Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

Цитоплазматическая микроинъекции 1-клеточных эмбрионов является очень мощной техникой. Он может быть использован для доставки любого раствора в эмбрион, чтобы, например, производят генных нокаутов для изучения функции генов или для создания генных отредактированный животных. Большинство сельскохозяйственно-зиготы соответствующих сельскохозяйственных животных имеют состав , очень высокую жирных кислот , что делает их цитоплазме непрозрачными и темные ^1. Кроме того, они имеют достаточно эластичную мембрану плазмы (ПМ). Эти характеристики делают микроинъекции с использованием обычных пронуклеусов / цитоплазматической инъекции, используемый в сложных видов грызунов и часто неточны.

Цитоплазматических микроинъекции имеет преимущества по сравнению с пронуклеарной микроинъекции так как легче выполнить , а также вызывает меньше повреждений инжектированных эмбрионов, что приводит к повышению жизнеспособности ^2. Общей целью данного протокола является демонстрация успешного способа доставки решений в цитоплазму зиготы сельскохозяйственных животных. Для того, чтобы быть в состоянии выполнитьцитоплазматический микроинъекции с высокой эффективностью на эмбрионов скота, лазер используется для создания отверстия в пеллюцида (ZP), а затем стакан игла с тупым концом используется для микроинъекции. Эта стратегия направлена ​​на снижение механических повреждений отпечатаны на эмбрион во время инъекции. Затем, стремление цитоплазматического содержимого внутри инъекционной иглы позволяет эффективно и уверенно поломку ПМ, удерживающее раствор подается в цитоплазму зародыша.

Эта методика уже успешно используется в эмбрионы крупного рогатого скота для доставки миРНК в зиготического цитоплазме ^3,4 и генерировать мутации , используя кластерные регулярно interspaced короткие палиндромных повторы (CRISPR) CRISPR ассоциированной системы / 9 Система ⁵ (cas9). Он также подходит (с незначительными изменениями) , чтобы придать бычьи кучевые огороженный ооциты ^6. Здесь мы описываем наш протокол инъекции поставляя краситель, который может быть применим к любой инъекции DESIRED раствор в зиготу, и показать, что с помощью этой техники вызывает минимальное лизис и не влияет на раннее развитие эмбриона.

Protocol

1. Производство Микропипетки Инъекции микропипетка Поместите боросиликатного стеклянный капилляр (наружный диаметр (OD): 1,0 мм, внутренний диаметр (ID): 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его. С помощью соответствующей программы, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким кончиком с длинной конусность. (Пример: Тепло: 825; Вытащите: 30; Скорость: 120; Время: 200; Давление: 500). Осторожно удалите растянутой пипетки из устройства и поместите его на microforge в горизонтальном положении. Доведите притянутое пипетку и нагреватель нити microforge с его стеклянными шариками в фокусе. Используйте окуляр визира для измерения желаемой толщины и переместите пипетку горизонтально, пока нить нагреватель не достигнет цели (внутренний диаметр 5 мкм). Отрегулировать высокую температуру до приблизительно 45% и аккуратно довести пипеткой вниз таким образом это касается нити. Включите нагреватель на короткое время. Это жбольной слегка растопить пипетку так что прилипает к нити, и при охлаждении, пипетка будет перерыв в точке контакта, генерирующего прямой разрез. Примечание: Установка нужной температуры является ключевым фактором на этом этапе , так как температура слишком высока сделает пипеток изгиб и , таким образом, прямой срез не будет и температура слишком низкая , не будет достаточно , чтобы расплавить пипетка (рис 1А). Сделать приблизительный 30 ° угол вблизи кончика пипетки, поместив его около 10 мкм от нити накала нагревателя. Установите температуру до 60% и активировать нагреватель. Примечание: Это будет изгибаться пипетку над нитью. Этот угол желательно таким образом, кончик иглы параллельно поверхности инжекционного пластины при установке в инъектор (Фиг.1В). Ручка микроинъекции пипетки с осторожностью , так как они очень острые и хрупкие. Проведение микропипетка Поместите borosilicсъел стеклянный капилляр (OD: 1,0 мм, ID: 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его. Используйте соответствующую программу, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким наконечником с длинным даже сужаются и параллельные стенки (Пример: Heat: 815; Вытащите: 20; Скорость: 140; Время: 175; Давление: 200). Осторожно удалите вытащил пипетку из съемника устройства и поместите его на держателе microforge в горизонтальном положении. Отрегулируйте фокус на нити нагревателя и пипеткой. Используйте окуляр визира для измерения диаметра пипетки и перемещать пипетку, пока его диаметр по нити достигает 180 мкм. В указанном размере, отметьте стеклянный капилляр с наконечником пера алмазов, а затем аккуратно нажмите на выдвинутом наконечник, чтобы разбить стекло. Это должно привести к прямой разрез (рис 1C). Перемещение пипетку в вертикальном положении с ее наконечником близко к нити. Установите температуру от microforge до 60%. Противопожарные польский кончик пипетки с использованием стандартных методик 7 до тех пор , пока не достигнет идентификатора 40 мкм. Используйте окуляр визира , чтобы проверить идентификатор (Рисунок 1D). Сделайте угол на пипетку. Доведите пипетку обратно в горизонтальное положение около 10 мкм от нити и на 5 мм от его кончика. Установите температуру до приблизительно 60% и активировать нагреватель, чтобы согнуть пипетку над нитью. Продолжайте нагревание до тех пор , требуемый угол (около 30 °) не будет достигнута. Проверьте угол визуально (рис 1E). Примечание: Пипетка обычно устанавливается на microinjector приблизительно под углом от 60 ° по отношению к нижней части инъекционного тарелки. Кончик пипетки согнута таким образом, что параллельно нижней части блюда, которое необходимо для правильного введения эмбриона в ее средней плоскости. ле "> 2. Установка Микроманипулятор Убедитесь, что microinjectors полностью загружены с маслом, и что нет пузырьков воздуха в системе (пузырьки в microinjector предотвратить точный контроль впрыска). Убедитесь, что микроманипуляторы находятся в центральном положении. Это позволит для широкого диапазона движения пипеток. Вставьте холдинг пипетки в держатель левого микроманипулятора и инъекционный Налить в правообладателю Микроманипуляция. Дать маслу входить в пипеток капиллярного и убедитесь, что система работает должным образом, перемещая масло вверх и вниз внутри пипетки с помощью элементов управления microinjector. Примечание: Если нет движения нефти внутри игл, может быть забивают. В этом случае рекомендуется использовать новую иглу. С помощью элементов управления Микроманипулятор принести пипеток в центр поля микроскопа зрения. Использование 4X увеличение, убедитесь, что кончики микропипетка находятся в правильном угле (рarallel на дно тарелки). Примечание: Правильная установка игл является ключом для успешной инъекции и для обеспечения согласованности результатов. Калибровка системы лазерной калибровки следующей инструкцией изготовителя. 3. Подготовка инъекций блюдо (рисунок 2) Поместите каплю 50 мкл подогретой (37 ° C) SOF-HEPES (композиции, описанные в разделе материалы), дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в центре крышки 100-мм чашках Петри. Поместите 1 – 2 мкл капли раствора для инъекций близко к падению впрыска. Убедитесь в том, что эмбрионы не охладить до температуры ниже комнатной температуры. Примечание: В этом протоколе мы добавим декстранфосфатные-красный краситель в раствор для инъекций, чтобы иметь возможность визуализировать места введения и отслеживать его позже. Накройте капель в инъекционной пластины использованием около 10 мл минерального масла. Поместите инъекции блюдо на стадии инвертированного микроскопа и довести пипEttes в каплю инъекции. Проверьте, что иглы находятся в фокусе внутри капли. Отрегулируйте их высоту по мере необходимости с помощью элементов управления Микроманипулятор. Использование microdispenser, загружаем около 20 – 30 зиготы (17 – 20 ч после оплодотворения (HPF)) в верхней части капли впрыска. Выполнение инъекции при комнатной температуре таким образом, количество эмбрионов в капле впрыска определяется скоростью, при которой человек может впрыскивать их. Не загружайте больше эмбрионов, чем те, которые могут быть введены в течение 30 мин. Для загрузки эмбрионов в в microdispenser, нажмите на поршень полностью и погрузить кончик в раствор, содержащий зародыши. Прикоснитесь к эмбрионы быть подобран с наконечником стеклянного капилляра (по одному в то время) и медленно отпустите поршень, так что каждый эмбрион входит в капилляр. Повторите эту процедуру, пока все эмбрионы подбирают или емкость microdispenser полна. Чтобы освободить загруженные эмбрионов, не нажимайте на поршень аккуратно, пока весь объем сотрудничестваntaining эмбрионов высвобождается из капилляра. 