Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

9 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эта рукопись представляет собой метод литья под давлением для инженера-микрососудов, что перепросматривать физиологические свойства эндотелия. Процесс Микрожидкостных на основе создает патент 3D сети сосудов с адаптивности условиями, такими, как поток, клеточный состав, геометрии и биохимических градиентов. Процесс изготовления и примеры возможных применений описаны.

Аннотация

В пробирке платформ для изучения эндотелиальные клетки и сосудистой биологии в основном ограничиваются 2D - эндотелиальной клеточной культуре, проточных камер с полимером или на основе стеклянных подложек, а также анализов образования трубки гидрогеля на основе. Эти анализы, в то время как информативным, не резюмировать люменов геометрию, правильное внеклеточный матрикс и многоклеточные близость, которые играют ключевую роль в модуляции сосудистой функции. Эта рукопись описывает метод литья под давлением для создания Engineered сосуды диаметром порядка 100 мкм. Микрососуды изготовлены затравкой эндотелиальные клетки в микрожидкостных канал встроенного в родной типа I коллагена гидрогель. Объединив паренхиматозные клетки в коллагеновой матрице предварительного направлять образование, специфические микросреды ткани могут быть смоделированы и изучены. Дополнительные модуляциями гидродинамических свойств и состава средств массовой информации позволяют управлять сложной сосудистой функции в пределах желаемого микросреды.Данная платформа позволяет для изучения набора периваскулярного клеток, крови-эндотелий взаимодействий, ответ потока и тканевой микрососудистой взаимодействий. Engineered микрососудов дают возможность изолировать влияние от отдельных компонентов сосудистой ниши и точно контролировать свои химические, механические и биологические свойства для изучения сосудистой биологии как в здоровье и болезни.

Введение

Микрососудов в каждом органе помогает определить микросреду ткани, поддержания гомеостаза тканей и регулируют воспаление, проницаемость, тромбоз и фибринолиза 1,2. Микрососудистой эндотелий, в частности, является интерфейсом между кровотоком и окружающей ткани и , следовательно , играет критическую роль в модуляции сосудистой и функции органов в ответ на стимулы , такие как гидродинамические силы и циркулирующих цитокинов и гормонов 3 - 5. Понимание подробные взаимодействия между эндотелий, кровь, и окружающая микросреда ткани имеет важное значение для изучения сосудистой биологии и прогрессирования заболевания. Однако прогресс в изучении этих взаимодействий тормозились ограничены в пробирке инструментов , которые не Резюмируя в естественных условиях структуры микрососудов и функционируют 6,7. В результате, поле и терапевтическое продвижение уже в значительной степени опирался на дорогостоящий и Time-потребляющих животных моделей , которые часто не в состоянии перевести к успеху у людей 8 - 10. В то время как модели в естественных условиях незаменимы при изучении механизмов болезни и сосудистых функций, они являются сложными и зачастую не имеют точный контроль индивидуального клеточного, биохимических и биофизических киев.

Сосудистую систему по всему телу обладает зрелой иерархическую структуру в сочетании с экспансивной капиллярных кровати, обеспечивая оптимизированную перфузию и переноса питательных веществ одновременно 11. Первоначально сосудистую формы как примитивный сплетении , который реорганизует к иерархически разветвленной сети во время раннего развития 12,13. Хотя многие из сигналов , участвующих в этих процессах хорошо изучены 14 - 16, он остается неуловимым , как такое сосудистая структурирование определяется 15. В свою очередь, обобщал этот процесс в пробирке инженер организованных сосудистых сетей пчелп трудно. Многие из существующих платформ в пробирке для моделирования сосудистой сети , такие как двухмерных культурах эндотелиальных клеток, отсутствие важных характеристик , таких как многоклеточной близость, трехмерной геометрии просвету, потока, и внеклеточного матрикса. Анализы труб формирования в 3D гидрогелей (коллаген или фибрина) 17 - 19 или инвазии анализы 20,21 были использованы для изучения эндотелиальной функции в 3D и их взаимодействия с другими сосудистыми 17,22 или клеток ткани типов 23. Тем не менее, собранные просветы в этих анализах не хватает взаимосвязанности, гемодинамического потока и соответствующую перфузию. Кроме того, склонность к сосудистой регрессии в этих анализах образования 24 трубки предотвращает долгосрочную культуру и созреванию , которая ограничивает степень функциональных исследований , которые могут быть выполнены. Таким образом, существует необходимость в расцветающий инженер платформ в пробирке микрососудистых сетей , которые могут надлежащим образом моделировать анdothelial характеристики и способны долгосрочной культуре.

Разнообразие сосудистых инженерии появились на протяжении многих лет для медицинских применений для замены или выносной пораженных сосудов у пациентов с сосудистыми заболеваниями. Сосуды большого диаметра , изготовленные из синтетических материалов , таких как полиэтилентерефталат (ПЭТ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ) имели значительный терапевтический успех на долгий срок ( в среднем проходимости 95% проходимость более 5 лет) 25. Несмотря на небольшой диаметр синтетических трансплантатов (<6 мм) , как правило , сталкиваются с осложнениями , такие как гиперплазии интимы и тромбопоэза 26 - 28, тканевой инженерии трансплантатов малого диаметра , изготовленные с биологическим материалом достигли значительного прогресса 29,30. Несмотря на успехи такого рода, сконструированные сосуды на микроуровне остались вызов друг другу. Для того, чтобы адекватно смоделировать микрососудов, необходимо создавать сложные сетевые модели с Sufфициент механическую прочность для поддержания проходимость и с композицией матрицы, что позволяет как питательных веществ для проникновения паренхимных клеток и клеточного ремоделирования.

Этот протокол представляет собой новую искусственную perfusable сеть сосудов , которая имитирует уроженца в естественных условиях установки с настраиваемым и управляемым микросреды 31 - 34. Описанный метод генерирует Engineered микрососуды с диаметром порядка 100 мкм. Engineered микрососудов изготавливаются перфузируя эндотелиальные клетки через микрожидком канал, который встроен в мягкого типа I коллагена гидрогель. Эта система имеет способность генерировать узорных сетей с открытой структурой просвету, тиражировать многоклеточных взаимодействий, модулировать внеклеточного матрикса состава, и применять соответствующие физиологически гемодинамические силы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. микротехнологий узорчатых полидиметилсилоксана (PDMS) с Network Design

  1. Вафли Fabrication создать негативный шаблон сетевого дизайна
    1. Создание шаблона сети с помощью любого программного обеспечения проектирования систем автоматизированного (САПР). Убедитесь, что размер по диагонали между входом и выходом соответствует расстояние между входным и выходным резервуаров на кожухе устройства в будущих шагов (см 2.1.1).
      Примечание: Конструкция шаблона сам заказ в зависимости от конкретных исследовательских задач пользователя (см Рисунок 1 Примеры шаблонов).
    2. Создайте маску шаблона сети, используя высокое разрешение печати или заказать хром фотошаблона от коммерческого поставщика. Более подробный протокол процесса фотолитографии доступен в другом месте 35.
    3. Почистите пластины 8 "кремния в течение 5 мин при 100 Вт с плазменной обработкой кислородом.
    4. Налейте достаточно негативного фоторезиста (SU-82,100 хорошо работает) на пластину таким образом, что резист образует с диаметром ложку 2,5 см. Использование спина для нанесения покрытий, спина пластины при 500 оборотах в минуту с 100 оборотов в минуту / с рампой и поддерживать в течение 10 сек. Затем разгоняться до 1600 оборотов в минуту с 300 об / сек и поддерживать в течение 30 сек. Примечание: Скорость и рампы должны быть оптимизированы для каждого лабораторных условиях с получением резиста толщиной 150 мкм.
    5. Софт-испечь пластины при 65 ° С в течение 7 мин, нарастание до 95 ° C при 360 ° С / ч, и поддерживать в течение 45 мин. Медленно остыть до комнатной температуры на горячей плите. Впечатывать образец сосуда на пластину с покрытием под воздействием 365 нм УФ - светом под хромированной фотошаблона, с воздействием раза большую, чем рекомендациями производителя (350 мДж / см 2 для толщины SU-8 составляет около 150 мкм).
      Примечание: Так как SU-8 представляет собой негативный резист, экспонированные участки (все, кроме шаблона проектирования) станет нерастворимым разработчику на этапе 1.1.7.
    6. Hard-печет открытой пластины при температуре 65° С в течение 5 мин и сползать до 95 ° C при 360 ° С / ч и поддерживают в течение 25 мин, а затем позволить ему медленно остыть до комнатной температуры на горячей плите.
    7. Погрузить вафельные в СУ-8 разработчика для 10 - 15 минут, чтобы смыть неэкспонированные сопротивляться, а затем чистым изопропиловым спиртом и сушат при сжатом потоке азота. Проверьте образец под световым микроскопом, чтобы гарантировать, СУ-8 резист хорошо приклеена к пластине (см нежелательного шелушения и пузырьков).
    8. Измерьте толщину особенностей модели с использованием профилометра в соответствии с инструкциями изготовителя 36. Во время измерения приобретения, избегать областей структуры, которые необходимы для функционирования сети (т.е., входной и выходной каналы) в качестве контактного профилометра на основе может поставить под угрозу структурную целостность узорных особенностей на пластине. В качестве альтернативы, использовать бесконтактный метод (т.е. оптический профилометра) , чтобы избежать этой проблемы в целом.
  2. Geузорчатых вознаграждениям и Flat Пресс-формы для формования Коллаген
    Примечание: Ручка силанов в химическом вытяжном шкафу.
    1. Поместите пластину в эксикаторе с помощью 100 мкл трихлор (3,3,3-силана) в течение 2 ч, чтобы silanize поверхность.
    2. Передача силанизированы пластины в 120 х 120 мм квадратный чашку Петри. Налейте смешанный и дегазировали ПДМС эластомер и отвердитель (10: 1 вес / вес соотношение) над пластиной для достижения 4 - 6 мм толщины. Налейте дополнительные PDMS в отдельную 120 х 120 мм квадратный чашку Петри для создания плоских форм без узоров. Застывал при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
    3. Удалите из духовки и дайте ПДМС остыть до комнатной температуры. Используя скальпель тщательно вырезать квадрат вокруг СУ-8 и медленно слезьте плесень PDMS от пластины. Обрезать края до 30 мм х 30 мм. Для плоских форм, вырезать вылечить PDMS без тисненой рисунка на квадратные куски около 40 мм х 40 мм.

2. Устройства для дома

  1. изгоион сверху и снизу Корпус шт
    1. Изготовить корпус судна с использованием поли (метилметакрилата) (ПММА). Для того, чтобы изготовить, заказать детали из стандартного механического цеха с компьютерным числовым программным управлением (ЧПУ) возможности фрезерования. На рисунке 1 представлена ​​схема верхней и нижней части.
    2. Конструкция верхнего корпуса часть (рис 1D) , чтобы включать в себя 20 мм х 20 мм и на нижней стороне устройства с глубиной 1 мм, два порта впрыска коллагена (4 мм) может быть на верхней части устройства расположены по углам квадрата хорошо, два впускных и выпускных резервуаров с диаметром 6 мм и четыре отверстия для винтов (диаметр 3 мм) на четырех углах устройства.
      Примечание: Дополнительные отверстия могут быть просверлены на периферии части для целей обработки.
    3. Конструкция нижнего корпуса часть (рис 1E) , чтобы включить квадратное отверстие в середине (размеры 15 мм х 15 мм) с окружающими размерами 25 мм х 25 ммполки с глубиной 0,25 мм. Просверлите 4 отверстия для винтов с резьбой 4-40. Убедитесь, что резьбовые отверстия в нижней и верхней части будут выровнены друг с другом в ходе будущих этапов сборки.

3. микрососудов Изготовление устройств

  1. Подготовка материалов
    1. Мытье и автоклав два комплекта пинцетом, шпателем из нержавеющей стали, небольшой плоской отвертки, винты из нержавеющей стали, а также несколько штифтов из нержавеющей стали. Для изготовления сосудов, также автоклав micropatterned PDMS формы, PDMS плоские квадраты, покровные стекла (22 х 22 мм) и ватные части.
    2. Стерилизовать ПММА жилищные части в хлорной извести в течение не менее 1 ч, а затем промыть водой автоклавного в капюшоне культуры ткани в два раза, и дайте высохнуть на воздухе в стерильной ткани чашки для культивирования (150 мм х 25 мм).
  2. Стерильный полиэтиленимин-глутаральдегида (PEI - GA) Покрытие
    1. Лечить внутренние колодцы стерилизованных сухих кусков ПММАс плазмой в течение примерно 1 мин. Добавьте 1% полиэтилениминовой (PEI) на внутренние скважины (20 мм квадрат а на верхней и квадратной полке на дне 25 мм) штук ПММА в течение 10 мин. Промыть стерильной H 2 O и дайте высохнуть в капюшоне культуры ткани.
      Примечание: Время, необходимое для плазменной обработки может изменяться в зависимости от используемого устройства, - ИОН должен распространяться легко указывает на гидрофильную поверхность. Если нет, то дополнительная плазменная обработка может быть необходимым.
    2. Применить 0,1% глутаральдегид (GA) на PEI обработанных поверхностей деталей из ПММА в течение 30 мин. Промыть два раза стерильной водой и дайте высохнуть.
      Примечание: В будущих шагов, коллаген будет прилипать к поверхности с покрытием через сшиванию коллагеном глутаровый альдегид. Это помогает обеспечить гель на месте внутри устройства во время будущих этапов сборки и на протяжении всего периода культивирования устройства.
  3. Коллаген гель Приготовление
    1. Изготовить судов, использующих 0,6% - 1% коллагенарешения. Для того, чтобы 0,75% коллагена для изготовления сосудов, смешать тип коллагена маточного раствора (1,5% - изолированные от крысы хвосты 37) с гидроксидом натрия (NaOH), 10x Медиа Дополнение (М199) и среды для культивирования клеток. Держите все решения на льду.
    2. Определить объем коллагена следующим уравнением, где V ƒinal является конечный объем геля требуемого ( как правило, 1 мл коллагена на устройство достаточно), V запас коллагена является объем акций коллагена , необходимого, запас углерода коллаген концентрация фондового коллагена, и с ƒinal коллаген требуемая концентрация коллагена в сосуде.
      figure-protocol-1
    3. С помощью 1 мл шприц для передачи соответствующего объема акций коллагена в новый 30 мл коническую трубку. Определить объемы нейтрализующего NaOH (V NaOH), М199 10x средства массовой добавки(V 10 Х), и среды для культивирования клеток (V 1 Х) следующим образом и смешивать отдельно в 15 мл коническую пробирку:
      figure-protocol-2
    4. Добавляют смесь нейтрализующих реагентов (V 10 X, V NaOH, V 1 Х) к коллагену на аликвоты, и использовать небольшой шпатель , чтобы аккуратно перемешать раствор до тех пор , пока не получат гомогенный гель. Избегайте введения пузырьков, медленно и осторожно перемешивая.
    5. Для того, чтобы включить клеток в матрицу в нужной концентрации (например, 0,5 - 20 миллионов клеток / мл), добавляют клетки раствора коллагена после того, как его смешивают с нейтрализующих реагентов, и продолжают перемешивать до тех пор , пока клетки не будут равномерно распределены.
    6. При добавлении клетки, регулировать громкость среды для культивирования клеток для размещения дополнительного объема, как определено следующим уравнением, где V ячеек </ суб> является требуемый объем суспензии клеток, плотность ƒinal клеток C является желаемой плотности клеток в сосуде, плотность C клеточной суспензии плотность клеток в маточном растворе.
      figure-protocol-3
  4. Коллаген Инъекции - Верхняя часть
    1. Поместите micropatterned PDMS плесень в 100 мм х 20 мм блюдо. PLASMA очистить плесень PDMS в течение 1 мин.
