Методическая статья

Определение и виды Количественное в смесях с помощью масс-спектрометрии MRM пептидов прикладной к мясу аутентификации

DOI:

10.3791/54420

⸱

20 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Analytical Sciences Unit, Institute of Food Research, 2Institute of Food Research, 3School of Chemistry, University of East Anglia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для идентификации и количественного определения компонентов в смесях веществ, обладающих сходными белками. Масс-спектрометрия обнаруживает пептиды для идентификации и дает относительную количественную оценку по соотношению пиковых площадей. В качестве инструмента для обнаружения мошенничества метод может обнаружить 1% лошади в говядине.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем простой протокол для идентификации и количественной оценки двух компонентов в бинарных смесях видов, обладающих одним или более похожими белками. Центральное место в методе занимает идентификация «соответствующих белков» у интересующих видов, другими словами, белков, которые номинально одинаковы, но обладают видоспецифичными различиями в последовательности. При протеолизе соответствующие белки будут давать начало некоторым пептидам, которые также похожи, но имеют видоспецифичные варианты. Это «соответствующие пептиды». Видоспецифичные пептиды могут быть использованы в качестве маркеров для определения видов, в то время как пары соответствующих пептидов позволяют определить относительное количество двух видов в смеси. Пептиды обнаруживаются с помощью масс-спектрометрии с множественным мониторингом реакций (MRM) — высокоспецифичного метода, который позволяет определять виды на основе пептидов даже в сложных системах. Кроме того, соотношение пиковых площадей MRM, полученных из соответствующих пептидов, поддерживает относительную количественную оценку. Поскольку соответствующие белки и пептиды в основном ведут себя одинаково как при обработке, так и при экспериментальной экстракции и пробоподготовке, относительная количественность должна оставаться сравнительно надежной. Кроме того, этот подход не нуждается в стандартах и калибровках, требуемых методами абсолютной количественной оценки. Протокол описан в контексте красного мяса, которое имеет удобные соответствующие белки в форме соответствующих миоглобинов. Это приложение имеет отношение к выявлению фальсификации пищевых продуктов: метод может определить 1% от веса конины в говядине. Относительное количественное определение соответствующего белка и соответствующего пептида (CPCP) с использованием коэффициентов пиковой площади MRM дает хорошие оценки весового состава смеси лошади и говядины.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Европейский скандал с кониной в 2013 году, в котором незадекларированная конина была обнаружена в ряде продуктов из говядины из супермаркетов1, подчеркивает необходимость методов тестирования, способных обнаруживать и измерять фальсификацию пищевых продуктов в мясе. Было изучено несколько технологий, в частности, иммуноферментный анализ (ИФА) и методы на основе ДНК2. Альтернативный путь, основанный на масс-спектрометрии, нацелен на видоспецифичные пептиды, которые, в свою очередь, возникают из видоспецифичных белков. Здесь мы опишем один из таких подходов, основанных на пептидах, который предлагает как идентификацию, так и относительное количественное определение примесей в мяснойсмеси.

Протокол составлен в контексте красного мяса и желания определить наличие одного мяса в другом на уровне 1% по весу, уровень, который, по мнению некоторых, представляет собой фальсификацию поддельных продуктов питания, а не загрязнение4. Метод опирается, в первую очередь, на идентификацию белка, который номинально является «одинаковым» во всех целевых видах мяса. Миоглобин, белок, отвечающий за красный цвет мяса, является хорошим кандидатом, поскольку он распространен, относительно устойчив к нагреванию и растворяется в воде, и ранее использовался для определения вида мяса. Например, миоглобины для говядины (Bos Taurus), свинины (Sus scrofa), лошади (Equus caballus) и ягненка (Ovis aries)3 номинально одинаковы, как и требуется, но их последовательности не идентичны. Такие группы «похожих, но различных» белков, как эти четыре миоглобина, можно удобно описать как «соответствующие белки». Различия в последовательностях этих четырех миоглобинов являются видоспецифичными: например, полные белки миоглобина для говядины и лошади, P02192 и P68082 соответственно, содержат 154 аминокислоты с 18 различиями в последовательностях между ними. Подвергаясь протеолизу с использованием трипсина, эти белки производят два набора пептидов, некоторые из которых идентичны, а некоторые демонстрируют одно или несколько видоспецифичных аминокислотных различий: таким образом, соответствующие белки дают начало соответствующим пептидам.

Таким образом, подход CPCP сначала направлен на идентификацию белков двух или более видов, где эти белки демонстрируют ограниченные видоспецифичные варианты последовательностей. Это соответствующие белки. После протеолиза соответствующие белки дают начало пептидам, некоторые из которых также демонстрируют видоспецифичные варианты последовательностей, унаследованные от родительского белка. Это соответствующие пептиды. Подход CPCP может быть использован для сравнения уровней двух соответствующих белков в образце смешанного вида путем мониторинга уровней соответствующих пептидов.

