевой инженерии, подмости-менее слоистой конструкции были построены за счет использования возможностей зональных хондроцитов депонировать разнообразный ECM , чтобы имитировать различные слои этой ткани 3,4. Однако слоистые гидрогелевые конструкции обеспечивают возможность для исследования взаимодействия различных типов клеточных популяций, которые не обладают способностью образовывать прочную ткань независимо друг от друга. Например, разные попленностей мезенхимальных стволовых клеток могут быть совместно культивировали в слоистых конструкций. Такие слоистые каркасы использовались с обеих хондроциты и дифференциации мезенхимальных стволовых клеток для улучшения тканевой инженерии 5. Мало того, что различные клеточные популяции быть совместно культивируют в аналогичных слоев гидрогеля, но один тип клетки также можно культивировать в слоях , которые были изменены , чтобы иметь различную жесткость или биохимическое содержание , чтобы вызывать различные ответы от клеток 6,7.

Много различных биоматериала гидрогели были использованы на слой клеточных популяций для инженерии хрящевой ткани , такие как те , которые используют полиэтиленгликоль или поливиниловый спирт основы 7-9. Тем не менее, альгинатные гидрогели являются одним из самых простых биоматериалов, из которых можно создавать многослойные строительные леса для изучения популяций гетерогенных клеток в совместной культуре. В то время как агароза гидрогели также легко образуются, альгинатные гидрогели имеют дополнительное преимущество позволяет легко этоolation клеток из 3-D конструкции для анализа отдельных клеток , как было описано ранее 10. В предыдущих исследованиях, двухслойной альгинатные гидрогели были сформированы в тонких листах и из этих листов, нарезанных срезы (например., При использовании штампа биопсию) для конкретных применений , таких как для анализа биохимического состава или межфазных свойств сдвига 11,12. Другой способ формирования тонких листов альгинатные описан с потенциалом для стратификации в несколько слоев, но по- прежнему требует изменений в гидрогеле для использования в механических испытаний 13.

Здесь мы представляем метод для создания воспроизводимо двухслойной альгинат гидрогель дисков для использования в совместного культивирования различных популяций клеток. Эта платформа обладает альгинат диска несколько преимуществ. В первую очередь, воспроизводимая форма и малый размер способствует механической стимуляции встроенных клеток, не требуя биопсии пуNCH ​​или иное физическое изменение к гидрогеля для многих приложений. Кроме того, жизнеспособность клеток остается на высоком уровне в течение процесса нанесения слоев, а после образования геля четкое разделение двух популяций клеток в геле видно, без начальной области перекрытия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка к формированию альгината дисков

  1. Подготовьте 4% (вес / объем) раствора альгината в 1X Дульбекко фосфатно-солевом буферном без добавления хлорида кальция или хлорида магния и поместить в C водяной бане при 37 °. Концентрации раствора альгината может варьироваться, но 1 - 4% (вес / объем) рекомендуются растворы альгинатов.
  2. Смешайте раствор альгината в соотношении 1: 1 с основанием теплой среды для культивирования клеток (например, среда Игла в модификации Дульбекко.) Для нужного типа клеток. Альгинат концентрация в настоящее время равна половине первоначальной концентрации, то есть., 2% (вес / объем). Стерилизовать альгината раствора / носителя с использованием стерильных 0,2 мкм нейлоновый шприцевые фильтры.
  3. Приготовьте ванну из стерильной дигидрата хлорида кальция 102 мМ в стерильной воде с достаточным количеством раствора, чтобы погрузить пресс-форм (~ 200 - 300 мл).
  4. Соберите стерильный "образование геля формы" (6 мм диаметр х 3 мм высотой цилиндрических лунок в 3 в 3 х в алюминиевой пластине, см Рисунок 1) и (нижний концевые шайбы: один 3 х 3 в алюминиевой пластине, верхний: один 1,5 х 3 в алюминиевой пластине) и готовят формы следующим образом :
    1. Вырезать толстую фильтровальную бумагу (Промокашка фильтровальной бумаги) и ячейка microsieve мембрану (размер пор 10 мкм) до размеров верхней и нижней торцевыми пластинами и поместить их в ванну хлорида кальция до насыщения, приблизительно 1 мин. При желании, стерилизовать толстую бумагу фильтра и microsieve мембрану в автоклаве или ультрафиолетовым светом в течение 30 минут перед использованием.
    2. Настройка половины (нижняя половина) конструкции пресс-формы.
      1. Поместите следующие элементы друг над другом в следующем порядке и разглаживают с помощью стерильного шпателя: большой торцевую (3 х 3 дюйма), толщина фильтровальной бумаги, а затем на microsieve мембрану.
      2. Инверсия и нажмите плесень на стопку бумажных полотенец, чтобы обеспечить потерю избытка раствора хлорида кальция.
      3. Поместите "гель образование плесени" с цилиндрической лунки на верхней части CELL microsieve мембрану и аккуратно закрепить пресс-форму вместе с двух сторон с помощью зажимы на левой и правой сторонах. Убедитесь в том, чтобы оставить достаточно места для верхней концевой пластинки (1.5 х 3 дюйма), чтобы покрыть скважины полностью позже.
    3. Настройка второй половины (верхняя половина) конструкции пресс-формы.
      1. Поместите следующие элементы друг над другом в следующем порядке и разглаживают: маленький, толстый торцевую фильтровальную бумагу, microsieve мембрану.
      2. Инверсия и нажмите на эту половину формы на стопку бумажных полотенец, чтобы обеспечить потерю избытка раствора хлорида кальция. Не затягивайте эту половину формы с использованием связующих клипов в это время.
  5. Культура клеток, как это рекомендовано в соответствии с инструкциями изготовителя. Заготавливают нужные ячейки для встраивания в слоистых альгинатных гидрогелей. Рекомендуемая плотность клеток 1 - 2 × 10 6 клеток / мл, но это может варьироваться в зависимости от желаемых экспериментов.
    Примечание: При использовании этого методадля создания слоев с различными типами клеток, убедитесь, что культура двух типов клеток параллельно для наслоения. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , высевали при плотности клеток 1 × 10 6 клеток / мл будет использоваться в качестве примера для следующего протокола. Число клеток и количество дисков можно масштабировать для экспериментов по мере необходимости.
    1. От одного до двух недель до встраивания, семена мезенхимальных стволовых клеток при плотности клеток в 3000 - 5000 клеток / см 2 в 10 мл базальной среды для выращивания (среда Игла в модификации Дульбекко, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2% L-глутамина, 1 % заменимых аминокислот, 1% пенициллина / стрептомицина) в Т-75 колб.
    2. Удалить истощенные среды через каждые 2 - 3 дней и заменить 10 мл базальной среды для выращивания до тех пор, пока клетки не являются 80 - 90% сплошности.
    3. Для сбора клеток, удалить отработанный материал, и пипеткой 3 мл 1x Дульбекко забуференный фосфатом физиологический раствор без добавления хлорида кальция или хлорида магния для полосканий клеток. Удалить этот раствор, пипетки 3 мл 0,25% Trypsin-EDTA на клетках, растущих в Т-75 колб, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. После того, как клетки подняли из клейкого поверхности, добавьте 6 - 9 мл базальной среды для выращивания.
    4. Центрифуга МСК при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирата супернатант и повторно приостанавливать в 1 - 5 мл базальной среды для выращивания. Граф клеток с использованием гемоцитометра с помощью инструкции устройства.
    5. Удалить 1 × 10 6 клеток от общего ресуспендирования клеток, центрифуга с использованием тех же условий, и аспирата супернатант.

2. Формирование сотовых высевают альгинат дисков

  1. Повторное приостановить осадок клеток в 1 мл стерильного раствора альгината / средства массовой информации для достижения плотности клеток 1 × 10 6 клеток / мл. Клетка-альгинат смесь будет гомогенно облачно по внешнему виду, когда клетки смешивают в соответствующим образом.
  2. Пипетка 130 мкл клеточной смеси альгината на шесть 6 мм диаметр х 3 мм в высоту Лунки в нижней части пресс-формыпостроить по каплям, чтобы не создавать никаких пузырей. Незначительное выпуклый мениск должен быть виден над краем каждой лунки.
  3. Тщательно разглаживают верхнюю часть конструкции пресс-формы с помощью стерильного шпателя и перевернуть его, так что клетка microsieve мембрана находится на вершине лунки. Поместите плесень построить на вершине скважин, убедившись в том, чтобы покрыть лунки, содержащие клетки и альгинат смесь полностью.
  4. Поднимите нагруженную конструкцию пресс-формы и, одновременно нажимая твердо на центр, связующее клип оставшихся двух сторон (сверху и снизу), чтобы закрепить верхнюю и нижнюю половинки конструкции пресс-формы. В клеточно-альгинатные растворы должны быть надежно расположен в лунках в это время.
  5. Погрузить закрепленную конструкцию пресс-формы в ванне хлорида кальция в 102 мМ, убедившись в том, что вся конструкция погружена. Выдержите в капот культуре клеток при комнатной температуре в течение 90 мин.
  6. В конце 90 мин, удалить конструкцию пресс-формы из 102 мМ хлорида кальцияванна и место на стопку бумажных полотенец в капот культуре клеток. Удалить все четыре зажимы и отделить две половинки конструкции пресс-формы. Гидрогели, образованные в лунках не должно быть никаких пузырей и должен полностью заполнить лунки.
  7. С помощью шпателя, тщательно проследить за край лунки, содержащие гидрогели тщательно рыхлить и выклиниваются гидрогели. После удаления гидрогели из конструкции пресс-формы, падение гидрогели непосредственно в ванну с 1x Дульбекко фосфатно-солевом буферном с помощью хлорида кальция и хлорида магния. Накройте гели полностью смыть избыток раствора хлорида кальция на 1 - 5 мин.
  8. Передача гидрогели в базальной раствора питательной среды в желаемом блюдо (например., 6 - луночные планшеты) , который полностью покрывает гидрогели. Выдержите в течение по крайней мере 1 часа в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 ° С и 5% СО 2 до перехода к стадии наслоения.
    Примечание: гидрогели, содержащие клетки могут храниться вкультуры клеток инкубатор на неопределенное время в это время, пока наслоение гелей с другой популяции клеток желательно, при условии, что изменения медиа завершаются через каждые 2 - 3 дней.

3. Расслоение альгината дисков

  1. За последние полчаса в 1 ч инкубации собирают и готовят стерильные формы и раствора для отжига гелей.
    1. Подготовка "Cutting формы" путем закрепления пресс-формы, которая имеет скважин половину высоты "гель формирования формы" (6 мм диаметр х 1,5 мм высотой скважин в 3 по х 3 в алюминиевой пластине) к концевой пластине (3 х 3 в алюминиевой пластине), используя зажимы с левой и правой сторон.
    2. Подготовка "отжига формы" путем закрепления пресс-формы, на 3 мм больше в диаметре, чем "гель формирования формы" (диаметр 9 мм х 3 мм высотой скважины в 3 в х 3 в алюминиевой пластине) к концевой пластине (3 х 3 в алюминиевой пластине), используя зажимы с левой и правой сторон.
    3. Приготовьте раствор100 мМ цитрат натрия / 30 мМ ЭДТА (дигидрата цитрата натрия, дигидрат соли этилендиаминтетрауксусной кислоты тетранатриевую) в стерильной воде.
  2. Удалить гели желаемых клеточных популяций (в данном примере, два диска с hMSCs) из средств массовой информации в блюдо, и поместить в "режущими формы" скважин. Каждый гель должен плотно прилегать в лунки с половиной геля выступающую над формой.
  3. Используя скальпель, ломтик геля вдоль поверхности формы (это будет разрезать пополам гидрогель). Переверните верхнюю половину геля и поместите его в открытую скважину формы. Половина геля также должна плотно прилегать в пресс-форму хорошо, но в настоящее время обе половины гели должны быть высота пресс-формы с разрезом внутренней поверхности видимой. Повторите со вторым гелем.
    Примечание: Внимание: только внутренние поверхности срезанные будут образовывать слоистые диски. Использование внешних поверхностей приведет к Разделяющий половины. Есть подозрение, что текстуры из microsieve мембраны перенесен на поверхность геля предотвратитьУспех процесса отжига.
  4. Поместите кусок сухой клеточной мембраны microsieve поверх лунок, убедившись, что microsieve мембрана находится в контакте со всеми половинками геля, чтобы быть отожженной и покрывая их полностью. Поместите толстый фильтровальную бумагу поверх microsieve мембраны, убедившись в том, чтобы полностью покрыть гели.
  5. Капают раствор, содержащий 100 мМ цитрат натрия / 30 мМ ЭДТА (дигидрата цитрата натрия, дигидрат соли этилендиаминтетрауксусной кислоты), тетранатриева на толстый фильтровальную бумагу, пока она не станет насыщенным. Приблизительно 750 мкл достаточно для четырех скважин.
  6. Инкубируйте гели в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем удалите ячейки microsieve мембрану и толстую фильтровальную бумагу и выбросить их. Снимите зажимы и откройте форму.
  7. Для каждого отожженном геля, передают один цитрат натрия / ЭДТА обрабатывают половину гидрогеля на подготовленную «отжига» формы с поверхность среза вверх. Это будет одна половина отожженном сопзЬruct.
  8. С помощью шпателя, подъема и поместить цитрат второй натрия / обработанной ЭДТА полупериод гель (может содержать другой тип клеток) на гель уже в "отжига плесени", листать эту вторую половину гель так, чтобы поверхность среза находится в связаться с разрезанной поверхности геля уже в "отжига плесени".
  9. Слегка нажмите вниз на двух гелей с помощью шпателя, чтобы удалить пузырьки между двум гелей. Кроме того, переставлять гели по мере необходимости, чтобы убедиться, что они находятся непосредственно друг на друга.
  10. Аккуратно поднимите "отжига" формы и погрузить его в ванну хлорида кальция в 102 мМ в течение 30 мин. Не закрывайте колодцы со торцевую пластину.
  11. После 30мин инкубации удалить "отжига" формы и поместите его на бумажные полотенца. Снимите зажимы и отделить форму от торцевую пластину.
  12. С помощью шпателя, собирают отожженном гели и поместить их в 1x Дульбекко забуференный фосфатом физиологический раствор хлорида кальция и тagnesium ванны хлорид мыть гели. Впоследствии передача отожженые гидрогели в среде для культивирования клеток в желательном блюдо (например., 6-луночный планшет) для культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлена ​​формирование и наслоение альгинатных гидрогелей. Завершена би-слоистые гели демонстрируют полное первоначальное разделение популяций клеток , как показано на рисунке 2. Жизнеспособность клеток человеческих мезенхимальных стволовых клеток) , вложенной в этих гидрогелей и слоистый остается высоким , и сравнима с объемными гидрогели , как показано на рисунке 3. Жизнеспособность оценивали после отжига, нарезка гел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол для формирования слоистых альгината гидрогеля дисков для изучения сопутствующих культур нескольких клеточных популяций, таких как те , в физиологически слоистых тканей, например, хрящей. Слоистые структуры, такие, как описываемого культуры платформы, может быть использован для изучения взаимосвязи между двумя популяциями различных клеточных подвергаемых одной и той же культурной среды или под нагрузкой.

Альгинат представляет собой анионный линейный полисахар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Национальным научным фондом (CBET 0845754, AHH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Натриевая соль альгиновой кислотыSigma AldrichA1112Раствор изготовлен в масс.% с использованием DPBS (-/-)
1x Буферизованный фосфатный раствор Dulbecco (-/-)Gibco Life Technologies 14190
1x Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко (+/+)Gibco Life Technologies 14190
Модифицированный Eagle Medium от DulbeccoGibco Life Technologies 11965Пример. Используйте шприцевые фильтры нужного среднего типа
(0.02 μ m Нейлон)FisherBrand0979C
Дигидрат хлорида кальцияБиореагенты FisherBP510Готовить раствор в стерильной воде
Критерий Промокательная фильтровальная бумагаBiorad1704085Резать по размеру торцевые пластины для формирования плесени
Клеточная микросито Мембрана (10 μ m размер пор)Biodesign Inc из Нью-ЙоркаN10RОбрезка по размеру торцевых пластин для формирования плесени
Дигидрат цитрата натрия дигидратFisherScienceS93364
Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат тетранатриевой соли (ЭДТА)FisherBioreagentBP121
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота Технологии Gibco Life 26140Используется, например, базальная питательная среда мезенхимальных стволовых клеток
Пеницилин/Стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco Life Technologies 15140Используется, например, в качестве базальной питательной среды для мезенхимальных стволовых клеток
L-глутамин (200 мМ)Gibco Life Technologies 25030081Используется, например, базальная питательная среда мезенхимальных стволовых клеток
Заменимые аминокислоты (100x)Gibco Life Technologies 11140050Используется, например, базальная питательная среда мезенхимальных стволовых клеток

Ссылки

  1. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  2. Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
  3. Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
  4. Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
  5. Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
  6. Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
  7. Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
  8. Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
  9. Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
  10. Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
  11. Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
  12. Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
  13. Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
  14. Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
  15. Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи