Протокол использовать поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) микрофильтр с покрытием для эффективного улавливания и высвобождения thermoresponsive жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) представлено. Этот метод позволяет захватывать ТХМ из крови больных и последующим выпуском жизнеспособной КТК для вниз по течению вне кристалла культуры, анализ и характеристика.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Захват и Выпуск Жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток из крови
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Демонстрируется способ размера на основе захвата жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) из цельной крови, наряду с выпуском этих клеток из чипа для нисходящего анализа и / или культуры. Стратегия использует использование нового Parylene С слот пор мембраны микрофильтр для захвата CTC и покрытие из поли (N -iso-пропилакриламид) (PIPAAm) для thermoresponsive жизнеспособного освобождения захваченного КТК. Захват живых клеток включается за счет использования конструкции геометрии слота пор с конкретными размерами, чтобы уменьшить напряжение сдвига, обычно связанные с процессом фильтрации. В то время как микрофильтр демонстрирует высокую эффективность захвата, высвобождение этих клеток является нетривиальной. Как правило, только небольшой процент клеток высвобождаются, когда такие методы, как обратный поток или клетки соскоба используются. Сильная адгезия этих эпителиальных раковых клеток к мембране Parylene С обусловлено неспецифическим электростатическим взаимодействием. Противодействовать тысявляется эффект, мы использовали использование PIPAAm покрытия и эксплуатировали его термических реагирующие межфазных свойств, чтобы освободить клетки от фильтра. Кровь сначала фильтруют при комнатной температуре. Ниже 32 ° C, PIPAAm является гидрофильным. После этого фильтр помещен в любой из культуральной среды или буфер, поддерживаемую при температуре 37 ° С, что приводит к PIPAAm превращения гидрофобными, а затем отпуская электростатически связанных клеток.
Введение
Метастатического заболевания несет ответственность за большинство случаев смерти от рака. Разработка прогностической и сопутствующий диагностический биомаркером метастазирования имеет решающее значение в лечении рака и лечения. Циркулирующие опухолевые клетки (КТК) играют центральную роль в распространении опухоли и метастазов. Кроме того, будучи легко доступны в качестве "жидкой биопсии" биомаркеров, CTC у онкологических больных "периферической крови повышался как« рассадник »для исследования биомаркеров рака. КТК были хорошо подтверждены в качестве прогностического биомаркера в различных условиях, в том числе рака молочной железы, простаты и колоректальный рак
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этика Заявление: В целях защиты прав человека в качестве субъекта, образцы крови были получены после информированного согласия в соответствии с процедурами, утвержденными Университетом этическими комитетами Майами в рамках IRB 20150020.
Примечание: в крови, чтобы быть отфильтрованы для CTC захвата должны быть собраны в ЭДТА трубки для предотвращения коагуляции.
1. Покрытие микрофильтра с поли (N-изо-пропилакриламид) (PIPAAm)
- Взвесить PIPAAm подготовить 10% вес / об раствора в бутаноле. Смешайте с помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным.
- Вырезать из пластика микроскопа скользит в примерно 12 мм х 12 мм квадратов либо с паро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование крови здоровых доноров (полученные в соответствии с протоколом, утвержденным в Университете Майами IRB 20150020 следующего информированного согласия) подсыпали культивированных раковых клеток, в thermoresponsive техники для высвобождения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток (КТК), достигнутый захват, выпуск и эффективность поиска информации 94% ± 9%, 82% ± 5% и 77% ± 5% соответственно (таблица 1) 15. Для сравнения, выпуск и извлечение э.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Процесс захвата жизнеспособной КТК из цельной крови и освобождая их от микрофильтра относительно проста; Однако несколько критических точек стоит упомянуть. Крайне важно, как и всей культуры клеток, стерильное состояние сохраняется в течение всего процесса. Начальная стадия покрытия фильтра с PIPAAm имеет решающее значение, в качестве основы для техники высвобождения клеток из фильтра основан на использовании температуры реагирующих межфазных свойств PIPAAm в. Для того, чтобы обеспечить фильтр был эффективно покрытием, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Часть этой работы была защищена в соответствии с предварительной заявкой на патент США No 62/219808. Сиддарт Равал является акционером компании Circulogix Inc., которая занимается коммерческим производством фильтров и фильтрующих кассет/картриджей, используемых в данной статье.
Благодарности
Мы благодарим всех пациентов, которые сдали образцы крови для поддержки этой работы. Мы благодарим докторов Джузеппе Джаконне, Ритеша Параджули и Марка Э. Липпмана за их помощь в сборе клинических образцов, а также докторов Кармен Гомес, Ральфа Ландграфа, Стефана Цюхнера, Туми Геттуша, Диану Лопес за их содержательные дискуссии. Чжэн Ао благодарит за частичную поддержку и помощь со стороны Программы магистратуры Шейлы и Дэвида Фуэнте в области биологии рака, Комплексного онкологического центра Сильвестра.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фильтр слотов | Circulogix Inc. | MSF-01 | Фильтры различных размеров на основе фильтрации для ЦОК из крови или мочи (www.circulogixinc.com) |
| поли(N-изо-пропилакриламид) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Неопасные. Хранить при комнатной температуре. |
| 1-Бутанол | Сигма Олдрич | B7906 | Использование в хорошо проветриваемом помещении |
| Пластиковые предметные стекла для микроскопа | Cole-Parmer | 48510-30 | Любые пластиковые предметные стекла или в качестве альтернативы любой вид квадрата (металлический, акриловый и т.д.) могут быть использованы, если это будет тюк для удержания фильтра 8 мм x 8 мм квадратный |
| Spin Coater | Специальные системы покрытий | SCS G3 Spin Coater | Инструмент |
| Полиимидная лента | Uline | S-7595 | Полиимид - это общее название каптоновой ленты, которую можно приобрести у нескольких поставщиков (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri чашки 35 x 10 мм | VWR | 25373-041 | |
| Кассета с микрофильтром | Circulogix Inc. | FC-01 | Кастомные катрижки доступны на основе фильтрации для ЦОК из крови или мочи. |
| Шприц 20 мл | BD Scientific | 302830 | |
| Шприцевой насос | KD scientific | 78-0100V | Можно использовать любой шприцевой насос, способный вместить шприц объемом 25 мл |
| Cellstar 50 мл Центрифуга пробирка | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6-луночная пластина | VWR | 89131-688 | Можно использовать любую марку, при условии, что поверхность совместима для клеточной адезии и не отталкивает |
| клетки SKBR3 ATCC | HTB-30 | ||
| Анализ живых мертвецов Life | Technologies | L3224 | Любой анализ, который может обеспечить разумный анализ для оценки живых клеток, будет работать |
| Инкубатор для клеточных культур | VWR | 98000-368 | Любой инкубатор, который можно использовать для клеточной культуры, будет достаточно |
Ссылки
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