Естественной технологией обнаружения известных пептидов является масс-спектрометрия с мониторингом множественных реакций, или MRM-MS7. Видоспецифичные пептиды дают ионы-предшественники, которые вместе с их масс-спектрометрическими фрагментами легко детализируются заранее с помощью программных инструментов. Эти списки затем используются для того, чтобы масс-спектрометр регистрировал только определенные пары прекурсоров и фрагментных ионов, называемые переходами. Таким образом, конкретный пептид-мишень идентифицируется не только по времени его удержания в хроматографии, предшествующей масс-спектрометру, но и по набору переходов, имеющих общий предшественник. Это высокоселективное средство детектирования известных пептидов, которое позволяет эффективно использовать ресурс масс-спектрометра.

Другие авторы использовали масс-спектрометрию для проверки фальсификации мяса с помощью пептидных маркеров, но из разрозненных белков8-14. Использование схемы соответствующих белков, соответствующих пептидов (CPCP), однако, позволяет оптимизировать условия эксперимента, способствуя идентификации видов в смеси по известным видоспецифичным переходам. Кроме того, соответствующие белки и пептиды, как правило, ведут себя одинаково на стадиях экстракции, протеолиза и детекции. Поскольку переходные пиковые площади являются количественными и воспроизводимыми, соотношения пиковых площадей, возникающие из пар соответствующих пептидов разных видов, обеспечивают прямую оценку относительных количеств двух видов мяса в смеси. В отличие от этого, более традиционные методы количественного определения используют калибровку на основе эталонных материалов для установления абсолютного количественного определения14,15.

Хотя протокол описан в контексте миоглобина и мяса, белки, отличные от миоглобина, могут быть использованы для идентификации и относительного количественного определения с помощью стратегии CPCP в мясных смесях, хотя потенциально с изменениями в протоколе. Кроме того, эта стратегия также применима к бинарным смесям других видов, имеющих один или несколько соответствующих белков.

Отправной точкой для протокола является очищенный "эталонный" миоглобин, который для некоторых видов можно приобрести, но для других его необходимо получить с помощью обычной эксклюзионной хроматографии. Процедура получения референсного миоглобина не включена в протокол, но описана в другом месте3. Программные средства 16 используются для перечисления пептидов-кандидатов и переходов, возникающих из миоглобинов, представляющих интерес. Каждый референтный миоглобин подвергают протеолизу, а полученные пептиды анализируют с помощью жидкостной хроматографии, электроспрея, ионизации, тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS), чтобы выяснить, какие из ионов-предшественников-кандидатов и переходов являются наиболее полезными, а также определить соответствующие времена удержания пептидов. Результатом этого этапа является пересмотренный список целевых пептидов с их переходами, пригодных для определения видов, и список пар CPCP, пригодных для относительного количественного определения. Для тестирования настоящего мяса подготавливают образцы экстракции, а затем подвергают протеолизу с получением пептидов как из миоглобина, так и из других посторонних белков. Затем пептиды на основе миоглобина контролируются с помощью LC-ESI-MS/MS на основе их перечисленных переходов. Вещества, присутствующие в смеси, идентифицируются по переходным пикам, связанным с маркерными пептидами. Оценки относительных количеств двух видов мяса в бинарной смеси рассчитываются с использованием соотношений областей переходных пиков. Набор тестовых смесей из пар мяса позволит проверить соотношение пиковых площадей для данной пары переходов и откалибровать их по сравнению с реальными смесями.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. протеолиза и анализ эталонных Myoglobins

  1. Протеолиз эталонных myoglobins
    1. Готовят растворы очищенных эталонных myoglobins (диапазон 0,2 - 0,5 мг / мл в 25 мМ бикарбоната аммония) 3.
    2. Передача 1 мл аликвоты каждого образца по 2 мл центрифужные пробирки.
    3. Термически денатурации распакованные белки путем нагрева образца в горячем блоке при 95 ° С в течение 30 мин. Охлаждают образец в течение примерно 15 мин, пока она не достигнет комнатной температуры. Добавить 30 мг мочевины (конечная концентрация 0,5 М) для улучшения пищеварения, а затем перемешать.
  2. Триптический протеолиз
    1. Приготовьте 1 мг / мл раствора трипсина в 25 мМ бикарбоната аммония и хранить на льду в соответствии с требованиями. Добавьте достаточный объем трипсина таким образом, что активность фермента является окончательным 420 ВАЕЕ (N - бензоил-L-аргинином эфира гидрохлорида этил) единиц / мг экстрагированного белка, затем перемешать, осторожно вортексе и позволяют proteolyze в течение ночи при 37 ° С.
    2. Проводят додецилсульфат натрия гель - электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) 17 , чтобы продемонстрировать полноту протеолиза.
  3. Обессоливание образца после протеолиза
    1. Разбавьте образец 1: 2: V с водой.
    2. Активизировать полимерный обращенно-фазной (RP) картридж заполнен 30 мг Р.П. материала путем добавления 1 мл метанола, затем уравновешивают картридж путем добавления 1 мл 1% муравьиной кислоты.
    3. Загрузить образец в картридж под действием силы тяжести.
    4. Промыть 1 мл 5% метанол / 1% муравьиной кислоты, под действием силы тяжести.
    5. Элюируйте пептиды с 1 мл смеси ацетонитрил / вода (90:10 по объему, 0,1% муравьиной кислоты) под действием силы тяжести в 2 мл микропробирок предварительно заполненном с 5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
    6. Растворитель удаляют в вакууме при 50 ° С с использованием центробежного испарителя в течение 120 мин, а затем повторно растворить остаток в 250 мкл смеси ацетонитрил / вода (3:97 по объему; 0,1% муравьиной кислоты).
    7. Переводраствор для флакона автосамплером низкой громкости.
      Примечание: Образцы могут храниться при температуре 4 ° С до готовности для жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (ЖХ / МС) анализа.
  4. Генерация списков переходов для управления записями
    1. Найдите миоглобина последовательности для различных мяса из базы данных UniProt.
    2. Введите миоглобина последовательности в поле "Target" программного обеспечения прогнозирования пептида и перехода (например, горизонт). При необходимости, наведите курсор мыши на пептид раскрыть свой список фрагментов.
    3. Нажмите на "Настройки" и выберите "Peptide Settings". Входные предпочтения для переваривания (т.е. трипсина) и количество пропущенных расколы (0). Введите необходимый выбор дополнительных параметров, в частности, длина пептида (6 - 25), N-терминальные исключений (0) и не предполагается модификаций аминокислот (нет).
    4. Нажмите на "Настройки" и выберите "Настройки перехода». Выберите настройки длятип инструмент, используемый для анализа LC / MS.
    5. Нажмите на "Экспорт" и выберите "Transition List ', чтобы создать таблицу, содержащую сгенерированные MRM переходов и параметров.
  5. Анализ с помощью ЖХ / МС
    1. Настройка системы бинарных градиента (вода (А) и ацетонитрил (В), каждый с 0,1% кислоты V муравьиной: V) Высокоэффективный жидкостный хроматограф (HPLC) с автоматическим пробоотборником, С18 колонки ядро ​​оболочки ВЭЖХ (10 см х 2,1 мм , 2,6 мкм, размер частиц), соединенный с тройной квадрупольный масс-спектрометр, эксплуатируемого в положительном режиме с электрораспылением с детектированием MRM.
    2. В программном обеспечении сбора данных (например, аналитик), выберите "Файл" и "Новый" и нажмите на кнопку «Приобретение метода» в всплывающем окне нажмите кнопку "OK".
      Примечание: Это открывает редактор метода инструмент, который содержит список подключенных устройств, которые позволят установку нового метода LC / MS.
    3. Нажмите на "Binary Pump", и яNput значение скорости потока (300 мкл / мин), а время градиент в таблице, устанавливая бинарный профиль градиента 3% B до 30% B в течение 22 мин, с увеличением до 100% B на 23 мин в течение 5 мин промывать прежде чем вернуться к начальным условиям и повторного установления равновесия в течение 6 мин.
    4. Нажмите на 'пробоотборник' и вставьте объем впрыска (5 мкл). Включить "Игла цикла стирки 'и введите' Wash Time '(30 сек) и выберите' Flush Port '.
    5. Нажмите на 'термостатированной контроллера колонке' и в 'Column Oven Свойства' Установить 'Left температуры' и 'правильной температуре' (40 ° C).
    6. Нажмите на "масс-спектрометром", а затем нажмите на кнопку "Изменить параметры", чтобы ввести условия источника газа. Выберите "Тип сканирования" в качестве "MRM (MRM)» и «Полярность» как «Позитивный». Перейти к 'Период Резюме' и введите '' продолжительность времени, общее время для анализа ЛКd уравновешивания (35 мин).
    7. В таблице правой кнопкой мыши и выберите "декластеризация потенциал (DP) 'и' энергии столкновения (CP) ', чтобы добавить эти столбцы в таблице. Введите Q1, Q3, время (мс), идентификатор значения DP и CE для всех переходов, для одного вида мяса, созданных в списке переходов (см шаг 1.4.5).