4. Микроинъекция Использование цели 4X, загрузите решение для введения в инъекционной пипетки путем применения отрицательного давления (аспирационной). Загрузите достаточное количество раствора, чтобы впрыснуть 2 – 3 зиготы. Затем переходите к падению впрыска. В капле впрыска, переместите холдинг пипетки таким образом наконечник приближается к зиготы. Применить отрицательное давление (с) аспирации удерживающей microinjector так зигота фиксируется к удерживающей пипеткой и изменения к цели 20Х. После того, как зигота прикрепляется к удерживающей пипеткой, проверить его качество с помощью инъекционного пипетки, чтобы аккуратно двигаться эмбрион вокруг, не снимая его. Хорошее качество зиготы должны иметь два полярных тела (хотя иногда только один виден) и однородная цитоплазма. Не вводить ненормальные зиготы (рис 3А). При необходимости, изменить положение эмбриона для надлежащей инъекцииместо нахождения. Хорошее позиционирование было бы, что, в которых есть некоторое пространство между ЗП и ПМ, так что ПМ не повреждаются лазером. Убедитесь, что инъекции пипетка расположена на средней плоскости эмбриона, осторожно касаясь зиготу на месте инъекции. Если это не на его серединной плоскости, игла будет иметь тенденцию сделать зародыш вращаться вместо пункции. Высоту инъекционной пипеткой по мере необходимости. Сделайте отверстие в ЗП с помощью лазера (рис 3B). Использование лазера программного обеспечения место лазер прицельной метки в ЗП, где будет производиться отверстие (на стороне, противоположной стороне, когда эмбрион прикрепляется к удерживающей пипеткой). С помощью лазерного управления окна нажмите на кнопку огня. Убедитесь в том, что размер отверстия достаточно большой, чтобы создать отверстие в ЗП для иглы, чтобы пройти через без повреждения ПМ (пример: 0,662 мс Ширина импульса / Размер отверстия 6,9 мкм). Пропускают инъекционной иглойчерез отверстие в ЗП и вступить в контакт с ПМ. Продолжить нажатием пипетку вперед , пока игла не три четверти пути в эмбрионе (рис 3C). Обратите внимание на положение мениска в раствор нефтяного интерфазе, так как это будет использоваться, чтобы постоянно контролировать объем впрыска. Применить отрицательное давление () на аспирации инъекционной пипеткой, что приведет к ПМ и цитоплазма быть набраны в инъекционной иглы. Продолжайте, пока движение цитоплазмы в иглу не ускоряется или когда содержание цитоплазма смешиваясь с инъекционного раствора можно увидеть. Это будет означать разрушение ПМ (рис 3D). Вводят назад цитоплазматический содержание с последующим решением в цитоплазму зиготы путем применения положительного давления (инъекционный), пока мениск в раствор масла интерфазе не продвинулась эквивалентный диаметр одной зиготы в прошлом отправной точкой. Примечание: В наших условиях это представисентов приблизительно 7 мкл введенного раствора (рис 3Е). Изменение к цели 4X и переместить впрыскиваемого эмбриона / с до нижней части капли впрыска. Выпуск эмбриона путем применения положительного давления на удерживающей microinjector. Держите неинъекционные эмбрионов на верхней стороне и инъекционные из них на нижней стороне капли, чтобы помочь отслеживать инжектированных / не впрыскивается эмбрионов и эффективно работать. 5. Эмбрион восстановления и нагнетательных Результаты Сделайте 3 капли приблизительно 200 мкл в новое блюдо с предварительно подогретой SOF-HEPES. Сбор инъецированные эмбрионы, используя microdispenser (как описано выше). Вымойте инъекционные эмбрионов путем перемещения их через 3 SOF-HEPES капель. Количество эмбрионов лизированных во время микроинъекции и выбросить их. Примечание: лизируют зигота может быть легко отличить от неповрежденной один, так как первый появляется полупрозрачный, заполнить всю З.П., и она обычно имеет цитоплазматическиеутечку наружу зародыша содержание. При желании, проверить эффективность микроинъекции с помощью флуоресцентного микроскопа. Имейте в виду, что УФ воздействие света может вызвать повреждение эмбриона, которые могут повлиять на последующее развитие. Культура группы 25 инъецированных эмбрионов в 50 мкл капель оптимизации симплекс калия среды (КСОМ) , дополненной 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соответствии с минеральным маслом при 38,5 ° С в атмосфере 5% СО 2 в воздухе, и влажность до насыщения. Дополнение к культуральной среды с 5% FBS через два дня после инъекции. Проверьте БЛАСТОЦИСТНОЙ (BL) ставки 7 дней после инъекции. Рассчитать BL цены как общее число бластоцисты эмбрионов / общее количество эмбрионов, культивируемых в этой капле.

Representative Results

Лазерная помощь цитоплазматический микроинъекции является мощным и надежным протоколом для доставки решений в цитоплазму зиготы скота. На рисунке 3 показан общий контур зиготы до и после инъекции, а также общий контур техники. Декстран-красный используется …

Discussion

Микроинъекция зигот является хорошо установленный способ введения растворов в эмбрионов млекопитающих. С некоторыми вариациями в зависимости от вида и цели эксперимента, этот метод может быть использован в широком смысле. Мы покажем, как выполнить интрацитоплазматическую микроинъе?…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.