Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Защитные Эффективность и легочная иммунный ответ После подкожного и Интраназальная БЦЖ администрации у мышей

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54440

⸱

19 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы подробно описываем методологию, использованную для сравнения защитной эффективности и иммунного ответа легких, индуцированного интраназальной и подкожной иммунизацией с помощью БЦЖ на мышиной модели. Наши результаты демонстрируют преимущества легочной вакцинации и предполагают роль IL17-опосредованного ответа в вакциноиндуцированной защите.

Аннотация

Несмотря на глобальный охват внутрикожной вакцинацией БЦЖ, туберкулез остается одним из самых распространенных инфекционных заболеваний в мире. Доклинические данные свидетельствуют о том, что вакцины против туберкулеза легких являются перспективной стратегией профилактики легочных заболеваний, которые являются причиной передачи. В данной работе мы описываем методологию, использованную для демонстрации на мышиной модели преимуществ интраназальной вакцинации БЦЖ по сравнению с подкожной. Наши данные показали большую защитную эффективность после интраназального введения БЦЖ. Кроме того, наши результаты указывают на то, что легочная вакцинация вызывает более высокий иммунный ответ в легких, включая ответы Th1 и Th17, а также повышение концентрации иммуноглобулина А (IgA) в дыхательных путях. Наши данные показывают корреляцию между защитной эффективностью и присутствием клеток, продуцирующих IL17, в легких после заражения микобактериями туберкулеза, что позволяет предположить роль этого цитокина в защитном ответе, обеспечиваемом легочной вакцинацией. Наконец, мы подробно описываем глобальный рабочий процесс, который мы разработали для изучения респираторной вакцинации на мышиной модели, который может быть экстраполирован на другие противотуберкулезные вакцины, помимо БЦЖ, нацеленные на реакцию слизистых оболочек или другие легочные пути введения, такие как интратрахея или аэрозоль.

Введение

Туберкулез (ТБ) является одним из ведущих инфекционных заболеваний , вызывающих более связанных смертей , чем ВИЧ в мире , и в сочетании с растущим увеличением штаммов , устойчивых ко многим лекарственным делает туберкулез становится тревожной глобальной проблемой здравоохранения 1. Новые диагностические инструменты, более эффективные и менее токсичные препараты, а также новые безопасные и эффективные вакцины ТБ острая необходимость, особенно в развивающихся странах.

Живой ослабленный Кальметта-Герена (БЦЖ) в настоящее время является единственным лицензированным вакцина против туберкулеза, который был вводят внутрикожно при рождении с 1970 года во всем мире. BCG считается эффективным в предотвращении тяжелых форм заболевания (менингит и милиарный туберкулез) у детей, но показал противоречивую эффективность против туберкулеза легких , ответственной передачи заболевания 2.

Легочная вакцинация, которая имитирует естественный путь заражения туберкулезом, представляет собой привлекательный подход для грунтования иммунного ответа локального хостаs. В связи с этим, различные доклинических работ в различных соответствующих моделей ТБ на животных показали большую эффективность вакцины ниже легочной иммунизации , по сравнению с подкожным или внутрикожно 3-6. Тем не менее, защитные механизмы, спровоцированные вакцинацией легких недостаточно хорошо изучены. В последние годы, несколько работ указывали на IL17-опосредованной реакции в качестве важного фактора ТБ специфических слизистых оболочек иммунного ответа, как и в моделях мыши , дефицитные по IL17 слизистого поствакцинальный защитной эффективности нарушается 7,8.

Недавно мы показали впервые , что интраназальное введение БЦЖ защищены / 2 мышей DBA, штамм мыши , характеризующийся отсутствием защиты после подкожной иммунизации БЦЖ 9. Эти результаты свидетельствуют о том, что вакцинация туберкулезом органов дыхания может быть более эффективным в снижении темпов туберкулеза в эндемичных странах, где внутрикожные БЦЖ считается неэффективным против pulmonичных ТБ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все мыши содержались в контролируемых условиях и наблюдалось каких-либо признаков заболевания. Экспериментальная работа проводилась в соответствии с европейскими и национальными директивами по защите экспериментальных животных, а также с согласия компетентных местных комитетов по этике.

1. Приготовление квантифицированных глицерол Запасы БЦЖ датского и микобактерий туберкулеза H37Rv

Примечание: Все протоколы, описанные были выполнены в условиях BSL3.

  1. Размораживайте запасы глицерина БЦЖ датском или штаммов H37Rv и инокуляции 100 мкл в 10 мл 7H9 среды 10 , дополненных с твин-80 0,05% (об / об) и АЦП (альбумин, декстроза, каталаза) 10% (об / об).
  2. Выдержите в статических условиях в течение одной недели при 37 ° С до тех пор, пока культура в росте лог-фазы.
  3. Интенсификация бактериальной культуры путем переноса 10-мл культуры до 200 мл свежей среды. Выдержите в течение 20 дополнительногодней в статических условиях.
  4. Переход к 50-мл центрифужные пробирки и центрифуги в течение 15 мин при 2500 х г.
  5. Откажитесь супернатантов и ресуспендируют осадок в бактериальную остаточного объема. Добавить в каждую пробирку стерильные 3-мм диаметра стеклянных шариков (10 - 15 на пробирку).
  6. Vortex энергично в течение 1 мин для того, чтобы отделить бактериальные сгустки. Ресуспендируют каждую гранулу в 10 мл PBS с Tween-80 0,05% (об / об).
  7. Оставьте пробирки в течение 10 мин, позволяя наибольшие бактериальные агрегаты и стеклянные бусы осесть.
  8. Восстановление 9,5 мл надосадочной жидкости из каждого из 4-х трубок, содержащих небольшие комки и единичные бактерии и объемы передачи данных в один свежий 50-мл центрифужную пробирку (конечная выздоровел объем 38 мл). Центрифуга в течение 10 мин при 400 х г.
  9. Восстановление 35 мл надосадочной жидкости (содержащие в основном одиночные бактерии) в одной свежей 50-мл центрифужную пробирку и добавляют 15 мл PBS с глицерином 50% (об / об), получая конечную концентрацию глицерина в 15% (об / об).
  10. осторожно перемешатьи распространять в 1-мл аликвотами в соответствующие пробирки для замораживания. Хранить при температуре -80 ° С (одна серия обеспечивает примерно 50 аликвоты глицерине).
  11. Для количественной оценки запасов глицерина, оттаивать глицерина на следующий день после замораживания и выполнить семь десятикратном серийных разведений в отдельных 1,5 мл пробирки, содержащие 900 мкл PBS.
  12. Пластина 100 мкл каждого разбавления в 7H10 твердой агаровой среде , дополненной 10 АЦП 10% (об / об) , полученного в чашках Петри диаметром 55 мм.
  13. Осторожно добавьте 3 мм диаметра стеклянных шариков (прибл. 10 на чашку) и осторожно встряхните пластину равномерно распределяют объем над агаром. Откажитесь шарики и печать агаризованной с парафином.
  14. Инкубируют в течение 21 дней при 37 ° С и определяют концентрации бактерий путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в разведениях, где единичные колонии можно точно отличить.