      Примечание: Время (мсек) относится ко времени задержки, время масс-спектрометр проводит сканирование каждого перехода, суммирование которых не должна превышать 3 сек.
    8. Сохраните файл метода приобретения (расширение файла .dam).
      Примечание: Шаги 1.5.2 - 1.5.8 должны быть повторены для каждого вида мяса. Это позволит создать единый файл метод для каждого вида мяса в экранном режиме в рамках подготовки к анализу ниже.
    9. В программном обеспечении сбора данных, нажмите на кнопку "Acquire" и выберите "уравновешивания". В открывшемся окне выберите нужный метод приобретения, чтобы начать уравновешивание прибора.
    10. Поместите образец ампул в АреПодтверждено в автоматическом пробоотборнике.
    11. Нажмите на "Файл" и выберите "New", затем "Batch Acquisition". На вкладке "Образец" выберите "Add Set", затем "Добавить образцы". Вставьте число анализируемых образцов и нажмите на кнопку "OK". В поле "Acquisition" выберите файл метод, который будет использоваться для анализа из выпадающего меню.
    12. В таблице, выберите 'Plate код "и выберите нужную конфигурацию лотка из выпадающего меню. Щелкните левой кнопкой мыши в 'Тарелка Code' заголовок столбца затем правой кнопкой мыши и выберите "Fill Down". В "Виал" Позиция ввести положение каждого образца в автоматическом пробоотборнике в строках.
    13. В "файл данных" введите имя файла для приобретения, а затем щелкните левой кнопкой мыши в заголовке столбца с последующим правой кнопкой мыши и выберите "Fill Down". В 'Sample Name "вставить личность каждого из анализируемых образцов. Сохранить как пакетного файла приобретения (файл электроннойXTension .dab).
    14. Нажмите на вкладку "Отправить" затем выделите образцы, которые должны быть проанализированы на LC / MS. Нажмите на кнопку "Отправить". Нажмите на ссылку "Приобретите" и "Старт образца", чтобы начать анализ.
      Примечание: Каждый метод сбора просканирует для MRM переходов по всей длине хроматографа для одного вида мяса. Массовые настройки спектрометра для приобретения MRM варьироваться в зависимости от типа прибора и пептида.
    15. Просмотр созданные файлы данных, используя программное обеспечение просмотра данных. Нажмите на Xic (извлекаемых ионов) и в выпадающем списке выделить все фрагменты (значения Q3) для одного предшественника (Q1). Новая панель откроется, которая показывает только выбранные переходы.
    16. Регистрируют время удерживания (R Т) для групп параллельных переходов , так как они соответствуют одному пептиду.
    17. Повторите предыдущие два шага для каждого набора переходов, чтобы назначить пики их соответствующих пептидов для каждогоиз видов мяса.
    18. Запись маркеров пептиды , которые пригодны для обеспечения идентификации видов (например, пептид HPGDFGADAQGAMTK, предшественник m / z = 752, R T = 12,0 мин, для лошади), вместе с их временем удерживания, и заметьте которые образуют соответствующие пары , подходящие для относительного количественного ,
      Примечание: Например, лошадь маркерного пептида (предшественник м / Z = 752) имеет соответствующую говяжий пептид, HPSDFGADAQAAMSK (прекурсор m / z = 767, R T = 13,2 мин).
    19. Для того, чтобы создать единый динамический метод, охватывающей все виды мяса, в программном обеспечении просмотра данных, для каждого вида мяса, в свою очередь, открыть данные XIC перехода для каждого предшественника (назначенного конкретного пептида 1.5.8).
    20. Нажмите на пик кластера в заданное время удержания левой кнопкой мыши и перетаскивая курсор под кластера. Определить наиболее интенсивные переходы (щелкнув правой кнопкой мыши на пик этикетке).
    21. Вручную записать переходыи время удерживания в электронную таблицу.
    22. Для ввода параметров в качестве нового метода динамического на LC программного обеспечения / MS, нажмите на кнопку "Масс-спектрометры", а затем нажмите на ссылку "Изменить параметры", чтобы ввести условия источника газа. Выберите "Тип сканирования" в качестве "MRM (MRM)» и «Полярность» как «Позитивный».
    23. Перейти к "Период" Резюме и введите продолжительность времени (устанавливается как общее время для анализа LC и уравновешивания). В таблице правой кнопкой мыши и выберите "декластеризация потенциал (DP) 'и' энергии столкновения (CP) ', чтобы добавить эти столбцы в таблице.
      Примечание: В столбце "Время" в настоящее время относится к ожидаемому времени удерживания (мин) для каждого перехода.
    24. В разделе "изменения параметров" программного обеспечения для сбора данных / MS LC, установите флажок "Назначенные MRM" окно. Введите Q1, Q3, Время (мин), ID, DP и CE значения для переходов, созданных в электронной таблице (1.5.21) и сохраните метод приобретения (филе расширение .dam).
      Примечание: Этот метод обычно снижает количество MRM переходов наиболее интенсивным 4 для каждого пептида и сканирует только через окно времени удерживания для каждого пептида пика, что дает повышенную чувствительность и качество данных. «Динамический» метод является методом 'руководствовались время удерживания оконная', который иногда называют планированием.

2. Получение и анализ образцов градуировочного

  1. Добыча мясных смесей
    1. Используя мясо ранее замороженным затем измельчают в порошок, готовят ассортимент мясных смесей путем взвешивания соответствующих количеств мяса (общей массой около 300 мг) в 15 мл пластиковые центрифужные пробирки.
    2. Добавляют 4 мл буфера для экстракции (0,15 М хлорида калия + 0,15 М фосфатном буфере при рН 6,5). Vortex в течение 30 сек. Выдержка на лабораторном шейкере при комнатной температуре в течение 2 ч при 250 циклов / мин.
      Примечание: Циклы / мин относится к колебательное движение.
    3. Передача 2 млэкстракта в пробирку микроцентрифужных 2 мл. Центрифуга в течение 5 мин при температуре 4 ° С при 17000 х г.
    4. Передача 200 мкл аликвоты супернатанта (резервируя небольшое количество для анализа белков, см 2.2) в 2 мл центрифужные пробирки и сухой с использованием центробежного испарителя (предварительно заданную программу: 50 ° C, без каких-либо вентилирования и 120 продолжительности мин).
  2. анализ белка
    1. Передача 7 мкл аликвоты надосадочной жидкости зарезервированной (см 2.1.4) в трех экземплярах, в лунки 96-луночного планшета.
    2. Передача 7 мкл аликвоты ряда белковых стандартов в трех экземплярах, диапазон 0 - 1,0 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), к тому же 96-луночного планшета.
    3. Добавить 200 мкл Кумасси плюс анализа белков реагента в каждую лунку.
    4. Визуально сравнить цвет образца скважин со стандартами белка, чтобы проверить образцы находятся в диапазоне калибровочных стандартов. При необходимости повторить с разбавленной пробы таким образом это становится в пределах досягаемости.
    5. Оставьте пластину на ули в течение 3 мин.
    6. Взрыв все пузырьки, которые сформировались с иглой для подкожных инъекций.
    7. Анализируют пластину на планшет-ридере использованием стандартного протокола конечной точки при длине волны 595 нм.
    8. Определить концентрацию белка в образцах с использованием калибровочных данных из белковых стандартов.
      Примечание: Это необходимо для расчета количества трипсина, используемого в трипсинизированном дайджеста.
  3. Протеолиз мясных смесей
    1. Растворяться высушенный остаток, полученного на стадии 2.1.4 в 1 мл 25 мМ раствора бикарбоната аммония. Хорошо перемешайте на rotamixer.
    2. Следуйте протоколу, начиная с шага 1.1.3 до 1.3.7.
  4. Анализ с помощью ЖХ / МС
    1. Настройка LC / MS, как ранее (этап 1.5.1).
    2. Создать новую партию приобретения, как это описано ранее (шаги 1.5.9 - 1.5.14), при выборе метода приобретения, созданного на этапе в 1.5.24, который использует / MS метод динамического LC сочетающую всех видов мяса, а также приобретать данные для в DigesTed образцы мяса.
    3. Покажите полный хроматограмму в программном обеспечении просмотра данных. Отображение Xic для каждого перехода, установленного в свою очередь. Визуально подтвердить каждый кластер содержит необходимое количество колпаковых пиков в ожидаемое время удерживания, тем самым подтверждая существование выбранного пептида.
    4. Выполнение количественного, используя данные программы просмотра для интеграции площадей пиков для каждого из переходов, представляющих интерес с помощью двойного щелчка на 'Build Количественное определение Метод' в панели навигации.
    5. В 'Select Sample' панели выберите "Файл данных" и "образец", чтобы быть проанализированы, чтобы сформировать таблицу 'аналитов.
    6. Нажмите на вкладку "интеграция", чтобы отобразить первый из переходов (аналитов) должны быть интегрированы.
    7. Нажмите на поле "аналит", чтобы отобразить выпадающий список переходов. Выберите каждый переход в свою очередь, чтобы отобразить его и визуально подтвердить правильный пик выбран для интеграции. Для мodify или форсировать интеграцию, щелкните левой кнопкой мыши и перетащите курсор над целевой пик (это будет выделен зеленым цветом). Нажмите на кнопку "Select Peak" и нажмите кнопку "Применить".
    8. Сохранение рабочего пространства в качестве метода файла (.qmf).
      Примечание: Это создает файл Количественный метод для последующего расчета площадей пиков образцов.
    9. Двойной щелчок 'Количественное Wizard' в панели навигации. В окне "выбрать образцы" создать "Количественное определение Set", выбрав одну "файл данных", а затем один или более "Доступные Образцы". Выберите 'Next' для отображения "выберите Настройки и Query" окно. Оставьте со значениями по умолчанию, выберите "Далее" для отображения "Select Method". Из выпадающего списка '' метод выбора файла в «интеграции» метод, созданный на шаге 2.4.8, а затем выберите "Готово".
      Примечание: Это создает 'Таблица результатов, в том числе площади пиков переходных вытекающих из мясных смесей.
    10. Сохранить "Таблица результатов" (расширение файла .rdb), экспорт в виде текстового файла (.txt) и открыть его в таблицу, чтобы просмотреть данные.
    11. Построить графики процентной доли (переходными площади пика) одного мяса в другой по отношению к измеренному процентах (вес / вес) от двух мяса для выбранного MRM для выбранных переходов из соответствующих пептидов, сосредоточив внимание на тех случаях, когда два фрагмента содержат такое же количество аминокислот, считая от с-терминального конца.
      Примечание: Идентичные фрагменты с одинаковыми сайтов фрагментации дают оптимальные результаты.
    12. Изучите сюжеты из 2.4.11 выше. Либо визуально, либо с помощью инструмента линии тренда в пакете черчения, определить группу участков, которые являются как линейные, так и аналогичного градиента. Используйте одну или несколько из этих СРСР плюс фрагментов комбинаций для калибровки в реальных образцах мяса.
      Примечание: график, показывающий необычный градиент может указывать либо пептид или подавление фрагмента с последующим уменьшением сигнала Strength. Нелинейные участки могут свидетельствовать о плохом обнаружения пика или другие проблемы.

3. Мясо Образцы

  1. Выделение белков из образцов целевого мяса
    1. Там, где это применимо, акцизный посторонний немясных материал из образца с помощью шпателя. Например, соскрести соус и пасту из охлажденной лазаньи.
    2. Взвешивают 20 г мяса в металлический стакан.
    3. Добавляют 100 мл 0,15 М хлорида калия / 0,15 М монофосфат буфера калия при рН 6,5.
    4. Извлечение белков путем смешивания мяса в высокоскоростном гомогенизаторе в течение 1 мин.
    5. Следуйте протоколу, начиная с шага 2.1.4 - 2.3.2.
  2. Анализ образцов с помощью ЖХ / МС
    1. Повторите шаг 2.4.2 для получения данных с использованием динамического метода LC / MS.
    2. Определить пептиды из каждого мяса миоглобина, как выполняется на этапе 2.4.3.
    3. Для количественному, используйте программное обеспечение для интеграции количественный площадей пиков для каждого перехода интересов,как показано на этапе 2.4.9.
    4. Для идентификации видов в смеси, запись этих маркеров пептиды, удовлетворяющие согласованным критериям для чисел переходов и сигнала к шуму для этих переходов.
    5. Для количественной оценки, использование комплексных переходных пиков, согласованных с шага 2.4.12 и, используя процент по площади пика перехода, вычислить процент миоглобина из двух видов в смеси.
    6. Использование предварительного знания из литературы 18 возможных уровней миоглобина в мясе для оценки относительных вес / вес количество двух мяса , присутствующих в образце.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В одном динамическом режиме MRM эксперимента каждый запрограммированный переход записывается отдельно (как отсчетов детектора в секунду, сП) в течение определенного интервала времени удержания. Таким образом, из всех данных, собранных в одном эксперименте, пик интенсивности для каждого перехода, можно вынимать. Тогда только конечный сигнал для окна времени удерживания, установленного для этого перехода. За пределами окна, сигнал равен нулю по определению. Сигнал для любого одного перехода, например, 752 → 1269 от лошади (пептид одноизотопные масс 1,501.66 дальтон, ион - предшественник m / z 751.84 дальтон, зарядовое состояние = 2, ионный фрагмент у 13) , как правило , должен конкурировать только с шумом измерения и не от других пиков переходных, которые могли бы, возможно, быть от других видов. Таким образом, выход представляет собой набор чистых пиков, по одному на переходном этапе, в общем времени удерживания для тех переходов, разделяющих общий ион-предшественник.

рисунке 1 показан вывод для набора из четырех переходов 752 → (1269, 706, 248, 1366) для смеси 1% вес / вес лошадь в говядине. Поскольку четыре перехода, отображаемые связаны с лошади, и отсутствуют в образцах чистого говядины, баранины или свинины, эти пики означают наличие лошади. В зависимости от критериев надежности, набор из двух или более переходов каждый превышающий некоторый заданный уровень сигнал-шум устанавливает идентификацию. Таким образом, этот показатель устанавливает наличие лошади в смеси 1% вес / вес лошади в говядине.

Иногда обнаруживается один изолированный переход. Это указывает на случайное совпадение иона-предшественника и один фрагмент, возможно, от постороннего белка, с теми, которые ожидаются от системы и программируются в масс-спектрометр. Особая природа пика, и его появление в неожиданное время удержания, является сиgnature случайного перехода, который может быть проигнорировано.

Площадь под каждым пиком перехода можно рассчитать по отдельности. На основе подходящего фрагмента, отношение лошади к площадям пиков переходных говядины, например, 752 → 1269 (лошади) до 767 → 1299 (говядина), будет пропорционально отношению фактического мяса в смеси. На рисунке 2 показана участок процент по площади пика для этих двух переходов к проценту веса для веса лошади в смеси с лошади говядины. Если площади пиков в процентах переходов соответствует процент веса для веса мяса, то наклон равен 1. Наклон в этом участке составляет 1,03, что свидетельствует о том, что для этих переходов и СРСР пары, переход площади пиков дают надежное измерение относительных количеств из двух мяса в смеси. Если мясо лошади в образце был вдвое богат миоглобина, как говядина, то, с другими факторами неизменными, наклон линия будет больше единицы.

figure-results-1
Рисунок 1. интенсивности переходов MRM в зависимости от времени удерживания на 1% вес / вес лошади в говядине. Переходы 752 → (1269, 706, 248, 1366), показано в оранжевый, черный, синий и зеленый, соответственно. Маркер пептид HPGDFGADAQGAMTK. Четыре фрагмента перехода можно обозначать Y 13, Y 7, Y 2 и Y 14 соответственно, где у п обозначает подсчета в п аминокислот от пептида C-терминального конца. Сигнал шума варьируется от 23 до 53 в течение четырех переходов. Дополнительная красная линия обозначает переход на 752 → 1269 для 0% лошади, 100% говядины для сравнения. Отображается только ненулевая область времени удерживания. Эта цифра была изменена с Уотсоном и др. 3.эс / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Участок лошади в говядине, как процент веса для веса, по сравнению с лошади в говядине как процент перехода площади пика. Участок использует пару пептидов говядины (767) и лошади (752) и фрагмент иона у 13 для обоих. Если А обозначает площадь пика , то по оси ординат 100 А Н / (А + Н А Б). Наклон лучшей подгонки линии (R 2 = 0,99) составляет 1,03. Эта цифра была изменена с Уотсоном и др. 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбор подходящего целевого белка имеет важное значение. Хороший целевой белок должен иметь соответствующие формы в видов, представляющих интерес, достаточный зависит от вида вариации последовательности, видовой специфичности, и существуют в доступных количествах в организмах. Для оценки смесей, которые подверглись обработке (например, термообработка), белок, имеющий последовательность, относительно невосприимчивы к этой обработки желательно. Миоглобин является хорошим кандидатом для красного мяса, в том числе приготовленные из красного мяса, но это не единственная возможность. После того, как белок-мишень принимается решение, наиболее важной частью протокола является белок протеолиз. Белок отличается от миоглобина также может потребовать альтернативный протокол протеолиза.

Протокол, как описано включает в себя сегмент на основе эталонного очищенного белка. Это имеет целью открыть окна времени удерживания и подходящие ионы-предшественники и фрагментов. Этот сегмент является очень полезным, но не обязательно.

Несмотря на то, соответствующие пептидные пары из двух видов, представляющих интерес могут быть перечислены даже без опыта, иногда бывает, что разница последовательность имеет драматические последствия на профиле пищеварения. Например, пептид пара VLGFHG (говядина) и ELGFQG (лошадь) дают аномальный результат количественный (проявляется в виде градиента меньше , чем один на рисунке 2). Это происходит потому, что последний пептид возникает из относительно подавленной расщепления К.Э., что приводит к недооценке уровня лошади в смеси. Соответствующие пептиды, которые начинаются с разных аминокислот, поэтому лучше избегать. Часто фрагменты из двух соответствующих пептидов имеют идентичные аминокислотные последовательности, и хорошо себя, но это не всегда так, и должно быть проверено в процессе разработки метода. идентификация видов гораздо менее чувствительны к этим вопросам, чем относительное количественному.

Протокол был продемонстрирован на четыре красного мясаs 3. Дополнительные виды мяса могут быть включены, хотя качество пик формы перехода может ухудшиться, если слишком много маркерные пептиды коэлировать, эффективно уменьшая время задержки и, в конечном счете деградирует относительных оценок Количественное определение. Улучшение измерительных приборов, уже доступны, улучшит это. Связанный с этим вопрос заключается в том, что не все виды мяса имеют разные myoglobins. Например, лошади, ослы и зебры myoglobins идентичны и, таким образом, строго говоря, метод способен только обнаруживать лошадь или осла или зебру в говядине. В некоторых случаях, даже если myoglobins не идентичны, некоторые ключевые пептиды могут быть. Например, некоторые бараньи миоглобина происхождения маркерные пептиды также появляются в козу.

Усложнение перед этим и любой другой на основе белка Количественный способ является то, что уровень содержания белка должен считать постоянным во всех видов, если уровни белка или пептида являются приравнять тривиальным к уровням мяса в смеси. Для миоглобина и четыре красных мест это не всегда верно. Уровни в целом виды, зависящие, со свининой, проявляющие низкий уровень четырех. Кроме того, уровень миоглобина изменяется в зависимости от мяса вырезать и возраста животных. Таким образом, хотя отношения площадей пиков переходных достоверно сопоставить соотношения миоглобина, отображение соотношение фактического мяса является оценкой рисунок на предположениях относительно вероятных источников на мясо в смеси.

Подход, изложенный в данной работе отличается несколькими способами от других опубликованных вкладов. Более типичный путь заключается в использовании протеомические методы для идентификации различных несопоставимых зависит от вида маркерные пептиды, причем в этом случае маркеры для различных видов не обладают особого отношения друг с другом 8-12,14,19. В отличие от этого , мы отобрали белки , общие для всех видов , представляющих интерес до видов-зависимых вариантов последовательностей 3. Помимо того, что центральное место в нашей относительной стратегии количественного, это имеет то преимущество, что образецСтратегии препарат может быть оптимизировано. Кроме того, такие соответствующие белки можно было бы ожидать, ведут себя подобно, например, при добыче или в коммерческой обработке образцов, таких как приготовление пищи или консервирования. идентификация видов, то обычно протекает через обнаружение несопоставимых пептидов маркерные, в то время как в СРСР подход определения видов протекает через обнаружение близко родственных пептидов, обладающих, как правило, один или два различия последовательности. И, наконец, определение количества белков , чтобы оценить процент по массе одного вида в другой может условно протекать по абсолютному количественному каждого белка в отдельности , на основе известных стандартов 7,14,15. Однако с помощью метода СРСР нет никакой необходимости в методах калибровки. Вместо того, чтобы относительные уровни оцениваются путем сравнения уровней сигналов двух соответствующих пептидов из двух видов, минуя стадию абсолютного измерения в целом. Поскольку конечной целью является процент по весу одного вида в ANOTher, родственник Количественное, то СРСР является одновременно более прямым и проще, чем сравнения двух абсолютных измерений Количественное определение. Эти функции перевода в короткие экспериментальные времена, как ожидается, будет примерно в два ч с использованием уточненных протоколов, что делает этот метод полезен в качестве быстрого средства наблюдения в области выявления случаев мошенничества пищи.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем признательность за финансовую поддержку от фондов BBSRC Core Strategic Grant Института пищевых исследований, BBSRC Project BB/J004545/1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
База данных Uniprotwww.uniprot.orgСвободно доступная база данных белковых последовательностей
Skyline softwarewww.skyline.gs.washington.eduБесплатное программное обеспечение для скачивания, позволяющее создавать целевые методы для протеомных исследований, пептидов и фрагментов Прогноз 
Бикарбонат аммонияSigma-Aldrich Co Ltd, Джиллингем, Великобритания www.sigmaaldrich.comO9830
Метанол, ВЭЖХ маркиFisher Scientific, Лоухоборо, Великобритания www. fisher.co.uk 10674922
Ацетонитрил, ВЭЖХ маркиFisher Scientific, Лоухоборо, Великобритания www. fisher.co.uk 10010010
мочевиныSigma-Aldrich Co Ltd, Джиллингем, Великобритания www.sigmaaldrich.comU5378
Трипсин (из поджелудочной железы крупного рогатого скота, обработанной TPCK)Sigma-Aldrich Co Ltd, Джиллингем, Великобритания www.sigmaaldrich.comT1426
Муравьиная кислота Sigma-Aldrich Co Ltd, Джиллингем, Великобритания www.sigmaaldrich.comF0507
Реактив для анализа белка Coomassie PlusThermo Fisher Scientific www.thermofisher.com1856210
Стандарт белкаSigma-Aldrich Co Ltd, Джиллингем, Великобритания www.sigmaaldrich.comP0914
Ультра гомогенизатор Turrax T25Fisher Scientific, Лоугоборо, Великобритания www. fisher.co.uk13190693
Эдмунд и Бюлер KS10 лабораторный шейкер
Heraeus Fresco 17 ЦентрифугаThermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com75002420
Вакуумная центрифуга RC 1022Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u полимерные картриджи с обратной фазой 60 мг/3 мл пробиркиPhenomenex, Macclesfield, Великобритания8B-S100-UBJ
4000 QTrap тройной квадрупольный масс-спектрометрAB Sciex, Уоррингтон, Великобритания www.sciex.com
1200 система LC быстрого разрешенияAgilent, Стокпорт, Великобритания
XB C18 обратимо-фазовая капиллярная колонка (100 мм x 2,1 мм, 2,6 &; m размер частиц)Phenomenex, Macclesfield, Великобритания www.phenomenex.com
Аналитик 1.6.2 программное обеспечениеAB Sciex, Уоррингтон, Великобритания www.sciex.comСбор и анализ данных QTrap, включая флаконы с автоподатчиком
с интегрированием в пиковую площадь

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
  2. Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
  3. Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
  4. Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
  5. Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
  6. Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
  7. Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
  8. Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
  9. Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
  10. von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
  11. von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
  12. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
  13. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
  14. Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
  15. Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
  16. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  17. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
  18. Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
  19. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи