Методическая статья

Работа с Слуховой HEI-OC1 клеток

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) является одной из немногих линий слуховых клеток мышей, доступных в настоящее время для исследовательских целей. В этом протоколе описывается, как работать с клетками HEI-OC1 для исследования цитотоксических эффектов фармакологических препаратов, а также функциональных свойств белков внутреннего уха.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1 — одна из немногих линий слуховых клеток мыши, доступных для исследовательских целей. Первоначально предложенные в качестве системы in vitro для скрининга ототоксичных препаратов, эти клетки использовались для исследования активированных лекарственными препаратами апоптотических путей, аутофагии, старения, механизма защиты клеток, воспалительных реакций, дифференцировки клеток, генетических и эпигенетических эффектов фармакологических препаратов, эффектов гипоксии, окислительного и эндоплазматического стресса ретикулума, а также экспрессии молекулярных каналов и рецепторов. Среди других важных маркеров волосковых клеток улитки, клетки HEI-OC1 эндогенно экспрессируют престин, парадигматический моторный белок наружных волосковых клеток. Таким образом, они могут быть очень полезны для выяснения новых функциональных аспектов этого важного слухового белка. Клетки HEI-OC1 очень устойчивы, и их культивирование обычно не представляет больших осложнений. Тем не менее, они требуют некоторых особых условий, таких как отказ от использования обычных антибактериальных коктейлей, содержащих стрептомицин или другие антибиотики, а также инкубация при 33 °C для стимуляции пролиферации клеток и инкубация при 39 °C для запуска дифференцировки клеток. В этой статье мы опишем, как культивировать клетки HEI-OC1 и как использовать их в некоторых типичных анализах, таких как пролиферация клеток, жизнеспособность, гибель, аутофагия и старение, а также как выполнять измерения патч-хомута и нелинейные измерения емкости.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дом Ухо институт-кортиева органа 1 (HEI-OC1) клетки получают из слухового органа трансгенной мыши 1,2. Инкубационный любой клетки от этой трансгенной мыши при 33 ° C / 10% CO 2 (разрешающих условиях) индуцирует экспрессию гена увековечивающему, запускающего де-дифференциацию и пролиферацию ускоренную; перемещение клеток до 39 ° C / 5% CO 2 (не разрешающие условия) приводят к снижению пролиферации, дифференцировки и, по крайней мере , в случае Hei-OC1, гибели клеток 2,3.

Вуз-OC1 клетки были клонированы и охарактеризованы в нашей лаборатории более десяти лет назад, и первоначальные исследования показали, что они выражают специфические маркеры волосковых клеток улитки, такие как Prestin, миозина 7а, Atoh1, BDNF, кальбиндин и кальмодулин, но и маркеры поддержки клетки , такие как коннексина 26 и рецептора фактора роста фибробластов (FGF-R) 2. Поэтому было высказано предположение о том, что HEI-OC1 может представлять собой Коммоп прародителем для сенсорных и опорных клеток органа Корти 2. Параллельные исследования убедительно показали , что архетипическом ототоксичен препараты , как цисплатин, гентамицин и стрептомицин индуцированной активации каспазы-3 в этих клетках, в то время как препараты считаются не ототоксичен, как пенициллин, не сделал 2,3. Таким образом, эта клеточная линия была предложена в качестве системы в пробирке для исследования клеточных и молекулярных механизмов , участвующих в ототоксичность и для скрининга потенциальных ототоксичность или otoprotective свойств новых фармакологических препаратов. Предполагается, что HEI-OC1 клетки были использованы в более чем ста пятидесяти исследований, опубликованных за последние десять лет.