2. Мышь Вакцинация

  1. Оттепель предварительно количественно БЦЖ глицерина и разбавить его в PBS, чтобы препдве суспензии. Расчет конечного объема с учетом дозы на одно животное составляет 100 мкл для подкожного введения (10 7 КОЕ на мл для подкожной вакцинации) и 40 мкл для интраназального введения (2,5 х 10 7 КОЕ для интраназальной вакцинации).
  2. Используйте специализированную рабочую станцию ​​для анестезии для грызунов обезболить мышей смесью изофлуран и кислорода. Использование изофлурановым 5%, чтобы вызвать анестезию, и 2% для поддержания мышей в анестезии камере. (Другой метод анестезии общепринятый может быть использован).
  3. Для подкожного введения вакцины заполняют 1 мл шприц с иглой 26 G 1 мл бактериальной суспензии (10 7 КОЕ / мл). Удалить пузырьки воздуха.
  4. Поместите наркозом мышь на ровной поверхности в положении лежа внутри ламинарный и прививают подкожно 100 мкл (10 6 КОЕ / доза) вакцины в бочке мыши обратно. Вернуть мышь к клетке и следить за ним, чтобы убедиться, что он PropeRly восстанавливается после анестезии.
  5. Измените иглу шприца между каждым введением мыши. Удалены пузырьки воздуха, как описано выше.
  6. Для интраназального введения, поместите наркозом мышь в положении лежа на спине внутри капота.
  7. С помощью микропипетки принять 20 мкл суспензии 2,5 × 10 7 КОЕ / мл. Поместите инокулята капельный между двумя ноздрями, пока весь объем не был сдан, оставляя время между каплями, чтобы позволить мышь дышать громкость. Примечание: мыши могут страдать от дыхательной недостаточности во время этой процедуры, таким образом они должны быть оставлены на ассимилировать каждую каплю перед администрировать следующий, чтобы предотвратить его как можно больше.
  8. Повторно заполнить микропипетки с еще 20 мкл и повторить операцию. Если мышь начинает просыпаться от наркоза после первой прививки, поместите его в наркоз камере до второго. Вернуть мышь к клетке и убедитесь, что он правильно восстанавливаетот наркоза.

3. Мышь Интраназальная Вызов с H37Rv Strain

  1. Разморозить предварительно количественно H37Rv глицерина и разбавить его в PBS для приготовления бактериальной суспензии в 2500 КОЕ на мл. Расчет конечного объема с учетом дозы на одно животное составляет 40 мкл.
  2. H37Rv, засевают интраназально, как описано в 2.5 - 2.7. Окончательная доза вызов на мышь 10 2 КОЕ / 40 мкл.

4. Анализ индуцированного иммунного ответа в Легких

  1. Легкое сотовая подвеска
    Примечание: Оценка поствакцинальный адаптивного иммунного ответа в легких требует генерации суспензии отдельных клеток. Для этой цели мы используем диссоциатора ткани, такие как GentleMACS.
    1. Жертвоприношение мыши по цервикальной дислокации (или другой общепринятой методологии гуманной) и обеспечить мышь мертва касаясь глазного яблока, чтобы подтвердить отсутствующим мигательного рефлекса.
    2. Внутри ламинаре, извлечь лUngs используя стерильные ножницы и пинцет и поместить их на чистую поверхность. Чистые легкие удаления трахеи и соединительной ткани, а не передавать легкие в 1,5-мл пробирку с PBS (поддерживать на льду до обработки).
    3. Для создания клеточной суспензии, поместить легкие в правильной трубки для диссоциации органов (С-Диссоциатор трубки) , содержащей 5 мл 10 мМ HEPES-NaOH , рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2 и 1,8 мМ CaCl 2 буфер.
    4. Добавьте 100 мкл коллагеназы D 100 мг / мл (2 мг / мл конечной концентрации), и 40 мкл ДНКазы I 20000 МЕ / мл (160 МЕ / мл конечной концентрации.
      Примечание: Маточные растворы коллагеназы D или DNAseI получают , растворяя лиофилизированный ферментов в PBS или глицерин 50% (об / об), 20 мМ Трис-HCl , рН 7,5 г MgCl 2 1 мМ, соответственно.
    5. Поместите пробирку в диссоциатора ткани и использовать предопределенный программу m_lung_01 для фрагментации легких. Инкубируйте пробирку при 37 ° С в водяной бане в течение 30 мин.
    6. Место йе трубки в диссоциатора и использовать предопределенный программу m_lung_02 для полной гомогенизации легких в одной клеточной суспензии.
    7. Пропускают клеточной суспензии через сетчатый фильтр из нейлона ячейки 70 мкм, установленной на центрифужную пробирку на 50 мл. Промыть сетчатый фильтр с 10 мл RPMI 1640 среды.
    8. Центрифуга клетки в течение 5 минут при 400 мкг и отбросить супернатант.
    9. Добавить 1 мл эритроцитов лизиса буфера, перемешать встряхиванием и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
    10. Добавьте 10 мл среды RPMI 1640 и центрифужные клеток в течение 5 минут при 400 х г.
    11. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл полной среды RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (FCS), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл стрептомицина, 100 МЕ / мл пенициллина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола.
      Примечание: FCS, инактивируют путем инкубирования при 56 ° С в течение 30 минут.
    12. Граф клеток и добавить полную среду RPMI 1640 , чтобы достичь окончательной клеточной плотности 10 7 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подсчета клеток, мы используем автоматический счетчик клеток.
    13. Распределить 100 мкл клеточной суспензии в U-образным дном 96-луночного стерильной пластины (10 6 клеток / лунку).
    14. Добавить 50 мкл / лунку полной среды RPMI 1640 с 15 мкг / мл коммерческой H37Rv очищенного белкового деривата (PPD) (5 мкг / мл конечная концентрация).
  2. Супернатант коллекция для определения цитокинов ELISA
    1. Инкубируйте пластины от 4.1.14 в течение 48 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    2. Центрифуга пластины в течение 5 мин при 400 мкг и восстановить 100 мкл супернатанта.
    3. Хранить при температуре -80 ° С.
    4. Развести супернатанты 1/10 и 1/2 в аналитическом буфере для определения и IFN & gamma; IL17A соответственно. Определение концентрации цитокинов с использованием коммерческих наборов ELISA, в соответствии с инструкциями производителя (наборы ELISA развития).
  3. Внутриклеточное окрашивание для определения цитокина-продуцирующих клеток CD4 + с помощью проточной цитометрии
    1. Инкубируйте пластины от 4.1.14 в течение 18 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    2. Добавить 1,5 мкл брефелдин 1 мг / мл (запас растворенного в ДМСО) в каждую лунку (10 мкг / мл конечной концентрации) и инкубировать в течение шести дополнительных часов.
    3. Центрифуга пластину из 4.3.2 в течение 1 мин при 3200 мкг и отбросить супернатант.
    4. Ресуспендируют клеток в 50 мкл анти-мыши CD4-FITC разведенных в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS (1/500) и инкубируют в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
    5. Центрифуга пластину из 4.3.4 в течение 1 мин при 3200 мкг, отбросить супернатант и добавить 100 мкл раствора фиксации / лунку. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
    6. Вымойте клетки дважды с 150 мкл / промывки пермеабилизации раствора.
      Примечание: 10-кратный концентрированный запас разбавленного в деионизированной воде для приготовления 1х рабочего раствора.
    7. Ресуспендируют клеток в 50 мкл анти-мыши IFN & gamma; APC и анти-мыши IL17A-APC.Cy7 разводили в permeabilРешение зация (1/250 оба антитела).
    8. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
    9. Вымойте клетки дважды с 150 мкл / промывки пермеабилизации раствора.
    10. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS для приобретения цитометрии потока.

5. Анализ иммуноглобулинов в БАЛ (BAL)

  1. Получение образцов БАЛ
    1. Жертвоприношение мыши по цервикальной дислокации (или другой общепринятой методологии гуманной) и обеспечить мышь мертва касаясь глазного яблока, чтобы подтвердить отсутствующим мигательного рефлекса.
    2. Expose трахеи с использованием надлежащей точности стерильного пинцета и ножниц и выполнить небольшой надрез в трахее, убедившись, что не иссечь его полностью. Будьте осторожны, чтобы не вызвать кровотечение, которое может загрязнить образец BAL.
    3. Введем в трахею канюлю, соединенную с стерильным 1 мл шприц с 800 мкл охлажденного льдом PBS.
    4. Привить медленно PBS в легкие, а затем гЭковер БАЛ объем оттягивая поршень шприца очень медленно, чтобы избежать коллапса легких.
      Примечание: Восстановление от 500 до 600 мкл является удовлетворительным.
    5. Перенести объем BAL в 1,5 мл трубки и подтвердить БАЛ остается неокрашенной, указывая, что не загрязненные кровью (поддерживать на льду до обработки).
    6. Центрифуга образцов BAL в течение 5 мин при 400 мкг, и передачи супернатант в новую пробирку.
    7. Хранить надосадочную жидкость при температуре -80 ° С.
  2. Определение IgA в БАЛ супернатантах
    Примечание: Все используемые реагенты при комнатной температуре.
    1. Пальто с высоким содержанием белка связывания полистирола с плоским дном 96-луночные планшеты с 100 мкл PPD разбавленных в PBS (10 мкг / мл) для M. туберкулез -специфический определение IgA, или 100 мкл БАЛ супернатанта разводили в 10 раз в PBS для определения общего IgA.
    2. Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    3. Удалите супернатант и нажмите планшет на бумажное полотенце, чтобы dгу. Промыть 200 мкл / лунку PBS.
    4. Блок с 200 мкл / лунку бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 1% (вес / объем) в PBS-Tween-80 0,05% (об / об) (блокирующем буфере).
    5. Инкубируют 1 час при комнатной температуре.
    6. Промывают один раз 200 мкл / лунку PBS-Tween-80 0,05% (об / об) (промывочным буфером).
    7. Добавьте 100 мкл неразбавленного БАЛ супернатанте в лунках PPD покрытием. Выдержите два часа при комнатной температуре.
      Примечание: Если общее определение IgA осуществляется параллельно с PPD-специфического IgA, оставить общий IgA лунки со 100 мкл буфера для промывки во время инкубации.
    8. Промыть три раза с 200 мкл / лунку промывочного buffer.0170004
    9. Добавьте 100 мкл пероксидазы хрена (HRP) против мышиного IgA разводили в блокирующем буфере (1/10000).
    10. Выдержите 1 час RT.
    11. Промыть пять раз с 200 мкл / лунку буфера для промывки.
    12. Добавьте 100 мкл / лунку 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (TMB). Инкубировать 20 мин при комнатной температуре в тон темный.
    13. Добавить 100 мкл / лунку H 2 SO 4 0,5н. Прочитайте пластину в спектрофотометре при длине волны 450 нм.

6. Определение бактериальной нагрузки в легких

  1. Lung гомогенизацию и металлизированный
    1. Через четыре недели после того, как вызов, принести в жертву мыши по цервикальной дислокации (или другой общепринятой методологии гуманной) и обеспечить мышь мертва касаясь глазного яблока, чтобы подтвердить отсутствующим мигательного рефлекса.
    2. Поместите мышь в положении лежа на спине, закрепленной на плоской и дезинфицировать поверхности внутри ламинаре.
    3. Сделайте надрез и удалить кожу от области груди, чтобы оставить видимой грудной области.
    4. Вырез ребра и собирать легкие и сердце, используя стерильные ножницы и пинцет. Поместите органы на чистую поверхность.
    5. Продувка легкие путем удаления сердца, трахеи и соединительной ткани и переносят легкие в 1,5-мл пробирку с 1 мл деионизированной воды,(Поддерживать на льду до обработки).
    6. С помощью стерильного пинцета, чтобы передать легкие каждой мыши в нужную трубу для гомогенизацией органа (M - Диссоциатор трубка), содержащий 1 мл деионизированной воды.
    7. Поместите пробирку в диссоциатора ткани и использовать предопределенный программу RNA_1 гомогенизировать легкие.
    8. Сделать пять десятикратных серийных разведений в 1,5 мл пробирки, начиная с 100 мкл гомогената легких разведенных в 900 мкл.
    9. Пластинчатые разведений, как описано в 1.11-1.14.
  2. Разграничение между БЦЖ и H37Rv с помощью ПЦР
    Примечание: В пластинах из 6.1.6, соответствующей группе вакцинированных БЦЖ интраназальным путем, мы анализировали репрезентативное число колоний путем разборчивого ПЦР между БЦЖ и H37Rv, чтобы гарантировать, что КОЕ считается для оценки вакцин присвоил защитной эффективности соответствовали однозначно H37Rv. Этот ПЦР-амплификации мишени RD9, геномная область отличается в BCG и М. Tuberculosis, давая фрагмент 2618 п.н. для H37Rv и 465 пар оснований для БЦЖ 11.
    1. Подготовка мастер-микс запас для всех образцов с объемами на выборку, как указано, а затем распределяют в ПЦР-пробирки (9 мкл / образец).
      Примечание: Буфер 5x: 2 мкл. Прямой праймер 25 мкМ (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 мкл, обратного праймера 25 мкм (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 мкл, Taq полимеразы 5 единиц / мкл: 0,04 мкл деионизованной H 2 O: 6,32 мкл.
    2. Сенсорный колонии с помощью стерильной зубочисткой и погружать зубочистку с образцом в ПЦР-пробирку, содержащую основной смеси.
    3. Запуск ПЦР со следующей программой: 10 мин 95 ° C (этот шаг, чтобы вызвать бактериальное разрушение), 10 мин 95 ° C (этот шаг, чтобы вызвать бактериальное разрушение), 35 циклов (30 секунд при 95 ° С, 1 мин при 58 & deg; C и 4 мин при 72 ° С).
    4. Загрузка образцов ПЦР в агарозном геле 1% этидиумбромидом и запустить образцы для визуализации фрагментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эта работа описывает сравнение двух способов введения БЦЖ: подкожное и интраназальное. Подкожное сравнима с внутрикожного, которая является текущей клинической маршрут для BCG по всему миру. Интраназально вакцинации ставит своей целью имитировать естественный путь заражения M. туберкулез, с целью вызвать иммунный ответ непосредственно в легких, основной целевой орган этого возбудителя.

Рисунок 1 описы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на то, что нынешняя вакцина против туберкулеза (БЦЖ) является наиболее широко применяемой вакциной в истории, туберкулез остается одной из ведущих причин смертности и заболеваемости инфекционными заболеваниями во всем мире. Этот парадокс объясняется отсутствием защиты этой вакцины от туберкулеза легких, ответственной формы передачи. Срочно необходимы новые подходы к вакцинации, эффективные против легочных форм заболевания, поскольку они окажут наибольшее влияние на передачу болезни во всем мире.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [номер гранта BIO2014-5258P], "European Commission" в рамках программ H2020 [номера грантов TBVAC2020 643381].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Middlebrook 7H9 бульонBD271310
Middlebrook ADC EnrichmentBD211887
Tween 80ScharlauTW00800250
диаметром 3 мм Стеклянные бусиныScharlau038-138003
Middlebrook 7H10 AgarBD262710
1 мл шприц 26GA 0,45 x 10 ммBD301358
Диссоциатор GentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235
C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
M TubesMiltenyi Biotec130-093-236
Collagenase DRoche11088882001
DNaseIApplichemA3778,0100
Falcon 70 µ m Клеточный фильтрCorning352350
RPMI 1640SigmaR0883
Буфер для лизирования красных кровяных телецSigmaR7757
Добавка GlutaMAXGibco35050-061100x концентрированный
раствор пенициллина-стрептомицинаSigmaP4333100x концентрированная
сыворотка теленкаплода Биологическая Промышленность04-001-1A
2-меркаптоэтанолSigmaM3148-25ML
Scepter 2.0 Портативный автоматизированный счетчик клетокДатчики счетчика миллипорPHCC20040
Scepter, 40 & микро; mMilliporePHCC40050
Mycobacterium tuberculosis - Tuberculin PPDStatens Serum Institut (SSI)2390
Мышиный ИФН-&гамма; Комплект для разработки ИФА Mabtech3321-1H
Мышь IL17A Набор для разработки ELISA Mabtech3521-1H
Brefeldin ASigmaB7651
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD553047
BD Cytofix/Cytoperm KitBD555028
APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17ABD560821
APC Mouse Anti-mouse IFNgBD554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 мм. 23G x 1 1/4"UNIMED27.134Используется в качестве канюли трахеи для BAL
высокобелковосвязывающего полистирола плоскодонных 96-луночных планшетов MAXISORPNUNC430341
альбумином, из бычьей сывороткиSigmaA4503
Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)− Антитело к пероксидазеSigmaA4789
3,3′,5,5′-Тетраметилбензидин (TMB) SigmaT0440
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21107В комплект входит буфер 5x

Ссылки

  1. Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
  2. Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
  3. Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
  4. Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
  5. Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
  6. Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
  7. Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
  8. Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
  9. Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
  10. Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
  11. Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
  12. Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533(2015).
  13. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
  14. Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
  15. Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312(2013).
  16. Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
  17. Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IL17IgAH37Rv
Защитные Эффективность и легочная иммунный ответ После подкожного и Интраназальная БЦЖ администрации у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.