CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

Summary

В настоящем докладе описывается кубического протокол для уточнения полной толщины кожи мыши биопсию, и визуализировать экспрессии белка шаблоны, пролиферирующие клетки и себоцитов в одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий.

Abstract

Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Наружный слой эпидермиса состоит из межфолликулярного эпидермиса, который является многослойный чешуйчатый эпителий, покрывающий большую часть нашего тела, и эпидермальных придатков, таких как волосяные фолликулы и потовые железы. Эпидермис подвергается регенерации на протяжении всей жизни, и в ответ на травму. Это обеспечивается с помощью K14-экспрессирующие базальные популяции стволовых / прогениторных клеток эпидермиса, которые жестко регулируется несколькими регуляторных механизмов активных внутри эпидермиса и между эпидермиса и дермы. В данной статье описывается простой метод для выяснения полной толщины мыши биопсии кожи, и визуализировать паттерны экспрессии белка K14, Ki67 помеченных пролиферирующие клетки, нильский красный маркированы себоцитов и DAPI ядерной маркировки на одной резолюции ячейки в 3D. Этот метод позволяет точно оценить и количественную оценку анатомии кожи и патологии, а также аномальных эпидермальных фенотипов в генетически модифицированных мышей линий. Кубическая протокол йе лучший метод, доступный на сегодняшний день для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий в полной толщины биопсии кожи на одной резолюции клетки.

Introduction

Кожа имеет важное значение для нашего выживания. Она состоит из трех основных слоев наружные эпидермис, дерму и подкожную клетчатку. Эпидермис является весьма регенеративных тканей. Это плоскоклеточный многослойный эпителий, состоящего в основном из кератиноцитов. Кератиноциты рождаются в базальном слое, и двигаться вверх через супрабазальных слои дифференцируя, и в конце концов они опадают во внешнем рогового слоя примерно через месяц после их рождения. Эпидермис развивается ряд придатков, включая волосяные фолликулы и сальные железы. Волосяные фолликулы также регенерируют в циклическом моды на протяжении всей жизни ^1. Регенерационная способность эпидерми....

Protocol

Этика Заявление: Все процедуры, связанные с предметов животного происхождения следуйте рекомендациям по уходу и комитетом по этике животных (ACEC) в UNSW Австралии в соответствии с утвержденным протоколом ACEC 13 / 64В.

1. Подготовка Прозрачная Маус ткань кожи

Примечание: Все мыши, используемые в данном исследовании, были на C57BL / 6 генетического фона

1. Коллекция тканей кожи мыши.
   1. Гуманно усыпить мышей путем смещения шейных позвонков.
   2. Осторожно удалите волоски из соответствующего участка кожи с триммером Стараясь не поранить кожу.
   3. Промыть кожу обеззараживать с 70% -ным э....

Results

Полная толщина кожи спины биопсий взрослых мышей дикого типа были выяснены, окрашивали антителом связывания базальная кератиноцитов маркера Keratin14 (K14), и ядер были контрастно с DAPI красящим раствором (рис 2 и Movie 1).

DAPI-положительных ядер были видны по всему образцу (рис 2А, С), и К14 окрашивание было видно исключительно в толстом слое базальных одноклеточного из межфолликулярного эпидермиса, и с изложением сальные железы (черные з.......

Discussion

Регуляторные механизмы, контролирующие развитие кожи и гомеостаз наиболее часто изучаются в 2D с использованием секционирования ткани и гистологическое окрашивание или мечение с антителами, что позволяет лишь ограниченную оценку морфологии кожи, клеточных популяций или экспрессии белка. Ряд методов были разработаны с целью улучшения визуализации пространственной организации клеток и белков в одной резолюции клетки в 3 -х измерениях в эпидермальных тотальных ^10-13. Некоторые из них тем не менее включать раздел.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	P6418
Этанол 96% (неденатуированный)	Chem-supply	UN1170
Нильский красный	Сигма-Олдрич	72485-100MG
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -тетракиса (2-гидроксипропил) этилендиамина	Merck Millipore	821940
Моно--изооктилфениловый эфир полиэтиленгликоля	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
сахарозы	Sigma-Aldrich	S0389
Соединение оптимальной температуры резания (ОКТ)	Ткань-Tek	4583
антитело против кератина14	Covance	PRB-155P
антитело против Ki67	Abcam	ab16667
Ослик против кролика Alexa 594	Life Technologies	A21207
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650
Мочевина	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-нитрилотриэтанол	Merck Millipore	137002
Конфокальный микроскоп	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Конфокальный микроскоп
cruZer6 Лицевой триммер	Braun	Braun cruZer6 Лицевой
азид	натрия Sigma-Aldrich