Принимая во внимание , глядя на потенциального проапоптотического влияния различных препаратов была основной целью большинства исследований , связанных с этой клеточной линии, другие важные клеточные процессы , такие как аутофагии и старении только начали исследовать в клетках HEI-OC1 4-7. яна недавнем исследовании нашей лаборатории 8, мы использовали клетки HEI-OC1 собрать полный набор данных о гибели клеток, выживание, пролиферацию, старении и аутофагии , вызванных различными фармакологическими препаратами , часто используемых в клинике. Мы также сравнили некоторые из ответов HEI-OC1 клеток с теми из НЕК-293 (эмбриональные клетки почки человека) и HeLa (эпителиальные клетки человека), получающих идентичную обработку. Наши результаты показали, что Hei-OC1 клетки реагируют на каждого лекарственного средства характерным образом, с характерным дозы и времени зависит чувствительность, по крайней мере, один из механизмов, на стадии изучения. Мы также подчеркнули , в этом исследовании , что правильная интерпретация экспериментальных результатов потребует проведения параллельных исследований с более чем одной техники 8.

В другом исследовании мы изучали использование клеток HEI-OC1 оценить функциональную характеристику Prestin, двигатель белок кохлеарных наружных волосковых клеток (OHCs) 9 . Мы сообщили проточной цитометрии и конфокальной микроскопии исследования лазерного сканирования по образцу Prestin выражения, а также нелинейной емкости (НЖК) и целые исследования прижимных клеток патч в Вуз-OC1 клеток, культивируемых в разрешительный (P-Hei-OC1) и не- разрешающие (NP-вуз-OC1) условиях. Наши результаты показали, что как общее выражение Prestin и плазмалеммы увеличение локализации в зависимости от времени в клетках NP-Вуз-OC1. Интересно отметить , что мы также обнаружили , что увеличение Prestin локализации в плазматической мембране клеток NP-Hei-OC1 коррелировало с уменьшением Na + K + АТФазы, которая транслокации из плазматической мембраны в цитоплазму без существенных изменений в общей экспрессии в клетках. Кроме того, мы показали, что Р-Вуз-OC1 клетки имеют надежный НЖК, связанный с Prestin двигательной функции, которая уменьшается, когда плотность молекул Prestin, присутствующих на мембране увеличена. В целом, эти результаты убедительно подтверждают полезность Hei-OC1 клетки для исследования слуховых белков.

В этом видео статье мы опишем, как культура клеток HEI-OC1, почему удобно использовать клетки растут в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) для исследований цитотоксичности, как оценить механизм / с лекарственно-индуцированной цитотоксичности и как для выполнения электрофизиологических исследований (например, патч-зажим, нелинейную емкость (НЖК)) для исследования функциональных свойств Prestin, молекулярного двигателя кохлеарного OHCs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток

Примечание: Все протоколы культивирования клеток должны быть выполнены с использованием надлежащих методов культивирования клеток (для справки см первые 3 главы клеточной биологии: A Laboratory Handbook, том I 10). Вуз-OC1 клетки не требуют какого-либо дополнительного покрытия или обработка посуды клеточных культур для надлежащего соблюдения и роста. Очень важно: не используйте стеклянную посуду посуду для целей культивирования клеток; фенотип и биологическая реакция клеток на фармакологических препаратов изменится (G & F Kalinec Kalinec, неопубликованный); Рекомендуется использовать традиционные блюда из пластика для культивирования клеток (см Таблицу материалов / оборудования). Обратите особое внимание на асептики , чтобы избежать загрязнения, но никогда не используют антибиотики (например, ампициллин или стрептомицин) с клетками HEI-OC1. При необходимости использовать амфотерицина В. В то время как HeLa и НЕК-293 клеток, были использованы в качестве контроля в предыдущих исследованиях с Hei-OC1 8, любая другая линия клеток можетбыть приемлемыми для этой цели.

  1. Реанимация Замороженный HEI-OC1 клеток
    Примечание: Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями из той же трансгенной мыши , разработанной в нашей лаборатории, такие как OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалить флакон криоконсервированных клеток Hei-OC1 из жидкого N 2, и поместить его на водяной бане при 37 ° С. Погрузите только нижнюю половину флакона, и дайте ему оттаять, пока лишь небольшое количество льда остается во флаконе. Протрите наружную поверхность флакона с 70% -ным спиртом.
    2. Пипетировать клетки из флакона и доставить весь объем (~ 1,5 × 10 5 клеток / мл) медленно, по капле, в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл подогретого среды для роста, как модифицированной среде Игла Дульбекко ( DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    3. Удалить ДМСО при центрифугировании трубки при температуре 300-500 мкг в течение 5 мин, отбрасывая тон супернатант и ресуспендирования клеток в 9 мл свежей среды для роста (DMEM + 10% FBS). Дезагрегации комки или листы клеток флюса и флегмы взвешенных клеток, из пипетки в среде, и наоборот, в три-четыре раза с кончиком пипетки касаясь дна трубки.
    4. Поместите общий объем клеток, суспендированных в среде роста в мм диаметра 100 необработанных, пластиковые чашки для культивирования клеток.
    5. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (разрешающих условиях).
  2. Субкультура HEI-OC1 клеток
    Примечание: До слияния (~ 80%), клетки должны быть приведены в подвеске и субкультивироваться для того, чтобы предотвратить культуру смерти. Этот протокол также может быть использован с другими клеточными линиями , разработанных в нашей лаборатории из той же трансгенной мыши, например, OC-K3, из органа Корти 11,12 и SV-k1, с полоской vascularis 13,14.
    1. Удалите старую среду и промыть клетки с 2 мл PBS.
    2. Накройте клеточный монослой с раствором 0,25% трипсина, с использованием 1 мл на 25 см 2 поверхности. Для того, чтобы перейти к следующему шагу более чем 40% клеток должна быть отсоединена. Исследуют клетки с использованием инвертированного микроскопа, и, при необходимости, "шлепать или нажмите" культуральных чашек осторожно, чтобы освободить все оставшиеся прикрепленные клетки.
      Примечание: Будьте осторожны, как трипсином в течение длительного времени может привести к гибели клеток; не достаточно, а переданные клетки будут недостаточными для планируемых исследований.
    3. Ресуспендируют клеток, следуя процедуре, описанной в разделе 1.1.3, и передавать их в коническую пробирку на 15 мл.
    4. Центрифуга в течение 5 мин при 300-500 XG, выбросьте среду, собирают клетки со свежей средой роста и семя их в, по меньшей мере, четыре 100 мм диаметра блюда клеточной культуры. Число клеток на чашку, будет зависеть от количества клеток, выделенных. Инкубируйте клетки при 33 ° C с 10% CO 2 (С-Hei-OC1) и разделить снова столько раз , сколько необходимо длязапланированные эксперименты или для создания нового запаса.
    5. Для подготовки запасов, заменить блюда мм диаметром 100 от 250-550 мл колбах для культивирования клеток; для экспериментов, небольшие блюда или мульти-луночные планшеты могут быть более адекватными.
    6. Для дифференцировки, клетки инкубировать HEI-OC1 в разрешающих условиях, пока они не достигают ~ 80% слияния; затем переместите посуду до 39 ° C с 5% CO 2 (NP-Вуз-OC1) в течение 2 -х до 3 -х недель.
      Примечание: Клетки будут постепенно остановить пролиферирующих и умирает. Изменение среды через день, чтобы удалить мертвые клетки. В зависимости от исходного количества клеток, как правило, после ~ 4 недели не больше ячеек не будут доступны для экспериментов. Дифференциация начинается, как только клетки помещают в условиях NP, но не каждая клетка дифференцируются в том же темпе. Важно отметить, что Prestin экспрессии и локализации мембраны возрастает в процессе дифференцировки (см Представитель Результаты, рисунок 4), обеспечивая качественноеи количественный показатель уровня дифференциации.

2. Drug Исследования цитотоксичности

Примечание: Вуз-OC1 клетки , выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований (см Представитель Результаты, Рисунок 1).

  1. Жизнеспособность клеток (МТТ)
    1. Собирают клетки Р-Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После того, как медикаментозное лечение (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполняют МТТ анализ в соответствии с протоколом производителя. В целом, Протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Добавьте 10 мкл реагента МТТ в каждую лунку.
      2. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение от 2 до 4 ч до тех пор, фиолетовый краситель не виден, а затем добавить 100 мкл МТТ Моющая реактива в каждую лунку. Не встряхивайте пластину.
      3. Закройте планшет и оставить его в темноте в течение 2 до 4 ч при температуре 37 ° С.
      4. Используйте устройство для чтения микропланшетов пластины для измерения оптической плотности при длине волны 570 нм в каждую лунку, включая пробелы (рост среднего в одиночку). Нормализация данных с использованием среднего OD в контрольных клетках, как 100% от жизнеспособности.
  2. Каспазы 3/7 Активация Анализ
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клеток на КНИТО-стеной 96-луночные планшеты (100 мкл на лунку), инкубировать в течение ночи для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. После медикаментозного лечения (как правило, 24 или 48 ч при температуре 33 ° С), выполнить анализ каспазы следующий протокол соответствующего производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, хорошо перемешать, и дать им возможность уравновешивания до комнатной температуры.
      2. Удалить клетки из инкубатора и позволяют пластины уравновешиваться до комнатной температуры.
      3. Добавьте указанное количество реагента в каждую лунку, соблюдая осторожность, чтобы избежать перекрестного загрязнения, не касаясь лунки, содержащие различные образцы с одинаковыми наконечниками пипеток.
      4. Закройте планшет и перемешивают в течение 30 секунд с помощью шейкере при температуре 300-500 оборотов в минуту.
      5. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение периода, по крайней мере, 30 мин. Determinе оптимальный период инкубации эмпирически. Если температура в помещении колеблется использовать постоянной температуры инкубатора, так как колебания температуры будут влиять на чтение люминесценции.
      6. Измеряют люминесценцию в каждую лунку, и нормализовать значения с использованием среднего люминесценцию в контрольных клетках, как 100% от активации каспазы.
  3. Деление клеток (пролиферации)
    1. Собирают клетки Hei-OC1, следуя процедуре, описанной в разделе 1.2, и сосчитать их либо с автоматическим счетчиком клеток или гемоцитометра. Регулировка концентрации до 2,0 х 10 5 клеток / мл.
    2. Семенной клетки на 96-луночный прозрачных плоскодонных планшетах (100 мкл на лунку), инкубируют в течение ночи при разрешающих условиях для прикрепления к субстрату, а затем обработать их с препаратами, представляющим интерес. Не забывайте включать пробелы и необработанными клетками (контроль)!
    3. Через час после обработки, добавляют в каждую лунку по 1 мкл приготовленной 100x BrdU (5-Бром-2'-deoxyuriобед) решение, и вернуть пластины в инкубатор при 33 ° С.
    4. После того, как 12, 24 и 48 ч, удалить существующую среду из соответствующих пластин и промыть каждую лунку один раз PBS.
    5. Провести анализ пролиферации клеток в соответствии с протоколом производителя. В целом, протоколы для данного анализа имеют следующие шаги:
      1. Подготовка реагентов, в том числе фиксации / денатурирующих раствор, моющий буфер, раствор первичного обнаружения антител, вторичное решение для обнаружения антител и BrdU раствора, как указано в протоколе изготовителя.
      2. Добавьте решение фиксирующее / денатурации в каждую лунку в количествах, указанных в протоколе изготовителя, и держать планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.
      3. Удалите / денатурирующих фиксирующим раствором и добавляют первичное антитело в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Хранить планшет при комнатной температуре в течение 1 часа.
      4. Удалите раствор с первичным муравейibody, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, а затем добавить вторичные антитела в концентрации, указанной в протоколе изготовителя. Держите пластину с вторичным антителом, при комнатной температуре в течение 30 мин.
      5. Удалите раствор с вторичным антителом, мыть пластины 3 раза промывочным буфером, и добавьте субстрат. Через 10 мин инкубации при комнатной температуре, добавляют раствор STOP. Будьте осторожны: контролировать изменение в цвете; если решение становится очень темно, остановить реакцию до начала стандартного времени разработки 10 мин.
      6. Измерить оптическую плотность при 450 нм в течение 30 мин после добавления стоп-раствора.
  4. Цитотоксичность
    Примечание: Вуз-OC1 клетки, выращенные в разрешающих условиях (P-Вуз-OC1) рекомендуются для этих исследований.
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. В конце лечения, Промыть клетки три раза PBS, и отделяться с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора для диссоциации клеток в течение 3 мин.
    3. После стягивания, сбора и осаждения клеток центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и окрашивать клетки в течение 15 мин в темноте с реагентом, включенного в цитотоксичности.
    4. Определить количество живых клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточного цитометра.
  5. физиологическое старение
    1. Инкубируют при разрешающих услови х, как правило, в течение 24-48 ч, клетки Hei-OC1 только в клеточной культуральной среде (контроль) или среда плюс интересующих лекарственных средств.
    2. Определить количество Старение-ассоциированные бета-галактозидазы - положительных клеток с помощью проточной цитометрии с протоколом , описанным Debacq-Chainiaux и др. 15 или другим способом , известным , чтобы обеспечить надежные результаты. Краткий протокол для проточной цитометрии является следующее:
      1. В конце эксперимента обработок, промыть клетки три раза PBS, а затем инкубировать их с 100 нМ Bafilomycin A1 в культуральной среде клеток в течение 1 ч при разрешающих условиях.
      2. Добавить C12FDG в конечной концентрации ~ 33 мкМ, и продолжают инкубацию клеток в течение 1-2 ч.
      3. Вымойте клетки дважды с PBS, собирают их с использованием 1 мл на 25 см 2 площади поверхности неферментативного раствора диссоциации клеток в течение 3 мин, и гранул их центрифугированием при 3000 х г в течение 5 мин.
      4. Ресуспендируют клеток в охлажденном льдом PBS и определяют количество положительных клеток Hei-OC1 с помощью проточной цитометрии, как указано изготовителем проточном цитометре.
  6. аутофагия
    1. Собирают Hei-OC1 контрольные клетки и голодали (лишенные сыворотки в течение 48 ч) с помощью следующей процедуры, описанной в разделе 1.2, и обрабатывать их для Вестерн-блоттинга в соответствии со стандартными протоколами. В целом, протоколы для вестерн-блоттинга имеют следующую стEPS:
      1. Семенной Hei-OC1 клеток в 6-луночные планшеты при концентрации 1,0 х 10 5 клеток / мл. После того, как 24 и / или 48 ч, промыть клетки с охлажденным льдом PBS.
      2. Лизируйте с 200 мкл буфера TNESV (1% NP40, 50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na 3 VO 4) с ингибитором протеаз и 1 мМ PMSF в течение 5 мин на льду.
      3. Собирают клетки (путем соскоба в нижней части каждой лунки), трансфер в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 16800 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      4. Собирают супернатанты и количественного определения концентрации белка с помощью ВСА анализа.
      5. Добавить 5х буфера для загрузки и 1 мМ DTT, к каждому образцу и кипятят в течение 5 мин для денатурации белков.
      6. Запуск образцов с помощью SDS-PAGE на 4-12% геле и переносят на мембраны ПВДФ.
      7. Блок мембраны с 5% обезжиренным сухим молоком в TBS-T с 0,1% твина 20 в течение 60 мин при комнатной температуре.
      8. Инкубацию мембраны в течение ночи при 4 ° С с первичным муравейibodies.
      9. На следующий день, промывка мембран экстенсивно с TBS-T, и инкубировать с вторичным антителом IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1: 1500) в течение 1 часа.
      10. Обнаружение иммунореактивности с системой обнаружения усиливается хемилюминесценции (ECL). Нормализация уровней экспрессии белка с использованием GAPDH (1: 2000 в TBS-T с в 10% обезжиренного сухого молока) в качестве стандарта.
    2. В Вестерн-блоттинга исследовать экспрессию, по крайней мере, два различных маркеров аутофагией, такие как Beclin-1 и LC3B (как правило, в соотношении 1: 1000 разбавления в TBS-T, с 2,5% БСА). Не забудьте взглянуть на контроль экспрессии белка, такие как GAPDH или актина.
    3. Оценка экспрессии интересующего белка с помощью денситометрии с помощью цифрового сканера блот или компьютерного программного обеспечения, таких как публичного домена NIH Image или ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Электрофизиологические Эксперименты с вузом-OC1 клеток