    2. Совместите верхнюю ПММА часть на верхней части формы PDMS так , что квадратные резервуары на форме находятся непосредственно под входным и выходным водохранилищах (рис 1D - пунктирные линии). Поместите нержавеющей стали штифты во впускной и выпускной коллектора отверстия на верхней части ПММА для поддержания свободного доступа из резервуаров к образцу.
    3. С помощью 1 мл шприц для извлечения ~ 0,5 - 0,6 мл коллагена. Убедитесь в том, что никакие пузырьки не остаются в шприце.
    4. Нажмите на лightly с помощью пинцета на верхней части корпуса, чтобы обеспечить заподлицо контакт между верхней частью и пресс-формы PDMS. Вводят коллаген медленно через инжекционное отверстие в верхней части ПММА. Убедитесь, что коллаген заполняет в области 20 мм х 20 мм над рисунком и не просачивается.
    5. Закройте блюдо без толкаются центрирующие штифты и позволяют гель в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин.
  5. Коллаген Инъекции - нижняя часть
    1. Поместите 22 х 22 мм покровным стеклом в центре нижней части. С помощью 1 мл шприц, чтобы равномерно распределить ~ 0,25 мл коллагена на предметное стекло. Осторожно опустите PDMS плоский квадрат над коллагена, обеспечивая PDMS является плоской против ПММА и нет запертых пузыри. Разрешить гель при 37 ° С в течение 30 мин.
  6. Сборка устройства
    1. После желатинизации, добавьте достаточное количество PBS вокруг плоской PDMS части на нижней части, чтобы окружить PDMS (около 1 мл). Используйте пинцет для удаления любого еXcess коллагена вокруг краев, и медленно отделите кусок PDMS. Добавить еще PBS на верхней части коллагена для поддержания гидратации.
    2. Чтобы подготовить верхнюю часть, используйте пинцет, чтобы поднять верхнюю часть ПММА и переверните его таким образом, что плесень PDMS находится на вершине. Добавьте несколько капель PBS на интерфейс, а затем быстро и надежно удалить PDMS формы из верхней части ПММА.
    3. Аккуратно удалите из нержавеющей стали штифты с другой стороны корпуса PMMA, используя другую пару пинцета. Добавьте еще несколько капель PBS на micropatterned коллагена. Переверните верхнюю часть ПММА над тем, что коллаген обращена вниз и поместите 4 винта в угловые отверстия.
    4. Осторожно положите верхнюю часть на верхней части нижней части, совместив винты с угловыми отверстиями на нижней части. Не допускать две части, чтобы скользить по отношению друг к другу. С помощью отвертки затяните винты, используя нежное прикосновение. Не затягивайте.
    5. Аспирация PBS окружающий ПММА поверхности и поместите небольшой пиЕСЕ хлопка под одним краем устройства. С помощью пипетки, удалите PBS из резервуаров и заменить среды для культивирования клеток. Дайте устройство гель вместе в инкубаторе C 37 ° в течение не менее 1 часа.
  7. Cell Посев
    1. Культура Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) в эндотелиальной ростовой среде при температуре 37 ° C (CO 2, O 2) до состояния сплошности 38. Всякий раз, когда это возможно, используйте между проходами 4 и 7.
    2. Trypsinize эндотелиальные клетки путем промывки колбы культуры с 6 мл PBS, а затем добавлением 2 мл 0,05% трипсина при 37 ° С для диссоциации клеток. Оставьте клетки в трипсин, пока большинство из фокальных спаек не обособленным и клетки окружены (обычно это занимает около 2 - 3 мин). Остановить реакцию трипсина путем добавления 4 мл эндотелиальной питательной среды, содержащей фетальной бычьей сыворотки (FBS). Промыть колбу несколько раз средств массовой информации, чтобы обеспечить клетки отделяются от колбы и собираютв конической трубе.
    3. Граф клеток с использованием гемоцитометра и ресуспендируют их при плотности 10 миллионов клеток на мл. Удалить все среды для культивирования клеток из впускных и выпускных коллекторов. С помощью 200 мкл гель-наливного наконечника, добавить 10 мкл суспензии клеток в центре впускного коллектора. Клетки должны начать поступать в сеть немедленно и пальто в сеть.
    4. Добавить 200 мкл среды в равной степени к обоим водохранилищах и пусть клетки прикрепиться и распространяться в сети, по крайней мере, 1 ч.
  8. Культура устройства
    1. Культура устройство с гравитационным приводом потока через сеть путем добавления 200 мкл среды для культивирования клеток к входному отверстию резервуара и 50 мкл к выходному отверстию резервуара. С помощью этого метода культуры, замены среды каждые 12 ч, чтобы поддерживать жизнеспособность эндотелиальную.
      Примечание: Если непрерывный поток условия культивирования желательны (для поддержания постоянного напряжения сдвига, собирать средства массовой информации на выходе и т.д.), SyrИнге насос может быть использован вместо гравитационной приводом культуры.
    2. Разрешить сеяные эндотелиальные клетки по меньшей мере, 24 часа в сутки, чтобы прикрепить и стабилизировать перед нанесением непрерывного потока. Перед установкой непрерывного потока, техническое обслуживание устройств с гравитацией приводом условий потока.
      Примечание: Условия для средств массовой информации прикладного потока отличаются от тяжести приводом культуры. Добавление плазмозаменителя, такие как декстран, в средствах массовой информации стабилизирует сконструированного микрососуды и предотвращает сосудистый коллапс в течение продолжительного перфузии 39.
    3. Для того, чтобы средства массовой информации для установки непрерывного потока, растворите 3,5% декстран (70 кДа) в эндотелиальной питательной среды для оптимальной культуры судна. Использование стерильной техники, заполняют 10 мл шприцы с ростовой средой эндотелиальной с 3,5% декстрана.
    4. Приготовьте стерильную культуры блюдо для потока расплавлением отверстий в боковой стенке чашки Петри с помощью паяльника.
    5. Прикрепите 12 "силиконовую трубку (1/32" ID) в замок сцепления Luer (женский, 1/16 "ID), и 1 /16 "прямой разъем трубки к трубке с 1" сегмент трубки на другом конце. Вставьте 1/4 "20G тупую иглу (отдельно от втулки иглы) к свободному концу 1" сегмента. Кроме того, подготовить "сегмент трубки, присоединенные к 90 ° разъем локтевого сустава трубки к трубке (для установки на входе корпуса). В последующих стадиях, тем длиннее трубка будет продет через подготовленное блюдо и крепится к 3 3 "сегмент через G иглы 20. Выход трубки должны отражать впускной трубопровод, со свободным концом вместо муфты замка Luer. Автоклав все сегменты до использования.
    6. Резьба автоклавного на входе и выходе трубки через отверстия в готовое блюдо. Присоединить 3 "сегменты к внутреннему 20 G иглы. Закрепите муфту блокировки Люэра к мультимедийному заполненный шприц и заливать носитель через трубку с помощью шприца насосного агрегата при высокой скорости потока. Убедитесь в том, что нет никаких пузырей в НКТ или разъемов, так как они будут мешать потоку в емкость.
    7. Вставьте грonnector сустава во входное отверстие корпуса. Установите шприцевой насос до желаемой скорости потока и начать перфузию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть скорректирована в зависимости от геометрии сосуда и экспериментальных условиях приложенных напряжений сдвига. Для канала диаметром 100 мкм, скорость потока 3 мкл / мин работает хорошо.
    8. При желании, собирать перфузат с подготовленной выпускной трубки, вставленной в стерильный 5 мл полистирола с круглым дном пробирку, содержащую 500 мкл среды.
      Примечание: Небольшое количество сред добавляется к коллекторной трубе, чтобы предотвратить образование пузырьков, которые могут блокировать поток.
    9. В зависимости от скорости потока, шприц, возможно, потребуется быть пополнен после того, как от 24 до 36 часов. Это делается путем удаления соединителя от входного отверстия в корпусе, заменив шприц, и медиаданных заливать при высокой скорости потока в течение нескольких минут. Эта последовательность гарантирует, что пузырьки не вводят в трубку. Сброс насоса до требуемой скорости потока для культуры, вставьте разъем в корпуса, ивернуться в инкубатор.

Анализ 4. Устройство

  1. Проницаемость Анализ
    1. Используйте 40 кДа FITC-декстрана , чтобы визуализировать проницаемость сосуда на месте. Поместите корпус судна на конфокальной микроскопии и сосредоточиться на плоскости судна. Добавить 5 мкМ 40 кДа FITC-декстрана на входе и изображения на 4-кратным увеличением, 25 мс времени экспозиции, и на 1 кадра в секунду в течение 10 мин.
    2. Анализ серии изображений с кодом анализа для оценки проницаемости декстрана через стенку сосуда в коллаген (мкм / сек) на основе модели , опубликованной Zheng ЕТ. и др. 31.
  2. Анализ Иммунологическое и конфокальной микроскопии
    1. Для фиксации сосудов, обрызгивать с 3,7% формальдегида через впускное отверстие в течение 20 мин и стирке путем перфузии PBS три раза (20 мин на промывку). Блок неспецифическое связывание антитела с 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5% Тритон Х-100 реrfused через сеть в течение 1 часа. Заливать растворы первичных антител в течение ночи при температуре 4 ° С и мыть три раза PBS. Заливать решения вторичными антителами в течение 1 - 2 ч, и снова промывают PBS таким же образом.
    2. Возьмем иммунофлуоресцентных изображения микрососудов на месте с помощью конфокальной микроскопии с г-шагом 1 мкм. Изображение микрососудов при увеличении 4X, 10X или 20X.
      Примечание: Увеличение 4X обеспечит глобальную информационную сеть структуру, в то время как 10X и 20X увеличенные изображения обеспечит клеточные детали , такие как удлинение, образование соединения и др.
    3. Анализ стеки изображений с помощью ImageJ с Z проекций (Image / Стеки / Z-проекта), сечений (Image / Стеки / мультиплексирование с ортогональным взгляд), и 3D-реконструкций (Image / Стеки / 3D Project).
  3. Сканирующей электронной микроскопии изображений
    1. Для анализа электронной микроскопии, зафиксировать на месте путем перфузируя вполсилы золь Карновскому всоциологическое загрязнение (2% параформальдегид / 2,5% глутаральдегида в 0,2 М какодилатном буфере) в течение ночи. Разберите сосуд и осторожно отделить две части. Обрезка кромок и полностью погружать в Фиксирующий раствор в течение нескольких дней.
    2. Опустить толстую верхнюю часть сосуда в 25% глутаральдегида в течение 20 мин и полоскать три раза PBS (2 мин каждый). Высушить в серийных этанол промывками 50%, 70%, 85% (2 мин каждый) и две отмывки в 100% этаноле (5 мин каждый раз).
    3. Подготовьте образец для анализа с последующим обезвоживанием критической точки сушки в соответствии с протоколом производителя 40. Sputter пальто судно с золотом-палладием (7 нм) и анализируют под сканирующим электронным микроскопом с ускоряющим напряжением 5 кВ, размер пятна 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Инженерных платформа судно создает функциональный микроциркуляторного русла , внедренного в естественной коллагена типа I матрица и допускает жесткий контроль клеточного, биофизических и биохимических среды в пробирке. Для изготовления спроектированных микрососудов, Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) перфузируют через коллагеном встроенный микрожидком сети, где они придают сформировать патентные люмена и сливающийся эндотелий. Как показано на фиг.1А-C,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Engineered микрососудов являются моделью в пробирке , где физиологические характеристики , такие как геометрия просвету, гидродинамические силы и многоклеточных взаимодействий присутствуют и перестраиваемой. Этот тип платформы является мощным в том , что она дает возможность моделировать и изучать эндотелиальной поведение в различных контекстах , где в пробирке условия культивирования могут быть сопоставлены , что микроокружения в вопросе. Например, механизмы , движущие эндотелиальные процессы, такие к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Линн и Майк Гарви визуализации лаборатории в Институте стволовых клеток и регенеративной медицины, а также Вашингтон Nanofabrication фонда в Университете штата Вашингтон. Они также признают финансовую поддержку Национального института здравоохранения предоставляет DP2DK102258 (к YZ), а также обучение предоставляет T32EB001650 (к ССК и САХ) и T32HL007312 (к САХ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma SystemAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc Машина для нанесения покрытий PWM32 
ABM Контактный выравнивательAB-M
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 ПроявительMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" кремниевая пластинаWafer World Inc.
Настольный микрогенератор шаблоновHeidelberg Instrumentsμ PG 101Для создания фотошаблона
Нагревательная пластинаVWR97042-646
Спирт изпропиловыйAvantor Эксплуатационные материалы9088
Чашки Петри (120 x 120 мм, квадрат)Сигма-ОлдричZ617679
Трихлор(3,3,3-трифторпропил)силанСигма-ОлдричMKBG3805V
Полидиметилсилоксан (PDMS) эластомерная основа и отвердительDow CorningSylgard 184Смешанный в соотношении 10:1 (с / весом)
Вакуумный эксикаторSigma-AldrichZ119024-1EA
OvenVWR9120976
Device Fabrication and Culture
poly(метилметакрилат) (ПММА)Plexiglas
Corona TreaterЭлектро-Техник Продактс, Инк.BD-20Ручной прибор для плазменной обработки аппаратов ПММА и пресс-форм PDMS
ПаяльникWeller WTCPS
Ферменная головка из нержавеющей стали Шуруп со шлицемMcMaster-Carr 91785A096
Установочные штифты из нержавеющей сталиMcMaster-Carr 93600A060
Пинцет Miltex24-572Можно использовать любой подобный пинцет
Шпатель (микроложка)Услуги электронной микроскопии62410-01
ОтверткаМожно использовать любую плоскую отвертку, автоклавную
Стеклянные покровные стекла (22 x 22 мм)Fisher Scientific12-542B
ОтбеливательClorox4460030966
чашки Петри (150 x 25 мм)Corning430599
чашки Петри (100 x 20 мм)Corning2909
Хлопок, разрезанный на кусочки 1 см х 3 смАвтоклавированный
полиэтиленимин (PEI)Sigma-AldrichP3143Развести до 1% в воде для клеточной культуры
ГлутаральдегидSigma-AldrichG6257Развести до 0,1% в воде
для клеточной культурыСтерильный H2OAutoclaved DI H2O
Тип I коллаген, растворенный в 0,1% уксусной кислотеВыделен из хвостов крыс, как описано в Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 мл шприцBD309659
10 мл шприцBD309604
15 мл конические трубкиCorning352097
30 мл конические тубыCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 Н NaOH (стерильный)Sigma-Aldrich415413Разбавить до 1 Н в воде для клеточных культур
HUVECsLonza Эндотелиальные
CC-3124
TrypsinCorning25-052-CI
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Декстран из Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
фосфатно-солевой буфер (PBS)Гемоцитометр Corning21-031-CV
Hausser Scientific Co.3200
Гелевые насадкиVWR37001-152
18 G Игла для тупого заполненияBD 305180
20 г Игла дозирующая из нержавеющей сталиMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32" OD Силиконовая трубкаCole-ParmerEW-95702-00
1/16" Труба-трубка муфтаMcMaster-Carr5116K165
90° Коннекторы локтя, трубка-трубкаMcMaster-Carr5121K901
Муфта с замком Люэра (женская, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Пластиковые щипцы, с захватами для челюстейУслуги электронной микроскопии72971
Двойной шприцевой насосГарвардский аппарат70-4505
5 мл Полистироловая трубка с круглым дномFisher Scientific14-959-2A
<Стронг>Прибор Анализ
формальдегидSigma-AldrichF8775
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA8806-5G Triton
X-100Sigma-AldrichT-9284
Кролик анти-hCD31Abcamab324571:25 рабочее разведение
FITC конъюгированное анти-фон Виллебранд Фактор антителоAbcamab88221:100 рабочее разведение
Козий анти-кролик 568 вторичное антителоThermofisher ScientificA-110111:100 рабочее разведение
HoeschtThermofisher ScientificH1399Ресуспендировано в ДМСО
Какодилат натрия Sigma-AldrichC0250Для изготовления 0,2 М какодилатного буфера
ЭтанолVWR InternationalBDH1164-4LP
40 кДа ФИТК-сопряженный ДекстранSigma-AldrichFD40S 
<сильные>дополнительные реагенты для культур 
CHIR-99021Selleck ChemS2924Низкомолекулярный ингибитор GSK-3
Человеческий рекомбинантный VEGFPeprotech100-20
Человеческий рекомбинантный bFGFPeprotechAF-100-18B
питательные среды Lonza

Ссылки

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858(2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Micropatterning и сборка 3D микрососудов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.