Инфекции мочевыводящих путей в небольшой животной модели: трансуретральная катетеризация мужские и женские мышей

Инфекции мочевыводящих путей (UTI) являются одним из наиболее распространенных инфекций в развитых странах¹. Показатели инфицирования похожи между женщин и мужчин среди новорожденных и пожилых². Пременопаузе взрослых женщин, однако, имеют значительно возросла заболеваемость внебольничной UTI, по сравнению с мужчинами^2,3. Учитывая, что это заболевание влияет главным образом женщин, фундаментальных и клинических исследований преимущественно уделялось UTI у самок. Однако ИМП в мужчин является значительным и изученными здравоохранения вызов⁴. Действительно потому что UTI у мужчин связаны с более высокой заболеваемости, эти инфекции обычно определяются как сложные^4,5.

Как развивается наше понимание центральной роли пола предубеждения в физиологии и патологии, новые методы обязаны изучить этот аспект ранее запущенных заболеваний. Половые различия играют важную роль в иммунитет и инфекции; женщины имеют высокий уровень аутоиммунных заболеваний, в то время как мужчины более чувствительны к определенных инфекций, таких как туберкулез, малярия и ВИЧ^6,7. Рак мочевого пузыря, другой урологической патологии, значительно чаще у мужчин, чем женщин, и несколько исследований показали роль андрогенов в развитии злокачественных^{8,9,10,11 ,12}. Примечательно однако, расследование внутрипузырной терапии рака мочевого пузыря выполняется исключительно в женских животных, из-за неспособности неоднократно catheterize мышей-самцов¹³.

Изучение патогенеза UTI опирается на грызунов моделей инфекции (например, мышей и крыс). Мышиных моделях UTI может нанимать uropathogens первоначально изолирован от человеческих инфекций, таких как uropathogenic E. coli (УПЭК), нейтрофилов, Enterococcus, стафилококкили Proteus¹⁴. Как правило бактерии внедряются в мочевой пузырь через катетеризация мочеиспускательного канала. После инфекции, резервуары и почек могут быть удалены для оценки конкретных параметров инфекции, такие как бактериальной колонизации, повреждение тканей или принимающей иммунный ответ^15,16. Универсально однако, только женщины животные используются для исследования UTI. Действительно многие исследования отметили, что, из-за анатомических причин, катетеризация самцов мышей не является возможным^13,,1718,19. Совсем недавно хирургический подход к мужской инстилляции был описан, в котором открыт живота, мочевого пузыря внешне перемещенных, применяя мягкое давление открытия в области живота и бактерии вводят в мочевой пузырь²⁰. Этот подход позволяет мужчин инфекции, ценой хирургическое вмешательство. Таким образом основной нюанс этот подход включает в себя влияние воспаления, на результатах инфекции, такие как потенциал, чтобы побудить противовоспалительные-заживление ответ на разрез²¹. Как наши интересы включают в себя понимание пола предвзятость в ответ на болезнь, мы разработали метод бактериального внутрипузырной инстилляции в мышей-самцов, которое больше соответствует давно нехирургических трансуретральная подход, используемый в женских грызуны²² .

Наша модель основывается на установившейся методологии и предоставляет возможность напрямую сравнивать иммунного ответа на ИМП в женских и мужских животных. Этот метод позволят рассечение-признаку различий в инфекции и потенциально предлагают молекулярных и клеточных ключи к выраженным различия в чувствительности и реакции на инфекции между полами. Кроме того эта модель имеет значение за пределами UTI исследования, позволяя создание моделей для расследования других мочевого пузыря ассоциированных заболеваний, как рак мочевого пузыря, простатит, под или над активной мочевого пузыря синдром и интерстициальный цистит.

Мышь эксперименты были проведены в соответствии с утверждения протокола число 2012-0024 Comité д ' этики en исследования animale Париже центр et Sud (Комитет этики для экспериментов на животных), в соответствии с Европейской директивой 2010/63 ДУЭТ

1. Подготовка катетеры

1. Подготовка одной педиатрической канюля внутривенного доступа для каждой группы мышей, чтобы быть заражены. Используя встроенный пружинный механизм, лишают каждый канюлю иглы, как указано в инструкции изготовителя. Отказаться от иглы, сохраняя только пластиковые внутривенной канюли.
2. Стерилизуйте катетеры в Ламинарный шкаф для одного ультрафиолетовые (у.е.) цикла, обычно 25-30 мин.
   Примечание: Катетеры может использоваться для более чем одной мыши, однако новый катетер должен использоваться между экспериментальной группы, полов или бактериальных штаммов.

2. Подготовка Uropathogenic кишечной инфекции

1. По крайней мере за два дня до инфекции, с помощью стерильных прививка цикла, полоска УПЭК из замороженных бактериальных запасов на бульоне Лурия (LB) агар пластину, содержащие антибиотики, если это уместно. Инкубируйте при 37 ° C на ночь. Плиты могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели.
2. В 100 мл стерильного колбу Эрленмейера прививать 10 мл LB, содержащие антибиотики, если это уместно, с единой колонии от LB пластины и инкубировать стоя при 37 ° C ночь (примерно 16-18 ч).
   Примечание: Постоянные культуры позволяют выражение типа 1 пили, которые необходимы для инфекции²³. Культур, выращенных встряхивания будет иметь менее эффективные пили выражения и, следовательно, несогласованные показатели инфицирования.
3. Измерение оптической плотности (OD)₆₀₀ ночь культуры и рассчитать количество бактерий / мл, с использованием заранее роста кривой. Как пример, для штамма УПЭК UTI89, ОД₆₀₀ = 0,35 эквивалентно⁸ 2 x 10 кое / мл, таким образом, ночь культуры с ОД₆₀₀ = 2.4 будет эквивалентна 13,7 x 10⁸ кое / мл. эмпирически определить связь между OD₆₀₀ и жизнеспособные бактерии с каждый новый штамм, используемых для инфекции.
4. Определите количество бактерий, учитывая количество животных необходимо быть инфицированы и что каждая мышь должна получить около 10⁷ образуя колонии единиц (CFU) в 50 мкл PBS. Включите в расчет мкл ~ 130 мертвый объем катетера и шприц суть и 100 мкл, необходимо определить посевным материалом.
   1. Спиновые бактериальных подвеска в настольная microcentrifuge на 17.000 x г за 1 мин и Ресуспензируйте результате бактериальной Пелле в 2 x 10⁸ кое / мл в PBS. Серийно разбавляют Алиготе подвеска и пластины на агаре фунтов, с помощью антибиотиков, если это уместно определить точное посевным материалом для каждой инфекции.
5. Нарисуйте бактериальных посевным материалом в 1 мл шприц и прикрепить катетер в конце шприца. Нажмите шприц для удаления любых воздуха и угнетают плунжер для заполнения мертвых воздушного пространства в катетер перед началом инстилляции.

3. Подготовка мышей

1. Анестезировать мышей через внутрибрюшинного введения Ксилазина кетамина и 5 мг/кг 100 мг/кг. Дополнительное тепло может быть предоставлена.
2. Убедитесь, что каждая мышь полностью седативные, сжимая зверолов с среднего давления. Мышей полностью седативные, когда они не реагируют и требуется 3-5 мин для достижения этого состояния.
3. Место мыши лежа и применить среднего давления к нижней части живота, чтобы опорожнить мочевой пузырь мочи. Полное пузыри чувствовать себя гороховый под кожу между ileac гребнями.
   Примечание: Вдыхаемого изофлюрановая был использован для catheterize самок мышей^15,22, однако, она не тестировалась ли самцов мышей достаточно наркозом при вдыхании изофлюрановая для этой процедуры.

4. трансуретральная инстилляции самок мышей

1. С помощью недоминирующей руки, Поместите палец на хвост и палец же руки на животе мыши и применить нежное давление в противоположных направлениях твердо держать мышь на месте.
2. Поместите кончик катетера перпендикулярно мыши в отверстие мочеиспускательного канала. С нежным давлением задвиньте катетер в уретру, концентратор встречает отверстие уретры, одновременно снижая шприц так что это параллельно на рабочей поверхности. Катетер не требует смазки. Не толкать или силы катетер в мочеиспускательный канал. Катетер должен надеваться плавно и легко в мочеиспускательный канал, с практически никакого сопротивления.
   1. Прежде чем раз прививать посевным материалом (шаг 4.3), катетер находится в месте, очень осторожно потяните брюшной кожи к голове мыши с пальцем от недоминирующих рука, что уже на брюшко мыши (шаг 4.1). Если катетер в уретре, ткани, составляющих отверстие мочеиспускательного канала не будет двигаться, тогда как если катетер неправильно размещен во влагалище, ткани будет двигаться вверх и от катетер. Этот быстрый тест должен выполняться на каждой мыши.
3. Когда концентратор катетер встречает отверстия уретры, медленно лунки 50 мкл бактериальной посевным материалом. Скорость медленно инстилляции минимизирует пузырно-мочеточниковый рефлюкс в почках. Медленно извлеките катетер для предотвращения утечки, более всего 5. Место мыши в их клетках в лежачем положении.

5. трансуретральная инстилляции самцов мышей

1. Поместите два пальца щипцы краниально и каудально к мыши наружных половых органов. Убрать крайней плоти для полностью разоблачить головки полового члена. После того, как пенис внешне позиционируется, отпустите пальца щипцы.
2. Переместите щипцы для стабилизации выступающих пениса перпендикулярно животного, держа орган, мягко, но туго. Визуализировать уретры слухового прохода и осторожно ввести катетер в небольшое отверстие на кончике органа. Мягко руководство катетер в пенис, к телу мыши, поддержание нежный напряженности с щипцами. Катетер не требует смазки. Не заставляйте катетер в пенис; катетер должен плавно вставьте уретры, указав правильное размещение.
3. После того как центром катетер встречает кончик пениса, очень медленно, отказаться от 50 мкл посевным материалом, при сохранении позиции полового члена. Можно отметить качество инстилляции в настоящее время согласно заранее инстилляции показатель качества, как показано на рисунке 2.
4. Убрать катетер медленно, за количество 5, для предотвращения утечки посевным материалом. Место мыши в их клетках в лежачем положении. Животные должны начать восстанавливаться 30-45 мин после введения анестетика.

6. определение кое в инфицированных органов

1. Заданного момента времени жертву мышей с использованием утвержденных стандартных оперативных процедур (например, вывих шейного или передозировке двуокиси углерода). Смочите живота тщательно с 70% этанол свести к минимуму загрязнение, мех.
2. Сделать надрез через нижнюю треть живота мыши по крайней мере 2 см ножницами и асептически удаление мочевого пузыря и любой другой желаемый органов, включая, но не ограничиваясь, почки, яички, семенных пузырьков или препуция желез, в 5 мл полипропиленовые оснастки крышку пробирки, содержащие 1 мл стерильного PBS. Держите все образцы на льду.
3. Однородный органов с ручной гомогенизатор, до тех пор, пока остается почти без твердых тканей, примерно 15-60 сек в зависимости от органа. Жир не однородный хорошо и легко узнаваемый как блестящие ткани бежево белый. Сбросить жир до или после гомогенизации. Вымойте гомогенизатор в этиловом спирте, следуют PBS между каждой экспериментальной или орган группы.
   Примечание: Как правило, использование портативных гомогенизаторы или шарик мельница гомогенизаторы. Хотя все эти системы дали аналогичные результаты, как это определяется прямое сравнение бактериальной кое на 24 hr послеоперационные инфекции, оптимальные условия для гомогенизации ткани макроорганизма при сохранении бактериальных жизнеспособности должны определяться эмпирически перед Регулярно выполняя этот протокол.
4. Выполняйте серийных разведений гомогенизированные орган суспензий. Пластина разведений на плиты агара LB, содержащие антибиотики, когда это уместно и инкубировать на ночь (~ 15 hr) при 37 ° C. УПЭК штаммов имеют очень быстрое удвоение раз и таким образом, следует позаботиться не инкубировать плиты агара слишком долго, потому что это будет препятствовать возможности рассчитывать отдельные колонии.

7. анализ гранулярных ткани мочевого пузыря потока

1. Подготовьте пищеварение буфер, содержащий коллагеназы на 34 единиц/мл и DNase на 100 мкг/мл, в PBS. Держите на льду. Подготовка одной 15 мл конические трубы на животное быть проанализированы и аликвота 1 мл пищеварение буфера в трубку.
2. В заранее timepoints жертву мышей с использованием утвержденных стандартных оперативных процедур (например, шейки матки вывих или передозировке двуокиси углерода). Смочите живота тщательно с 70% этанол свести к минимуму загрязнение, мех.
3. Сделать надрез через нижнюю треть живота мыши по крайней мере 2 см ножницами и удалить весь мочевого пузыря. Фарш хорошо с ножницами, резка мочевого пузыря в 2-3 мм² размера кусков, обычно около 8 штук.
   1. Добавьте один из фарша мочевого пузыря в тубы пищеварение буфера. Встряхните, чтобы мыть ткани фарш из мочевого пузыря в буфере пищеварение. Держите на льду, до тех пор, пока все пузыри расчленены и фарш.
4. Инкубировать фарша резервуары для 60-75 минут при 37 ° C, с энергичным пожимая вручную для 5 s каждые 15 мин. Когда ткань имеет стекловидный прозрачный вид, напоминающий влажные папиросной бумаги, пищеварения является полным. Длительное пищеварение будет удаление поверхностных белков из клеток, необходимых для идентификации и следует избегать.
5. Инактивирует ферменты пищеварения, добавив 2-3 мл ледяной поток цитометрии буфера (PBS, содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 0,2 мм ЭДТА) и осторожно перемешать. Место труб на льду.
6. Для обеспечения одну ячейку подвеска и удалить любой соединительной ткани, передайте содержимое трубки через 100 мкм фильтром, помещаются в 15 мл Конические трубки. Аккуратно нажмите любые оставшиеся ткани через фильтр с конца поршень шприца. Промойте фильтр с буфером цитометрия потоков еще 2 мл. Храните пробы на льду.
7. Стирать образцы центрифугированием 7 мин на 200 x g, 4 ° C. Ресуспензируйте окатышей в 100 мкл потока цитометрии буфера содержащий ФК блоке, разбавляют до 5 мкг/мл и передачи 96-луночных вокруг нижней плиты. После 10-15 мин добавьте 100 мкл желаемого антитела коктейль для каждого образца. Проинкубируйте образцы для 30-45 мин., на льду, защищенном от света.
   Примечание: ФК блок — реагент, используемый для предотвращения привязки Fc часть антитела к клеткам, выражая Fc рецепторов. Его цель заключается в том, чтобы свести к минимуму неспецифических антитела связывая. Определение антител к использовать будет зависеть гипотеза, проходит проверку в эксперименте и должен быть выбран с входом из литературы. На рисунке 3для измерения общей иммунных клеток инфильтрата, работал антитела анти CD45, который является белком Пан иммунных клеток.
8. Стирать образцы центрифугированием 7 мин на 200 x g, 4 ° C. Ресуспензируйте клеток окатышей в 200 мкл потока цитометрии буфера и передавать образцы через стрейнер клеток 40 µm 5 мл полистирола трубка просто до приобретения на проточный цитометр.
9. Соберите весь образец на проточный цитометр. Хорошее пищеварение даст 200000-400000 клетки, с 8000-10000 CD45⁺ иммунные клетки от наивного мыши пузыри, в то время как инфицированных органов будет содержать больше клеток¹⁶ (рис. 3).
   Примечание: Образцы для анализа потока гранулярных не может использоваться для оценки кое. Не рекомендуется разделить мочевого пузыря на две части, как не существует доказательств, чтобы продемонстрировать, что колонизация УПЭК или иммунных клеток инфильтрата является единым для всей ткани.

В разработке этого протокола когорты мужского и женского мышей C57Bl/6 лет 6-8 недель были внушал и бактериальных бремя, оценены в пузырях точках времени, от 1 часа до 30 дней. Результаты этих исследований представлены в другом месте (Zychlinsky Scharff et al., ожидающие). Здесь мы представляем репрезентативных данных из 24 hr инфекций. Примечательно бактериальных бремя был эквивалентный между мужские и женские мышей на 24 hr послеоперационные инфекции (рис. 1). Мало вариаций в бактериальных бремя было отмечено в пределах каждой группы 24 hr послеоперационные инфекции, похож на то, что сообщалось у самок мышей15,16.

Если внимание уделяется достаточно пустых емкостей для мочи до инфекции, значительные утечки посевным материалом редко наблюдается в самок мышей. Однако инстилляции в мышей-самцов привели в значительных количествах бактериальных посевным материалом, утечка из мочеиспускательного канала, особенно на этапе разработки этого протокола. Чтобы определить ли потеря посевным материалом во время инфекции повлияла колонизации или установления инфекции, мы используем систему рейтинга для каждой инстилляции. Каждый инстилляции забил на шкале от 1-5, с 1 является наиболее оптимальным и бактериальной колонизации послеоперационные инфекции определяется 24 hr (рис. 2, поле). Хотя эта система была следователь зависимой, и таким образом, потенциально субъективный, основной автор данного исследования определяется все баллы, сразу же после инстилляции, до оценки бактериальной нагрузки в зараженных пузыри. Нет статистически значимых различий существовали среди кое, полученные от животных с различными инстилляции баллы, как оцениваются непараметрических тестов Крускала-Уоллиса сравнения средний ранг каждого столбца с средний ранг каждого столбца (p = 0,17) и исправление для нескольких сравнений с использованием Данн теста. Из этого анализа можно сделать вывод, что субоптимальные закапывание (оценка > 3), что привело к существенной утечки бактериальной посевным материалом во время инфекции, значительно не снижают бактериальной колонизации на 24 hr (рис. 2, график). В частности с опытом работы, частота утечки в самцов мышей существенно сократился.

Наконец цель при разработке этой модели был непосредственно сравнить иммунного ответа на УПЭК в женских и мужских животных. Чтобы проверить ли клеточной инфильтрации изменяется между полами в ответ на UTI, количество CD45+ иммунные клетки в наивной и зараженных когорты мужского и женского мышей были оценены проточной цитометрии. В то время как количество иммунных клеток в наивной животных не отличалось между женской и мужской мышей (p = 0,95), там была статистически значимое увеличение проникновения в резервуары инфицированных самок мышей (p = 0.0015) (Рис. 3A-B).

Рисунок 1: УПЭК колонизирует женских и мужских пузыри с равной эффективностью. 6-8 неделе старых мышей C57Bl/6 мужчин и женщин были привил с 107 кое УПЭК. 24 hr послеоперационные инфекции, пузыри асептически были удалены для перечисления бактериальной нагрузки. График изображает CFU/мочевого пузыря. Каждая точка является одним нажатием, представитель эксперимент 5 показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Качество инстилляций не коррелируют с бактериальной нагрузки на 24 hr послеоперационные инфекции. 6-8 неделе старых мышей C57Bl/6 мужчин и женщин были привил с 107 кое УПЭК. Сразу же после каждого закапывания один исследователь присваивается показатель качества инстилляции, как определено по определенным критериям (в штучной упаковке текст). 24 hr послеоперационные инфекции, пузыри асептически были удалены для перечисления бактериальной нагрузки. График изображает установленного качества Оценка против CFU/мочевого пузыря. Каждая точка является одним нажатием, показаны 5 пуле эксперименты. p = 0,17, Крускала-Уоллиса тест сравнения средний ранг каждого столбца с средний ранг каждого столбца с тест post hoc Данн для нескольких сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Иммунных клеток инфильтрата увеличивается в самок мышей в ответ на UTI. 6 до 8 недели старых мышей C57Bl/6 мужчин и женщин были привил или нет с 107 кое УПЭК. Представитель точка участки изображают всего пузыря ячейки с CD45+ иммунные клетки воротами в розовом от наивного или зараженных мышей. График показывает абсолютное количество CD45+ иммунные клетки в пузырях из наивно или 24 hr инфицированных мышей. Каждая точка является одним нажатием, показаны 2 пуле эксперименты. p значения определяется тест Манна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.