  1. Сбор клеток
    Примечание: Используйте клетки растут в чашки для культивирования диаметром 100 мм на 50% -80% сплошности. Трипсин, Accutase, фермент-бесплатное решение, или р hosphate- б uffered сек Алины + е thylene d iamine т ETRA в cetic кислоту (PBS-EDTA) могут быть использованы для подъема клеток без значительного воздействия на количество и качество gigaseals , В некоторых случаях, однако, обработка трипсином делает клетки более хрупкими. В этих случаях, позволяют клеткам восстановиться в течение примерно 30 минут, перед началом экспериментов.
    1. Вымойте клетки дважды с 10 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
    2. Добавляют 2 мл фермента раствора без съемника, например неферментативного раствора клеточной диссоциации, и инкубировать блюда в течение 3 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
    3. С помощью инвертированного микроскопа, чтобы проверить отряд клеток. При необходимости, переместите CELл культуры блюдо, чтобы отделить больше клеток, но сделать это мягко.
      Примечание: Не трясите блюдо.
    4. Добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS и пипеткой клетки нежно вверх и вниз в пять раз с 10-мл пипетки.
    5. Посмотрите на клетки под микроскопом. Если> 80% клеток уже разделены (один), не далее пипеткой не требуется. Если клетки все еще находятся в кластерах, повторите осторожно пипеткой до более чем 80% клеток не одиноки.
    6. Поместите ~ 10 мл взвешенных клеток в коническую пробирку на 15 мл, центрифуга в течение 2 мин при 100 мкг, и отбросить супернатант.
    7. Используйте ~ 200 мкл внешнего раствора записи (Лейбовиц L-15 средней доводят до 305 - 310 мОсм с дистиллированной водой) для ресуспендирования клеток. Оптический контроль ячеек должны показать много одиночных, круглые клетки с гладкими краями мембраны.
  2. Патч-зажим и НЖК Измерения
    1. Выполните патч-зажим и измерения напряжения зависящих от нелинейной емкости (НЖК) с использованиемdequate усилители и программного обеспечения, а также стандартные электрофизиологические методы. Как использование внутреннего раствора (intrapipette) 150 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 0,1 мМ EGTA, 2 мМ АТФ-Mg, 0,1 мМ ГТФ-Na, и 10 мМ HEPES; доведения рН до 7,2 с помощью Триса.
    2. Под микроскопом, выбрать одну, здоровую клетку, с круглыми и гладкими краями мембраны. Прикрепите кончик стеклянной пипетки на клеточной поверхности и проверить сопротивление мембраны. Это должно быть около 3-6 МОм, что соответствует внутреннему диаметру (ID) наконечника пипетки из ~ 2 мкм.
    3. Слегка нажмите на кончик микропипетки против плазматической мембраны клетки, а затем применить всасывание. Часть клеточной мембраны будет отсасывается в пипетку, генерируя электрическое сопротивление в порядка 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Установить состояние целой клетки путем разрушения плазматической мембраны с всасывающим импульсами.
    5. Использование клеток , которые не экспрессируют Prestin, такие как НЕК-293, в качестве контроля 9,
      Примечание: Текущие ответы должны быть отфильтрованы на 5 кГц, а также исправления, сделанные для эффектов остаточного сопротивления серии. Все сбора данных и большинство анализов могут быть выполнены с использованием программного обеспечения, как правило, включены с замком усилителями. Функция емкостного сопротивления может быть установлен на первой производной двух государственной функции Больцмана , связанной нелинейной заряд мембраны напряжения 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нескольких недавних публикациях мы сообщали , полный набор исследований , направленных на оценку реакции клеток HEI-OC1 к нескольким наиболее часто используемых фармакологических препаратов, а также исследовать функцию Prestin 8,9. В этих исследованиях мы использовали всех протоколов, описанных в предыдущих разделах.

Одним из результатов этих предыдущих исследований было то , что Hei-OC1 клетки культивировали при ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом докладе мы опишем, как культура клеток HEI-OC1 и использовать их для оценки механизмов цитотоксичности медикаментозного и исследовать функциональные свойства Prestin, молекулярного двигателя кохлеарной OHCs. Технические процедуры, однако, являются достаточно общими, чтобы быть легко адаптирована к различным исследованиям.

Все протоколы , описанные здесь , требуют правильного использования хорошо зарекомендовавших себя методов клеточной культуры 10. Так же, как с любой друго...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии существующего или потенциального конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH R01-DC010146 и R01-DC010397. Его содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HEI-OC1ВСЕ НАБОРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА, ОБОРУДОВАНИЕ 
Класс II Шкаф биологической безопасностиThe Baker CompanySterilgard IIIИ КОМПАНИИ, УКАЗАННЫЕ В
ЦЕНТРИФУГЕEppendorf5810RПРЕДЫДУЩИЕ 2 КОЛОНКИ ТОЛЬКО
Инвертированный микроскопZeissAxiovert 25ПРИМЕРОВ, И ЛЮБОЙ ДРУГОЙ ПОДОБНЫЙ
Водяная баняStovallHWB115МОЖЕТ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ.
Счетчик ячеекNexcelomCellometer Auto T4
Два (2) Клеточные инкубаторы, один при 33 градусах; C/10% CO2 и другие при 39° C/5% CO2Forma Scientific3110
Чашки для клеточных культур, PS, 100 мм x 20 мм с вентиляционными отверстиямиGreinier Bio-One664-160
Чашки для клеточных культур, PS,  60 мм x 15 мм с вентиляционными отверстиями;Колбы для культуры тканей Greiner Bio-One628160
Cellstar  250 млGreiner Bio-One658-175
Cellstar для культуры тканей  колбы 550 млGreiner Bio-One660-175
  6 луночный планшет для культивирования клеток, с крышкой-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Tissue Culture plate, 96 лунка, плоское дно с крышкойBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-луночный белый, прозрачное дноGreiner Bio-One655098
50 мл полипропиленовая коническая трубка с колпачком CellstarsBecton Dickinson 352070
Полипропиленовые конические пробирки 15 мл с колпачком-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Фетальная бычья сыворотка (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, без фенола красныйGibco/Invitrogen21083-027
Трипсин, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS MTT Набор для анализа пролиферации клетокTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Анализ  наборPromega  G8091 
Набор для анализа пролиферации клеток BrdU Cell Signaling6813
Решение для неферментативной диссоциации клеток Sigma-AldrichC5789
Набор для анализа цитотоксичности зеленого цвета Cell-Tox Promega  G8741 
Прибор FACSAriaIII BD Biosciences  FACSAriaIIIс возбуждением 488 нм (синий лазер)
Цифровой блоттинговый сканерLI-CORC-DiGit
Электрофорез и блоттингHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Планшетный ридер с программным обеспечением Soft Max Pro 5.2Молекулярные устройстваSpectraMax 5
Патч-зажим усилительHEKAEPC-10
Puller для приготовления патч-электродыSutter InstrumentsP-97
Клетки ПРОДУКТ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи