Методическая статья

Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 января 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается подход к выделению отдельных родственных РНП, образующихся в эукариотических клетках, с помощью специфического обогащения, направленного на олигонуклеотиды. Мы демонстрируем применимость этого подхода путем выделения родственного РНП, связанного с ретровирусной 5'-нетранслируемой областью, состоящей из геликазы А DHX9/РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частицы рибонуклеопротеина управляют биогенезом и посттранскрипционной регуляцией всех мРНК через различные комбинации РНК-связывающих белков. Они состоят из позиционно-зависимых, цис-действующих элементов РНК и уникальных комбинаций РНК-связывающих белков. Определение состава конкретного РНП имеет важное значение для достижения фундаментального понимания регуляции генов. Изоляция избранного RNP сродни поиску иголки в стоге сена. В данной работе мы демонстрируем подход к выделению РНП, ассоциированных в 5'-нетранслируемой области выбранной мРНК в асинхронных, трансфицированных клетках. Было продемонстрировано, что этот родственный РНП необходим для трансляции отдельных вирусов и генов клеточной реакции на стресс.

Продемонстрированный протокол совместного осаждения РНК-белка подходит для последующего анализа белковых компонентов с помощью протеомных анализов, иммуноблотов или подходящих биохимических идентификационных анализов. Этот экспериментальный протокол демонстрирует, что геликаза DHX9/РНК А обогащена на 5'-конце родственной ретровирусной РНК, и предоставляет предварительную информацию для идентификации ее ассоциации с родственными мРНК huR и junD, связанными с клеточным стрессом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК - связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.

Многочисленные белки обозначены как ОДП в силу своих консервативных областей аминокислот, в том числе мотив распознавания РНК (RRM), двухцепочечной РНК - связывающий домен (РДО), и вытягивание основных остатков (например, аргинин, лизин, и глицин) 4. ОДП обычноизолированных стратегиями иммунопреципитационных и просеивают, чтобы идентифицировать их родственными РНК. Некоторые ОДП совместно регулируют пре-мРНК, функционально связанные, обозначенные как РНК регулонов 5-8. Эти ОДП, их родственными мРНК, а иногда и некодирующих РНК, образуют каталитические РНП, которые различаются по составу; их уникальность обусловлена различными комбинациями сопутствующих факторов, а также временной последовательности, расположения, и продолжительность их взаимодействий 9.

РНК иммунопреципитации (RIP) является мощным средством , чтобы изолировать РНП из клеток и выявления сопутствующих транскриптов с помощью анализа последовательности 10-13. Переход от кандидата к геному скрининг возможна через RIP в сочетании с микрочипов анализа 14 или высокой пропускной последовательности (Секвенирование РНК) 15. Точно так же, соосаждение белки могут быть идентифицированы с помощью масс - спектрометрии, если они достаточно обильны и отделим от совместным осаждением антителом 16,17. Здесь мы рассматриваем методику выделения RNP компонентов определенной родственным РНК из культивируемых клетках человека, хотя подход изменяемыми для растворимых лизатов клеток растений, грибов, вирусов и бактерий. Downstream анализ материала включают идентификацию кандидатов и проверку с помощью иммуноблот, масс - спектрометрии, биохимический анализ ферментативной, RT-КПЦР, микрочипов и Секвенирование РНК, как представлено на рисунке 1.

Учитывая фундаментальную роль RNPs в контроле экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, изменения в экспрессии компонентов ОДП или их доступности к родственным РНК может быть вредно для клетки и связаны с несколькими типами расстройств, включая неврологические заболевания 18. DHX9 / РНК хеликаза А (РГА) необходимо для перевода отдельных мРНК клеточных и ретровирусных происхождения 6. Эти родственными РНК обладают структурно-родственные элементы цис-действующие в рамках своих5 'UTR, который обозначается как пост-транскрипционном управляющего элемента (PCE) 19. РГА-PCE активность необходима для эффективной кэп-зависимой трансляции многих ретровирусов, в том числе ВИЧ-1, а также гены , регулирующие рост, в том числе Джунд 6,20,21. Кодируемый геном (эссенциальной dhx9), РГА имеет важное значение для клеточной пролиферации и его понижающей регуляции исключает жизнеспособность 22 клеток. Молекулярный анализ RHA-PCE РНП является важным шагом на пути к пониманию того, почему РГА-PCE деятельность необходимо контролировать клеточную пролиферацию.

Точная характеристика компонентов RNP РГА-PCE в стационарном состоянии или при физиологической возмущения клетки требует селективного обогащения и захвата из РГА-PCE RNPs в достаточном изобилии для анализа вниз по течению. Здесь, ретровирусный РНК PCEgag был помечен 6 копий сайта цис-связывания РНК для белка оболочки MS2 (СР) в пределах открытой рамки считывания. Белок оболочки MS2 был экзоgenously экспрессируется совместно с PCEgag РНК плазмиды трансфекции для облегчения сборки RNP в растущих клетках. RNPs , содержащие белок оболочки MS2 с родственным MS2-меченой РНК PCEgag подвергали иммунопреципитации из клеточного экстракта и захватили на магнитных шариков (рис 2а). Для выборочного захвата компонентов RNP, присоединенные к PCE, иммобилизованного РНП инкубировали с олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям дистальных к PCE, образуя гибрида РНК-ДНК, который является субстратом для активности РНКазы Н. Так как PCE позиционируется в 'терминале 5' 5'-нетранслируемой области, олигонуклеотид комплементарны последовательности РНК, смежных с ретровирусной сайта инициации трансляции (ГАГ старт-кодон). РНКазы H расщепления вблизи начала рвотным кодонов выпущен UTR комплекс 5 'от иммобилизованным RNP, который собирают в качестве элюента. После этого образец оценивали с помощью ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить захват PCEgag и с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, чтобы подтвердить captuповторно из белка оболочки мишени MS2. Валидация из PCE-ассоциированной РНК связывающего белка, DHX9 / РНК хеликаза А, затем выполняется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Буферные композиции
Промывочный буфер:
50 мМ Трис-HCl, рН 7,4
150 мМ NaCl
3 мМ MgCl2
С низким содержанием соли буфера:
20 мМ Трис-HCl, рН 7,5
10 мМ NaCl
3 мМ MgCl2
2 мМ ДТТ
1x коктейль ингибиторов протеаз ЭДТА свободной
РНКазы Выход 5 мкл / мл (ингибитор РНКазы)
Цитоплазма лизирующего буфера:
0,2 М сахарозе
1,2% Тритон Х-100
NETN-150 промывочного буфера:
20 мМ Трис-HCl, рН 7,4
150 мМNaCl
0,5% NP-40
3 мМ MgCl2
10% Глицерин
Связывание буфера:
10 мМ HEPES рН 7,6
40 мМ KCl,
3 мМ MgCl2
2 мМ ДТТ
5% глицерина

Таблица 2: Буферные композиции.

1. Подготовка клеток и матрицей аффинной

  1. Культура клеточная линия интереса к югу от слияния (80%) в 10 см чашку. Используйте 10 см пластины для независимых иммунопреципитации (IP) флагового-меченый NLS-MS2 белка оболочки. Выполните IP с помощью антисыворотки к FLAG-эпитопа тега. Выражая флаге-меченый MS2 белка оболочки плазмиды, трансфекции клеток 24-48 ч до начала уборки урожая 20.
    Примечание: Конкретный RNP может быть обогащена от ядерной или цитоплазмеIC лизаты или биохимически-фракционированного препарат, например фракций градиента сахарозы. Рекомендуется, чтобы урожай лизат от не-трансфицированных клеток параллельно возбуждать дополнительный отрицательный контроль.
  2. Передача 60 мкл на IP белок G магнитный шарик суспензии в 1,7 мл трубки микроцентрифужных.
  3. Поместите пробирку на магнитной стойке для микроцентрифужных трубки, чтобы отделить шарики из раствора для хранения.
  4. Удалите решение для хранения данных с помощью тщательно выводили его с микропипетки.
  5. Снимите трубку от магнита стойки.
  6. Мытье и уравновешивать бусинки с 600 мкл ( в 10 раз использованную объем гранул) 1х промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 3 мМ MgCl 2, и 150 мМ NaCl) , и конец поверх конца вращения для 3 мин при комнатной температуре.
  7. Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.
  8. Добавьте 10 томов (600 мкл) 1x промывочного буфера и иммунопреципитации FLAG антитела к уравновешенной прotein G магнитные шарики (в зависимости от суммы, рекомендованные изготовителем для иммунопреципитации) и поворачиваем конец через конец при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут, чтобы конъюгат антитело иммунопреципитации. С помощью соответствующего изотипа IgG в качестве подходящего антитело отрицательного контроля.
  9. Поместите пробирку на магнитной стойке, чтобы собрать шарики и для удаления супернатанта.
  10. Извлеките трубку от магнита стойки и моют Антитело-гранулами, конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) 1х промывочного буфера и вращения в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды.
  11. Поместите пробирку на магнитной стойке и удалите промывочный буфер.

2. Сбор сайтов RNPs

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка RNPs во время инкубации после этапа 1.8.

  1. Удалить культуральную среду из клеток отсасыванием и промыть клетки дважды с 1-5 мл охлажденной льдом 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). С помощью мобильного скребок, чтобы сместить влажный,прилипшие клетки до сбора путем центрифугирования при 226 мкг в течение 4 мин при 4 ° С.
  2. Добавьте 375 мкл охлажденного на льду, с низким содержанием соли буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 3 мМ MgCl 2, 10 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, 1x протеаза-ингибитор коктейль, ЭДТА-свободный, и 5 мкл / мл РНКазы Ингибитор) к осадку клеток и позволяют припухлость, поместив его на льду в течение 5 мин.
    Примечание: портного объема низкого солевого буфера в соответствии с размером клеточного осадка. Что соответствует 1,2 × 10 6 клеток от 10 см планшета, 375 мкл буфера достаточен.
  3. Для того, чтобы собрать цитоплазматический клеточный лизат, добавляют 125 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса (0,2 М сахарозы / 1,2% Тритон Х-100), а затем выполнить 10 ударов с помощью гомогенизатора Даунса, который был предварительно охлажденные в ведре со льдом.
    Примечание: Для того, чтобы собрать общий клеточный экстракт, стандартный РИПО буфера для лизиса рекомендуется для солюбилизации нуклеоплазме / хроматина.
  4. Спин в микроцентрифуге на максимальной скорости (16 000 XG) в течение 1 мин; это приведет к удалению супернатант мусора аго ядра.
  5. Передача супернатант в новую 1,7 мл микроцентрифужных трубки, которая была на льду. Определить общую концентрацию белка с помощью стандартного, лабораторно предпочтительным способом, таким как Бредфорда 23. Резервный аликвоты по крайней мере, 10% для Вестерн-блот-анализа, который будет использоваться в качестве элемента управления вводом. Используйте заготовленную клеточный лизат непосредственно для иммунопреципитации или хранить его при температуре -80 ° С для последующего анализа.
    Примечание: По нашему опыту, эти образцы могут быть сохранены и использованы несколько месяцев для анализа иммунопреципитации без компромисса целостности.

3. иммунопреципитация

  1. Добавьте требуемый объем заготовленной лизата клеток, основанный на концентрации белка, определенной на шаге 2.5, с антителом, конъюгированным с бусинами мишеней. Использование 1x промывочного буфера, довести общий объем до 600 мкл и вращать концевую перепроизводство конец в течение 90 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Этот период времени достаточно для созданиянадежная изоляция RNP комплексов с высоким сродством при минимизации неспецифического связывания. Развести альтернативные источники RNP, такие как фракции градиенте сахарозы, по крайней мере, 1: 1 с 1х промывочным буфером, а затем инкубируют их с ранее полученными бусинка-антитело, как было упомянуто выше.
  2. Через 90 мин инкубации поместите IP-трубку на магнитной стойке, чтобы собрать бусы. Резервный супернатант проточных.
    Примечание: Этот первый проточный является важным контрольным образцом для измерения эффективности IP. Анализ иммуноблот будет обеспечивать индикацию эффективности ИС, а также специфичность исследуемых взаимодействий. Рекомендуется сохранить этот супернатант для нисходящего анализа.
  3. Промыть RNP-Bound, антитело-гранулами , конъюгированными с 10 объемами (600 мкл) охлажденного льдом NETN-150 буфером для промывки (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 150 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2, 0,5% NP40, и 10% глицерина) при вращении в течение 3 мин при комнатной температуре. Повторите шаг 3 раза.
    Примечание: Этот буфер отличается от буфера для лизиса и эффективно снижает слабые или неспецифические ассоциации.
  4. После последней промывки, ресуспендируют Иммобилизованная RNP комплексы в 60 мкл охлажденного льдом 1х буфере для связывания (10 мМ HEPES, рН 7,6; 40 мМ KCl, 3 мМ MgCl 2, 5% глицерина и 2 мМ DTT) и резерв 10% иммобилизованных сложных бусинок для вестерн-блоттинга и 20% для выделения РНК.

4. Элюирование

  1. Отрегулировать оставшийся объем до 100 мкл охлажденного льдом буфера 1х связывания и нагревают пробирку при 70 ° С в течение 3 мин.
  2. Для выделения родственных РНК-белковых комплексов, добавить ~ 30 нт ДНК олигонуклеотид, комплементарный границе с 3'-последовательность РНК интереса и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре при осторожном качалки (100 нМ олигонуклеотида достаточно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: олигонуклеотид антисмысловой нуклеотидных остатков, прилегающих к переводу запуска сайт PCE конструкции, используемой в качестве examplе в этом протоколе. Соответствующая последовательность комплементарность обеспечивается ~ 40% содержанием GC. Конструкция антисмысловой олигонуклеотид для эффективной гибридизации с минимальной комплементарной области РНК-мишени.
  3. Добавить 5-10 единиц РНКазы H в пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы расщепить РНК РНК: ДНК-гибрида. Передача супернатант в стерильном 1,7 мл микроцентрифужных трубки; Этот образец содержит захваченные RNP комплексы, представляющие интерес.
    Примечание: В зависимости от доступности родственного РНК, два или более циклов обработки РНКазой H может быть полезным для увеличения численности выборки для последующих анализов.
  4. Используйте 20% элюата в Вестерн-блот-за известных ассоциированных белков и 20% элюата для выделения РНК с последующим RT кПЦР. Остальные 60% могут быть использованы для масс-спектрометрии или для идентификации белковых компонентов.
  5. Параллельно, при условии аликвоты зарезервированной клеточного лизата до выделения РНК и ОТ-ПЦР. Это ассssment обеспечивает индикацию обогащения РНК внутри РНП комплекса.
    Примечание: Используйте изолированный препарат белка в контрольной вестерн-блоттинга, чтобы убедиться, что расщепление РНКазы Н был эффективен в освобождении RNP от immunuoprecipitated комплекса.

5. Белок Анализ Электрофорез и Вестерн-блот

  1. При условии примерно 10-20% от общего объема образца SDS-PAGE и иммуноблоттинга в соответствии со стандартным лабораторным протоколом.
    Примечание: Этот шаг служит для проверки эффективности и специфичности IP перед ниже по течению анализа РНК. Он также может быть использован для оценки белковой композиции изолированного RNP комплекса.

6. Сбор РНК Иммунопреципитированные

Примечание: Выделение РНК можно сделать с помощью метода Trizol или после описанного протокола.

  1. Ресуспендируют половину от общей выборки в 750 мкл кислотного реагента гуанидина тиоцианата и инкубировать при комнатной темпера тура в течение 5 мин до экстракции РНК из захваченных PCE-RNP комплексов.
  2. Добавить 200 мкл хлороформа в пробирку, энергично встряхивают в течение 10 сек, и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
  3. После центрифугирования при 16000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С, собирают водной фазы в заново пробирку и добавляют равный объем изопропилового спирта. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение не менее 10 мин. Добавляют 1 мкл гликоля синего к образцу и хранить его при температуре -20 ° C в морозильной камере для эффективного осаждения или обработки в будущем.
  4. Отцентрифугировать пробирку при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Осторожно собрать и отбросить супернатант с тем, чтобы не нарушить РНК гранул; использование п-200 микропипетки наконечник рекомендуется, чтобы облегчить этот процесс.
  5. Добавьте 500 мкл 75% этанола в каждую пробирку, вихревые, и центрифугировать пробирки при 16000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Осторожно собрать и отбросить супернатант, как на этапе 6.4. Воздух-сухой осадок в течение 2-3 мин и ресуспендируют в 100 мкл РНКазы воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивать время, в течение пеллетах воздух сушит, чтобы избежать проблем с взмучивания.
  6. Применить 100 мкл образца РНК на колонку очистке РНК. Процесс его с использованием протокола производителя. Элюции РНК в 30 мкл РНКазы воды и хранить при температуре -80 ° С в течение до 3-х месяцев.
    Примечание: Эта изолированная РНК подходит для нисходящего анализа с помощью ОТ-ПЦР реального времени (КПЦР), микрочипов и РНК последовательности. В зависимости от избытка RNP и эффективность, с которой РНП интерес изолирована, то же лизат может быть подвергнут двум и более раундов IP для генерации достаточного количества РНК, применимый для нисходящего потока анализов.

7. обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с помощью ПЦР

  1. Тема выделенной РНК обратной транскрипции с помощью случайного праймера с помощью обратной транскриптазы высокого качества (RT), в соответствии с производинструкции cturer в.
  2. Для амплификации РНК интерес, сконструировать ген-специфического антисмыслового праймера в последовательности расщепления РНКазы Н. Используйте аналогичные количества антисмыслового олигонуклеотида, случайным праймером, или праймера олиго-дТ (см Материалы таблицу).
    Примечание: олиго-дТ праймера и поли-adenylated мРНК обеспечивают положительные реакции управления для реакций ОТ-ПЦР.
  3. Резерв 5% от реакции РТ (1 мкл) для препаративной кПЦР сделано в тандеме с негативного контроля лизата IP и образцы ДНК позитивного контрол, чтобы определить частоту среза и произвести стандартную кривую. Если значение КТ препаративной кПЦР находится вне диапазона стандартной кривой, разбавлять реакцию RT в следующих друг за другом 1: разведений 5 и повторить шаг 7.2.
    Примечание: Для получения РНК-последовательности и масс-спектрометрического метода, пожалуйста, см Дополнительный файл метода. Пожалуйста , нажмите здесь , то просмотра этого файла Дополнительный метод. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты предыдущих RIP определены ретровирусных кляп РНК и выбраны клеточные РНК , которые сопреципитат с DHX9 / РГА, в том числе ВИЧ-1, 6 Джунд 6 и Хур (Fritz и Борис-Лори, неопубликованный). Ретровирусный 5 'НТО было продемонстрировано, сопреципитата с DHX9 / RHA в ядре и взаимодействовать изолируют в цитоплазме на полирибосом. Он однозначно определяется как цис - -Актерское пост-транскрипционного элемента управления (PCE) 6. Для выделения р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.

Преимущество использования олигонуклеотид-направленного РНКазы H расщепления для выделения РНП является способность захватывать и конкретно анализировать цис-РНК элемент RNP на гетерогенных RNPs связанных вниз по течению к цис-РНК интересующего элемента. Поско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads ProteinG Invitrogen10004D
Anti-FLAG антителоSigmaF3165
Anti-FLAG антителоSigmaF7425
Anti-RHA антителоVaxronPA-001
TRizol LS реактивLife technology10296-028
РНКаза HAmbionAM2292
ХлороформFisher ScientificBP1145-1
ИзопропанолFisher ScientificBP26184
RNaeasy clean колонкаQiagen74204
Omniscript обратная транскриптазаQiagen205113
РНКаза OutInvitrogen10777-019
Коктейль ингибиторов протеазыRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
ГлицеринFisher Scientific17904
Случайные гексамерные праймерыInvitrogenN8080127
Oligo-dT праймерыInvitrogen
ПЦР-праймерыIDTГен-специфические праймеры для  ПЦР-амплификация
Олигонуклеотид для РНКазы H опосредованное расщеплениеIDTАнтисмысловой праймер для целевой РНК
ТрипсинGibco Life technology25300-054
DMEM среда для культуры тканейGibco Life technology11965-092
Фетальная бычья сывороткаGibco Life technology10082-147
Трис основаниеFisher ScientificBP152-5
Хлорид натрияFisherScientific S642-212
Хлорид магнияFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
СахарозаFisher ScientificBP220-212
Нитроцеллюлозная мембранаBio-Rad1620112
Магнитная подставка1,7 мл микроцентрифужная пробирка для хранения
ламинарного колпакаДля инкубатора
2культуры тканей животных
Белковый гелевый аппаратРазделение белковых образцов
АппаратПеренос белковых образцов
Готовый продукт протеиновые гели (4-15%)Разделение образцов
белка НастольнаяГранулирование вниз по образцу
Настольный вращательПеремешайте образец встык
ВихрьСмешайте образцы
AM5730G CO для для переноса белков центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FLAGH

Похожие статьи