CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

Summary

В настоящем докладе описывается кубического протокол для уточнения полной толщины кожи мыши биопсию, и визуализировать экспрессии белка шаблоны, пролиферирующие клетки и себоцитов в одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий.

Abstract

Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Наружный слой эпидермиса состоит из межфолликулярного эпидермиса, который является многослойный чешуйчатый эпителий, покрывающий большую часть нашего тела, и эпидермальных придатков, таких как волосяные фолликулы и потовые железы. Эпидермис подвергается регенерации на протяжении всей жизни, и в ответ на травму. Это обеспечивается с помощью K14-экспрессирующие базальные популяции стволовых / прогениторных клеток эпидермиса, которые жестко регулируется несколькими регуляторных механизмов активных внутри эпидермиса и между эпидермиса и дермы. В данной статье описывается простой метод для выяснения полной толщины мыши биопсии кожи, и визуализировать паттерны экспрессии белка K14, Ki67 помеченных пролиферирующие клетки, нильский красный маркированы себоцитов и DAPI ядерной маркировки на одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить и количественную оценку анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий. Кубическая протокол йе лучший метод, доступный на сегодняшний день для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий в полной толщины биопсии кожи на одной резолюции клетки.

Introduction

Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Она состоит из трех основных слоев наружные эпидермис, дерму и подкожную клетчатку. Эпидермис является весьма регенеративных тканей. Это плоскоклеточный многослойный эпителий, состоящего в основном из кератиноцитов. Кератиноциты рождаются в базальном слое, и двигаться вверх через супрабазальных слои дифференцируя, и в конце концов они опадают во внешнем рогового слоя примерно через месяц после их рождения. Эпидермис развивается ряд придатков, включая волосяные фолликулы и сальные железы. Волосяные фолликулы также регенерируют в циклическом моды на протяжении всей жизни ^1. Регенерационная способность эпидермиса включена наличием стволовых клеток и клеток - предшественников, которые расположены в базальном слое межфолликулярного эпидермиса и волосяных фолликул ^2.

Многие сигнальные пути участвуют в развитии эпидермального и регенерации. Некоторые из них происходят в пределахтолько на эпидермис, такие как путь ежа. Другие сигнальные события происходят между дермы и эпидермиса ^3. Например, Wnt сигналы от дермы , как полагают , являются важными для развития волосяного фолликула, и они секретируются дермального сосочка в начале анагена для активации волосяной фолликул выпуклость пролиферации стволовых клеток / клеток - предшественников и рост волосяного фолликула ^4. Важно понимать клеточные и молекулярные механизмы, которые контролируют развитие эпидермальный и регенерации, чтобы лучше понять, как они могут быть возмущенных в регенеративной заболевания кожи, такие как рак кожи.

В данной статье описывается C Лира, U nobstructed B дождь I maging коктейли и omputational анализ (кубические) протокол C ^5-7 уточнить целые препараты кожи монтирование, и визуализировать паттерны экспрессии белка в 3 -х измерениях на одном разрешении клеток с помощью конфокальной микроскопии. Кубическая метод предполагает погружение кожиткани в двух аминоспирт на основе химических коктейлей. Эти решения корректировать показатели преломления в образце кожи, оставляя ткань прозрачной и белки нетронутыми, что позволяет иммунологического в одной резолюции ячейки.

Используя этот CUBIC протокол, базальную и пролиферирующие популяции кератиноцитов в эпидермисе межфолликулярного и в волосяных фолликулах были обследованы в полной толщины кожи биопсий мышей дикого типа с использованием анти-Keratin14 (K14) и анти-Ki67 антител. Сальные железы в дикого типа биопсии кожи также были визуализированы с помощью Нила Красное окрашивание. И, наконец, базальные популяции кератиноцитов дикого типа и гиперпластических биопсии кожи YAP2-5SA-delta ; C сравнивали ^8.

Этот протокол позволяет КУБИЧЕСКИЙ визуальную оценку экспрессии белка в полной толщины биопсии кожи в одной резолюции клетки, и является важным инструментом, чтобы оценить эпидермальный анатомию и морфологические дефекты в коже генетически модифицированныхмышей, и исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития эпидермальный и регенерации.

Protocol

Этика Заявление: Все процедуры, связанные с предметов животного происхождения следуйте рекомендациям по уходу и комитетом по этике животных (ACEC) в UNSW Австралии в соответствии с утвержденным протоколом ACEC 13 / 64В.

1. Подготовка Прозрачная Маус ткань кожи

Примечание: Все мыши, используемые в данном исследовании, были на C57BL / 6 генетического фона

1. Коллекция тканей кожи мыши.
   1. Гуманно усыпить мышей путем смещения шейных позвонков.
   2. Осторожно удалите волоски из соответствующего участка кожи с триммером Стараясь не поранить кожу.
   3. Промыть кожу обеззараживать с 70% -ным этанолом в фосфатном буферном растворе (PBS).
   4. Поднимите спинной кожи шеи с пинцетом и сделать разрез с ножницами.
   5. Рассеките большой участок кожи спинной мыши (примерно 1,5 х 4 см).
   6. Свести кожи дермы стороной вниз на фильтровальную бумагу, и обратите внимание на передне-задней ориентации образца.
   7. Triм фильтровальную бумагу вокруг рассеченной кожи, и место, в 15 мл пробирку, заполненную свежеприготовленный 4% -ном растворе параформальдегида (PFA) в PBS.
   8. Закрепить в течение 1 ч при комнатной температуре, или в течение ночи в холодильнике при температуре 4 ° С.
   9. Промыть кожу 2 х 5 мин в PBS в 15 мл пробирку.
      Примечание: Следующая (1.1.10 - 1.1.12) являются необязательными этапами для длительного хранения тканей.
   10. Высушить расчлененный кожи в PBS с увеличением концентрации этанола (25%, 50% 70%) в 15 мл трубки во время стадий промывки 1-ч при комнатной температуре.
   11. Храните обезвоженной кожи в 70% этаноле в PBS в 15 мл пробирку при 4 ° С до дальнейшего использования.
   12. За 4 часа до очистки, регидрировать ткани кожи в PBS с уменьшением концентрации этанола (70%, 50%, 25%, 0%) в 15 мл трубки во время стадий промывки 1-ч при комнатной температуре.
2. Очистка биопсии кожи мыши
   1. Подготовьте CUBIC1 клиринговую раствор путем растворения 3,85 г мочевины и 3,85 г N, N, N ', N'-tetrakis (2-гидроксипропил) этилендиамин в 5,38 мл дистиллированной воды на нагревател, установленного на 60 - 70 ° C. Используйте горячую мешалку.
   2. Добавить 2,31 г Полиэтиленгликоль моно-п-isooctylphenyl эфир / тритона Х-100 к раствору сразу понятно и охлаждают до комнатной температуры.
   3. Порезать кожу мыши с острым лезвием бритвы в биоптатах примерными размерами 0,2 х 0,5 см, и погружать в 5 мл CUBIC1 клирингового раствора в 15 мл пробирку. Для оптимизации визуализации волосяных фолликулов, убедитесь, что длинная сторона биопсии разрезают вдоль передне-заднем направлении образца.
   4. Место на поворотную платформу в качестве гибридизационного печи при температуре 37 ° С.
   5. Изменение клиринговую раствора через 7 дней. Подготовьте свежий CUBIC1 раствор перед использованием.
   6. Проверьте прозрачность ткани через 7 дней. При необходимости оставить биопсий в клиринговой растворе CUBIC1, пока ткань не будет полностью прозрачным.
   7. После того, как биопсия кожи является прозрачным,удаления раствора CUBIC1, и добавить 4 мл 1 × PBS мыть в ткань 4 раза в течение 6 ч при 37 ° С.
   8. Промыть ткань кожи в 20% вес / объем сахарозы в PBS в 15 мл пробирку в течение 4 ч при 37 ° С.
   9. Замораживание ткани в монтажной среды Оптимальная температура резания (ОКТ) Соединение в 15 мл пробирку в течение ночи в морозильной камере C -80 °.
      Примечание: Этот шаг увеличит проницаемость биопсии для проникновения антител в последующих стадиях.

2. Иммунофлуоресценции Окрашивание

1. Растаяйте ткань от 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 ч.
2. Мытье ткани в 15 мл пробирку с 5 мл PBS в течение 8 ч при комнатной температуре, чтобы удалить OCT Compound.
3. Передача биопсий в 2 мл пробирку и инкубировать ткани в 1 мл кроличьей анти-Keratin14 или кроличьей анти-Ki67 антителом, и разводили 1: 100 в PBST (PBS + 0,1% Тритон-X100) в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовку.
4. Передача биопсии в 15 мл трубки,й моют ткани, 4 раза в течение 6 ч в 5 мл PBST на шейкере в 37 ° C духовке.
5. Передача биопсий в 2 мл пробирку, добавляют 1 мл анти-кроличий Alexa594 вторичного антитела, разбавленного 1: 100 в PBST и инкубировать 3 дня на шейкере в 37 ° C духовке.
6. Передача биопсий в 15 мл трубки и промыть ткани 4 раза в течение 6 ч в 5 мл PBST на шейкере в 37 ° C духовке.
7. Передача биопсий в 2 мл пробирку, добавляют 1 мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) решение ядерной контрастное (1: 1000) в PBST и инкубировать в течение ночи на качалке при 37 ° C духовке.
8. Удалить решение counterstaining DAPI, и добавьте 1 мл PBST в 2 мл пробирку для мытья ткани 4 раза в течение 6 часов на шейкере в 37 ° C духовке.
   Примечание: Дополнительный этап Биопсии можно хранить в темноте в 1X PBS с 0,02% азида натрия в течение не менее 3-х недель.

3. Нил Красный Окрашивание

1. Растворите нильский красный порошок, в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 1 мг / мл
2. Добавить 1 мкл нильский красный раствор до 1 мл PBS до конечной концентрации 1 мкг / мл.
3. Оттепели ткани от 1.2.9) до комнатной температуры в течение 2 - 3 ч и промывают 5 мл PBS в течение 8 ч при комнатной температуре.
4. Передача биопсий в 2 мл пробирку, и погружать ткани в 1 мл раствора нильского Красное окрашивание в течение 2,5 ч при комнатной температуре.
5. Промыть биопсии кожи в 2 мл пробирку с 1 мл PBST 4 раза в течение 30 мин при комнатной температуре.
6. Удалить PBST раствор из 2 мл пробирку, прибавляют 1 мл раствора DAPI ядерной counterstaining (1: 1000) в PBST и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
7. Удалить решение counterstaining DAPI, и добавьте 1 мл PBST в 2 мл пробирку, чтобы вымыть ткани кожи 4 раза в течение 6 ч при комнатной температуре.
   Примечание: Дополнительный этап Биопсии можно хранить в темноте в 1X PBS с 0,02% азида натрия в течение не менее 3-х недель.

