В этой рукописи описывается подход к выделению отдельных родственных РНП, образующихся в эукариотических клетках, с помощью специфического обогащения, направленного на олигонуклеотиды. Мы демонстрируем применимость этого подхода путем выделения родственного РНП, связанного с ретровирусной 5'-нетранслируемой областью, состоящей из геликазы А DHX9/РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Частицы рибонуклеопротеина управляют биогенезом и посттранскрипционной регуляцией всех мРНК через различные комбинации РНК-связывающих белков. Они состоят из позиционно-зависимых, цис-действующих элементов РНК и уникальных комбинаций РНК-связывающих белков. Определение состава конкретного РНП имеет важное значение для достижения фундаментального понимания регуляции генов. Изоляция избранного RNP сродни поиску иголки в стоге сена. В данной работе мы демонстрируем подход к выделению РНП, ассоциированных в 5'-нетранслируемой области выбранной мРНК в асинхронных, трансфицированных клетках. Было продемонстрировано, что этот родственный РНП необходим для трансляции отдельных вирусов и генов клеточной реакции на стресс.
Продемонстрированный протокол совместного осаждения РНК-белка подходит для последующего анализа белковых компонентов с помощью протеомных анализов, иммуноблотов или подходящих биохимических идентификационных анализов. Этот экспериментальный протокол демонстрирует, что геликаза DHX9/РНК А обогащена на 5'-конце родственной ретровирусной РНК, и предоставляет предварительную информацию для идентификации ее ассоциации с родственными мРНК huR и junD, связанными с клеточным стрессом.
Введение
Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК - связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.
....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
| Буферные композиции |
| Промывочный буфер: |
| 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4 |
| 150 мМ NaCl |
| 3 мМ MgCl2 |
| С низким содержанием соли буфера: |
| 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 |
| 10 мМ NaCl |
| 3 мМ MgCl2 |
| 2 мМ ДТТ |
| 1x коктейль ингибиторов протеаз ЭДТА свободной |
| РНКазы Выход 5 мкл / мл (ингибитор РНКазы) |
| Цитоплазма лизирующего буфе.... |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Результаты предыдущих RIP определены ретровирусных кляп РНК и выбраны клеточные РНК , которые сопреципитат с DHX9 / РГА, в том числе ВИЧ-1, 6 Джунд 6 и Хур (Fritz и Борис-Лори, неопубликованный). Ретровирусный 5 'НТО было продемонстрировано, сопреципитата с DHX9 / RHA в ядре и взаимодействовать изолируют в цитоплазме на полирибосом. Он однозначно определяется как цис - -Актерское пост-транскрипционного элемента управления (PCE) 6. Для выделения р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.
Преимущество использования олигонуклеотид-направленного РНКазы H расщепления для выделения РНП является способность захватывать и конкретно анализировать цис-РНК элемент RNP на гетерогенных RNPs связанных вниз по течению к цис-РНК интересующего элемента. Поско.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein | G Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG антитело | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG антитело | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA антитело | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS реактив | Life technology | 10296-028 | |
| РНКаза H | Ambion | AM2292 | |
| Хлороформ | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Изопропанол | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean колонка | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript обратная транскриптаза | Qiagen | 205113 | |
| РНКаза Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Глицерин | Fisher Scientific | 17904 | |
| Случайные гексамерные праймеры | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT праймеры | Invitrogen | ||
| ПЦР-праймеры | IDT | Ген-специфические праймеры для ПЦР-амплификация | |
| Олигонуклеотид для РНКазы H опосредованное расщепление | IDT | Антисмысловой праймер для целевой РНК | |
| Трипсин | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM среда для культуры тканей | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Трис основание | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Хлорид натрия | Fisher | Scientific S642-212 | |
| Хлорид магния | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Сахароза | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Нитроцеллюлозная мембрана | Bio-Rad | 1620112 | |
| Магнитная подставка | 1,7 мл микроцентрифужная пробирка для хранения | ||
| ламинарного колпака | Для инкубатора | ||
| 2 | культуры тканей животных | ||
| Белковый гелевый аппарат | Разделение белковых образцов | ||
| Аппарат | Перенос белковых образцов | ||
| Готовый продукт протеиновые гели (4-15%) | Разделение образцов | ||
| белка Настольная | Гранулирование вниз по образцу | ||
| Настольный вращатель | Перемешайте образец встык | ||
| Вихрь | Смешайте образцы |
Ссылки
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functi....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
