Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Помощью лазера цитоплазматических микроинъекции в животноводстве зиготы

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54465

⸱

5 октября 2016 г.

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол показывает, как выполнять цитоплазматическую микроинъекцию в зиготы сельскохозяйственных животных. Этот метод может быть использован для доставки любого раствора в одноклеточный эмбрион, например, инструменты редактирования генома для создания нокаутирующих животных.

Аннотация

Цитоплазматическая микроинъекция в одноклеточные эмбрионы является очень мощным методом. Например, это позволяет использовать инструменты редактирования генома, которые могут создавать генетические модификации, которые будут присутствовать в каждой клетке взрослого организма. Он также может быть использован для доставки миРНК, мРНК или блокирующих антител для изучения функции генов в преимплантационных эмбрионах. Традиционная техника микроинъекций эмбрионов, используемая у грызунов, состоит из очень тонкой микропипетки, которая непосредственно проникает в плазматическую мембрану при продвижении внутрь эмбриона. Когда этот метод применяется к домашним животным, это обычно приводит к низкой эффективности. В основном это связано с тем, что в отличие от мышей и крыс, зиготы крупного рогатого скота, овцы и свиньи имеют очень темную цитоплазму и высокоэластичную плазматическую мембрану, что затрудняет визуализацию во время инъекции и проникновения в плазматическую мембрану. В этом протоколе мы описываем подходящий метод микроинъекций для доставки растворов в цитоплазму зигот крупного рогатого скота, который оказался успешным также для эмбрионов овец и свиней. Во-первых, лазер используется для создания отверстия в пеллюцидной зоне. Затем через отверстие вводится стеклянная микропипетка с тупым концом и продвигается вперед до тех пор, пока кончик иглы не достигнет примерно 3/4 в зародыше. Затем плазматическая мембрана разрывается путем аспирации цитоплазматического содержимого внутрь иглы. Наконец, аспирированное цитоплазматическое содержимое с последующим вводом интересующего раствора вводится обратно в эмбриональную цитоплазму. Этот протокол успешно используется для введения различных растворов в зиготы крупного рогатого скота и овцы со 100% эффективностью, минимальным лизисом и нормальной скоростью развития бластоцист.

Введение

Цитоплазматическая микроинъекции 1-клеточных эмбрионов является очень мощной техникой. Он может быть использован для доставки любого раствора в эмбрион, чтобы, например, производят генных нокаутов для изучения функции генов или для создания генных отредактированный животных. Большинство сельскохозяйственно-зиготы соответствующих сельскохозяйственных животных имеют состав , очень высокую жирных кислот , что делает их цитоплазме непрозрачными и темные 1. Кроме того, они имеют достаточно эластичную мембрану плазмы (ПМ). Эти характеристики делают микроинъекции с использованием обычных пронуклеусов / цитоплазматической инъекции, используемый в сложных видов грызунов и часто неточны.

Цитоплазматических микроинъекции имеет преимущества по сравнению с пронуклеарной микроинъекции так как легче выполнить , а также вызывает меньше повреждений инжектированных эмбрионов, что приводит к повышению жизнеспособности 2. Общей целью данного протокола является демонстрация успешного способа доставки решений в цитоплазму зиготы сельскохозяйственных животных. Для того, чтобы быть в состоянии выполнитьцитоплазматический микроинъекции с высокой эффективностью на эмбрионов скота, лазер используется для создания отверстия в пеллюцида (ZP), а затем стакан игла с тупым концом используется для микроинъекции. Эта стратегия направлена ​​на снижение механических повреждений отпечатаны на эмбрион во время инъекции. Затем, стремление цитоплазматического содержимого внутри инъекционной иглы позволяет эффективно и уверенно поломку ПМ, удерживающее раствор подается в цитоплазму зародыша.

Эта методика уже успешно используется в эмбрионы крупного рогатого скота для доставки миРНК в зиготического цитоплазме 3,4 и генерировать мутации , используя кластерные регулярно interspaced короткие палиндромных повторы (CRISPR) CRISPR ассоциированной системы / 9 Система 5 (cas9). Он также подходит (с незначительными изменениями) , чтобы придать бычьи кучевые огороженный ооциты 6. Здесь мы описываем наш протокол инъекции поставляя краситель, который может быть применим к любой инъекции DESIRED раствор в зиготу, и показать, что с помощью этой техники вызывает минимальное лизис и не влияет на раннее развитие эмбриона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Производство Микропипетки

  1. Инъекции микропипетка
    1. Поместите боросиликатного стеклянный капилляр (наружный диаметр (OD): 1,0 мм, внутренний диаметр (ID): 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его.
    2. С помощью соответствующей программы, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким кончиком с длинной конусность. (Пример: Тепло: 825; Вытащите: 30; Скорость: 120; Время: 200; Давление: 500).
    3. Осторожно удалите растянутой пипетки из устройства и поместите его на microforge в горизонтальном положении.
    4. Доведите притянутое пипетку и нагреватель нити microforge с его стеклянными шариками в фокусе. Используйте окуляр визира для измерения желаемой толщины и переместите пипетку горизонтально, пока нить нагреватель не достигнет цели (внутренний диаметр 5 мкм).
    5. Отрегулировать высокую температуру до приблизительно 45% и аккуратно довести пипеткой вниз таким образом это касается нити. Включите нагреватель на короткое время. Это жбольной слегка растопить пипетку так что прилипает к нити, и при охлаждении, пипетка будет перерыв в точке контакта, генерирующего прямой разрез.
      Примечание: Установка нужной температуры является ключевым фактором на этом этапе , так как температура слишком высока сделает пипеток изгиб и , таким образом, прямой срез не будет и температура слишком низкая , не будет достаточно , чтобы расплавить пипетка (рис 1А).
    6. Сделать приблизительный 30 ° угол вблизи кончика пипетки, поместив его около 10 мкм от нити накала нагревателя. Установите температуру до 60% и активировать нагреватель.
      Примечание: Это будет изгибаться пипетку над нитью. Этот угол желательно таким образом, кончик иглы параллельно поверхности инжекционного пластины при установке в инъектор (Фиг.1В).
    7. Ручка микроинъекции пипетки с осторожностью , так как они очень острые и хрупкие.
  2. Проведение микропипетка
    1. Поместите borosilicсъел стеклянный капилляр (OD: 1,0 мм, ID: 0,75 мм) в микропипетки съемник (в центре держателей правый и левый капиллярных) и зафиксировать его.
    2. Используйте соответствующую программу, чтобы вытащить стеклянный капилляр, так что приводит к тонким наконечником с длинным даже сужаются и параллельные стенки (Пример: Heat: 815; Вытащите: 20; Скорость: 140; Время: 175; Давление: 200).
    3. Осторожно удалите вытащил пипетку из съемника устройства и поместите его на держателе microforge в горизонтальном положении. Отрегулируйте фокус на нити нагревателя и пипеткой.
    4. Используйте окуляр визира для измерения диаметра пипетки и перемещать пипетку, пока его диаметр по нити достигает 180 мкм.
    5. В указанном размере, отметьте стеклянный капилляр с наконечником пера алмазов, а затем аккуратно нажмите на выдвинутом наконечник, чтобы разбить стекло. Это должно привести к прямой разрез (рис 1C).
    6. Перемещение пипетку в вертикальном положении с ее наконечником близко к нити. Установите температуру от microforge до 60%.
    7. Противопожарные польский кончик пипетки с использованием стандартных методик 7 до тех пор , пока не достигнет идентификатора 40 мкм. Используйте окуляр визира , чтобы проверить идентификатор (Рисунок 1D).
    8. Сделайте угол на пипетку.
      1. Доведите пипетку обратно в горизонтальное положение около 10 мкм от нити и на 5 мм от его кончика. Установите температуру до приблизительно 60% и активировать нагреватель, чтобы согнуть пипетку над нитью. Продолжайте нагревание до тех пор , требуемый угол (около 30 °) не будет достигнута. Проверьте угол визуально (рис 1E).
        Примечание: Пипетка обычно устанавливается на microinjector приблизительно под углом от 60 ° по отношению к нижней части инъекционного тарелки. Кончик пипетки согнута таким образом, что параллельно нижней части блюда, которое необходимо для правильного введения эмбриона в ее средней плоскости.
ле "> 2. Установка Микроманипулятор

  1. Убедитесь, что microinjectors полностью загружены с маслом, и что нет пузырьков воздуха в системе (пузырьки в microinjector предотвратить точный контроль впрыска).
  2. Убедитесь, что микроманипуляторы находятся в центральном положении. Это позволит для широкого диапазона движения пипеток.
  3. Вставьте холдинг пипетки в держатель левого микроманипулятора и инъекционный Налить в правообладателю Микроманипуляция.
  4. Дать маслу входить в пипеток капиллярного и убедитесь, что система работает должным образом, перемещая масло вверх и вниз внутри пипетки с помощью элементов управления microinjector.
    Примечание: Если нет движения нефти внутри игл, может быть забивают. В этом случае рекомендуется использовать новую иглу.
  5. С помощью элементов управления Микроманипулятор принести пипеток в центр поля микроскопа зрения. Использование 4X увеличение, убедитесь, что кончики микропипетка находятся в правильном угле (рarallel на дно тарелки).
    Примечание: Правильная установка игл является ключом для успешной инъекции и для обеспечения согласованности результатов.
  6. Калибровка системы лазерной калибровки следующей инструкцией изготовителя.

3. Подготовка инъекций блюдо (рисунок 2)

  1. Поместите каплю 50 мкл подогретой (37 ° C) SOF-HEPES (композиции, описанные в разделе материалы), дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в центре крышки 100-мм чашках Петри. Поместите 1 - 2 мкл капли раствора для инъекций близко к падению впрыска. Убедитесь в том, что эмбрионы не охладить до температуры ниже комнатной температуры.
    Примечание: В этом протоколе мы добавим декстранфосфатные-красный краситель в раствор для инъекций, чтобы иметь возможность визуализировать места введения и отслеживать его позже.
  2. Накройте капель в инъекционной пластины использованием около 10 мл минерального масла.
  3. Поместите инъекции блюдо на стадии инвертированного микроскопа и довести пипEttes в каплю инъекции. Проверьте, что иглы находятся в фокусе внутри капли. Отрегулируйте их высоту по мере необходимости с помощью элементов управления Микроманипулятор.
  4. Использование microdispenser, загружаем около 20 - 30 зиготы (17 - 20 ч после оплодотворения (HPF)) в верхней части капли впрыска. Выполнение инъекции при комнатной температуре таким образом, количество эмбрионов в капле впрыска определяется скоростью, при которой человек может впрыскивать их. Не загружайте больше эмбрионов, чем те, которые могут быть введены в течение 30 мин.
    1. Для загрузки эмбрионов в в microdispenser, нажмите на поршень полностью и погрузить кончик в раствор, содержащий зародыши. Прикоснитесь к эмбрионы быть подобран с наконечником стеклянного капилляра (по одному в то время) и медленно отпустите поршень, так что каждый эмбрион входит в капилляр. Повторите эту процедуру, пока все эмбрионы подбирают или емкость microdispenser полна.
    2. Чтобы освободить загруженные эмбрионов, не нажимайте на поршень аккуратно, пока весь объем сотрудничестваntaining эмбрионов высвобождается из капилляра.

4. Микроинъекция

  1. Использование цели 4X, загрузите решение для введения в инъекционной пипетки путем применения отрицательного давления (аспирационной). Загрузите достаточное количество раствора, чтобы впрыснуть 2 - 3 зиготы. Затем переходите к падению впрыска.
  2. В капле впрыска, переместите холдинг пипетки таким образом наконечник приближается к зиготы. Применить отрицательное давление (с) аспирации удерживающей microinjector так зигота фиксируется к удерживающей пипеткой и изменения к цели 20Х.
  3. После того, как зигота прикрепляется к удерживающей пипеткой, проверить его качество с помощью инъекционного пипетки, чтобы аккуратно двигаться эмбрион вокруг, не снимая его. Хорошее качество зиготы должны иметь два полярных тела (хотя иногда только один виден) и однородная цитоплазма. Не вводить ненормальные зиготы (рис 3А).
  4. При необходимости, изменить положение эмбриона для надлежащей инъекцииместо нахождения. Хорошее позиционирование было бы, что, в которых есть некоторое пространство между ЗП и ПМ, так что ПМ не повреждаются лазером.
  5. Убедитесь, что инъекции пипетка расположена на средней плоскости эмбриона, осторожно касаясь зиготу на месте инъекции. Если это не на его серединной плоскости, игла будет иметь тенденцию сделать зародыш вращаться вместо пункции. Высоту инъекционной пипеткой по мере необходимости.
  6. Сделайте отверстие в ЗП с помощью лазера (рис 3B).
    1. Использование лазера программного обеспечения место лазер прицельной метки в ЗП, где будет производиться отверстие (на стороне, противоположной стороне, когда эмбрион прикрепляется к удерживающей пипеткой). С помощью лазерного управления окна нажмите на кнопку огня. Убедитесь в том, что размер отверстия достаточно большой, чтобы создать отверстие в ЗП для иглы, чтобы пройти через без повреждения ПМ (пример: 0,662 мс Ширина импульса / Размер отверстия 6,9 мкм).
  7. Пропускают инъекционной иглойчерез отверстие в ЗП и вступить в контакт с ПМ. Продолжить нажатием пипетку вперед , пока игла не три четверти пути в эмбрионе (рис 3C).
  8. Обратите внимание на положение мениска в раствор нефтяного интерфазе, так как это будет использоваться, чтобы постоянно контролировать объем впрыска.
  9. Применить отрицательное давление () на аспирации инъекционной пипеткой, что приведет к ПМ и цитоплазма быть набраны в инъекционной иглы. Продолжайте, пока движение цитоплазмы в иглу не ускоряется или когда содержание цитоплазма смешиваясь с инъекционного раствора можно увидеть. Это будет означать разрушение ПМ (рис 3D).
  10. Вводят назад цитоплазматический содержание с последующим решением в цитоплазму зиготы путем применения положительного давления (инъекционный), пока мениск в раствор масла интерфазе не продвинулась эквивалентный диаметр одной зиготы в прошлом отправной точкой.
    Примечание: В наших условиях это представисентов приблизительно 7 мкл введенного раствора (рис 3Е).
  11. Изменение к цели 4X и переместить впрыскиваемого эмбриона / с до нижней части капли впрыска. Выпуск эмбриона путем применения положительного давления на удерживающей microinjector. Держите неинъекционные эмбрионов на верхней стороне и инъекционные из них на нижней стороне капли, чтобы помочь отслеживать инжектированных / не впрыскивается эмбрионов и эффективно работать.