4. обработки изображений

1. Подготовьте CUBIC2 клиринговую раствор, который содержит 50% (Вес / объем) сахарозы, 25% (вес / объем) мочевины, 10% (вес / объем) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, и 0,1% (об / об) Тритона X-100.
2. Инкубируйте ткани кожи в 1 мл раствора CUBIC2 в 2 мл пробирку на шейкере в течение 24 ч при 37 ° C духовке. Этот шаг будет даже показатель преломления ткани.
3. Проверьте четкость ткани. После того, как это понятно, расположить всю биопсии кожи (0,2 х 0,5 см) на ее длинной стороне на предметное стекло покровное, таким образом, что направление длины волоса параллельно поверхности покровного (# 1 24 х 60 мм)
   Примечание: Дополнительный этап Антитело Измазанные биопсий можно хранить в CUBIC2 растворе в течение примерно 7 дней. Найл Ред Измазанные биопсий можно хранить только в растворе CUBIC2 до 1 дня, и должны быть отображены как можно скорее.
4. Подготовка изображения камеры (Рисунок 1)
   Примечание: Расходные материалы, необходимые для подготовки изображения камеры являются: голубой клейкость, лепка или подобное, и 2 покровные (24 х 50 мм) (Figure 1А).
   1. Приготовьте две тонкие полоски синего клейкости (диаметр примерно 1 мм х 2 см) и два покровных (рис 1б).
   2. Поместите синие клейких полосок на одном покровным, что позволяет достаточно места для кожи биопсии (Рисунок 1С). 4.4.3)
   3. Поместите биопсию кожи между полосами на покровное в капле раствора CUBIC2 (рис 1C).
   4. Накройте биопсия кожи со вторым покровным (рис 1D).
5. Поместите камеру формирования изображения с установленной биопсии кожи на стадии конфокальной микроскопии и перемещения ткани в световой путь.
6. Сканирование образца с использованием ртути или галогена источника света и стандартные эпифлуоресцентной фильтры (например, DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) для выявления флуоресцентно окрашенных областей , представляющих интерес.
7. Изображение области интереса с использованием объектива 10X и 20X (NA 0.75) и стандартные методы визуализации конфокальной флуоресцентной (например., С Д.А.PI окрашенных образцов освещения с 405 нм лазером и сбор флуоресценции сигнала между 425 - 475 нм, а также с Alexa Fluor 594 или нильский красный окрашенных образцов освещают с 561 нм лазером и сбор флуоресценции сигнала между 570 - 620 нм).
8. Генерация изображений Z-стеки каждой области , представляющей интерес с помощью микроскопа Z-стека программного обеспечения захвата изображений (например., С использованием NIS элементов формирования изображения программного обеспечения 4.13 , как описано ниже).
   1. Обеспечить оптимальную мощность лазера и PMT HV / Смещение настройки были выбраны для сбора образца флуоресценции.
   2. Откройте панель инструментов "ND Приобретение" из "Controls" Приобретение.
   3. Выберите вкладку "Настройка серии Z" (убедитесь, что все остальные вкладки невыделенная).
   4. В то время как живого сканирования, фокус на верхней части образца и нажмите кнопку "Top".
   5. Основное внимание на нижней части образца и нажмите на кнопку "Bottom".
   6. Входной требуемый размер шага (или нажмите кнопку оптимизированный размер шага).
   7. досс "Запуск" кнопку.
   8. Сохранить результирующие Z-стеки в виде отдельных Tiff стеков изображения (1 флуорохром на каждое изображение Z-стек).
9. Используйте изображение Z-стеки реконструировать 3D объемные области интереса с использованием 3D программного обеспечения для анализа (например., Используя Imaris x64 7.2.3 , как описано ниже).
   1. Запустите программное обеспечение для анализа.
   2. Выберите кнопку "перегнать" в панели инструментов для генерации 3D-объема.
   3. Открыть первого цветное изображение Z-стека (например., DAPI).
   4. Используйте "Добавить канал" инструмент для добавления дополнительных цветовых каналов, один канал флуорохромом. Таким образом, образец, содержащий как DAPI и Alexa Fluor 594 флуорохромии потребуется два канала.
   5. Используйте "Свойства" инструмент для установки правильно пикселей (вокселей) размеры (XYZ), как определено в 4.7 выше.
   6. Используйте "Настройка дисплея" инструмент для изменения цвета канала при необходимости (например, установить канал DAPI в синий цвет, Alexa Fluor 594 канала на красный).
   7. Рохруп- объем 3D в окне изображения, использовать компьютерную мышь, чтобы нажать и объем сопротивления по мере необходимости.
   8. Используйте "Snapshot" инструмент на панели инструментов для создания снимков экрана 3D-изображения.
   9. Используйте "Анимация" инструмент на панели инструментов для создания фильмов 3D вращения образца.

Results

Полная толщина кожи спины биопсий взрослых мышей дикого типа были выяснены, окрашивали антителом связывания базальная кератиноцитов маркера Keratin14 (K14), и ядер были контрастно с DAPI красящим раствором (рис 2 и Movie 1).

DAPI-положительных ядер были видны по всему образцу (рис 2А, С), и К14 окрашивание было видно исключительно в толстом слое базальных одноклеточного из межфолликулярного эпидермиса, и с изложением сальные железы (черные з...

Discussion

Регуляторные механизмы, контролирующие развитие кожи и гомеостаз наиболее часто изучаются в 2D с использованием секционирования ткани и гистологическое окрашивание или мечение с антителами, что позволяет лишь ограниченную оценку морфологии кожи, клеточных популяций или экспрессии белка. Ряд методов были разработаны с целью улучшения визуализации пространственной организации клеток и белков в одной резолюции клетки в 3 -х измерениях в эпидермальных тотальных ^10-13. Некоторые из них тем не менее включать раздел...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	P6418
Этанол 96% (неденатуированный)	Chem-supply	UN1170
Нильский красный	Сигма-Олдрич	72485-100MG
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -тетракиса (2-гидроксипропил) этилендиамина	Merck Millipore	821940
Моно--изооктилфениловый эфир полиэтиленгликоля	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
сахарозы	Sigma-Aldrich	S0389
Соединение оптимальной температуры резания (ОКТ)	Ткань-Tek	4583
антитело против кератина14	Covance	PRB-155P
антитело против Ki67	Abcam	ab16667
Ослик против кролика Alexa 594	Life Technologies	A21207
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650
Мочевина	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-нитрилотриэтанол	Merck Millipore	137002
Конфокальный микроскоп	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Конфокальный микроскоп
cruZer6 Лицевой триммер	Braun	Braun cruZer6 Лицевой
азид	натрия Sigma-Aldrich