5. Эмбрион восстановления и нагнетательных Результаты

  1. Сделайте 3 капли приблизительно 200 мкл в новое блюдо с предварительно подогретой SOF-HEPES. Сбор инъецированные эмбрионы, используя microdispenser (как описано выше). Вымойте инъекционные эмбрионов путем перемещения их через 3 SOF-HEPES капель.
  2. Количество эмбрионов лизированных во время микроинъекции и выбросить их.
    Примечание: лизируют зигота может быть легко отличить от неповрежденной один, так как первый появляется полупрозрачный, заполнить всю З.П., и она обычно имеет цитоплазматическиеутечку наружу зародыша содержание.
  3. При желании, проверить эффективность микроинъекции с помощью флуоресцентного микроскопа. Имейте в виду, что УФ воздействие света может вызвать повреждение эмбриона, которые могут повлиять на последующее развитие.
  4. Культура группы 25 инъецированных эмбрионов в 50 мкл капель оптимизации симплекс калия среды (КСОМ) , дополненной 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соответствии с минеральным маслом при 38,5 ° С в атмосфере 5% СО 2 в воздухе, и влажность до насыщения.
  5. Дополнение к культуральной среды с 5% FBS через два дня после инъекции.
  6. Проверьте БЛАСТОЦИСТНОЙ (BL) ставки 7 дней после инъекции. Рассчитать BL цены как общее число бластоцисты эмбрионов / общее количество эмбрионов, культивируемых в этой капле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Лазерная помощь цитоплазматический микроинъекции является мощным и надежным протоколом для доставки решений в цитоплазму зиготы скота. На рисунке 3 показан общий контур зиготы до и после инъекции, а также общий контур техники. Декстран-красный используется в качестве инъекционного раствора для обеспечения отслеживания места инъекции и инъекции эффективности и точности. Успешное предоставление раствора показано на фиг.4 , показывающий в последнее время вп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроинъекция зигот является хорошо установленный способ введения растворов в эмбрионов млекопитающих. С некоторыми вариациями в зависимости от вида и цели эксперимента, этот метод может быть использован в широком смысле. Мы покажем, как выполнить интрацитоплазматическую микроинъекции с помощью лазера, чтобы помочь входу в тупым концом микропипетки. Зиготы некоторых видов животных (таких, как крупный рогатый скот, овцы и свиньи) имеют темную цитоплазму, препятствуя визуализации инъекционной пипеткой один раз внутри эмбр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа, связанная с этой техникой, поддерживается проектами NIH/NICHD RO1 HD070044 и USDA/NIFA Hatch проекты W-3171 и W-2112.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Съемник микропипетокSutter InstrumentP-97
Стеклянный капиллярSutter InstrumentsB100-75-10Эти капилляры используются для изготовления держательных и инъекционных пипеток. Можно использовать любые толстые/стандартные боросиликатные трубки без нити.
MicroforgeNarishigeMF-9оснащен объективом с 10-кратным увеличением.
МикроманипуляторNikon/ NarishigeNT88-V3
Инвертированный микроскопNikonTE2000-Uоснащен объективами 4X, 20X и лазерной системой.
Лазерныеисследовательские приборы7-47-500Сатурн 5 Активный лазер.
МикродозаторDrummond3-000-105Микродозатор используется для перемещения эмбрионов. Также можно использовать пипетку p10, но при этом загрузка должна быть минимально возможной.
Чашка для культуры 100 x 15 ммFalcon351029Используйте крышки чашки для изготовления инъекционной пластины, так как они имеют более низкие стенки и облегчают позиционирование и перемещение микроманипулятора. Также можно использовать крышку чашки для культуры диаметром 60 мм.
Чашка для культивирования 35 мм Corning430165Эти чашки используются для культивирования эмбрионов в 50 мкм; l капель, покрытых минеральным маслом. В качестве альтернативы можно также использовать тарелку на 4 лунки. Независимо от того, какая чашка выбрана для культивирования эмбрионов, они всегда должны быть сбалансированы в инкубаторе не менее 4 часов перед переносом эмбрионов в них.
ИнкубаторSanyoMCO-19AICЛюбой инкубатор, который можно установить на 38,5 градусов; C, можно использовать 5% CO2.
СтереомикроскопNikonSMZ800используется для визуализации эмбрионов в культуральных каплях и во время промывок. Можно использовать любой стереомикроскоп с 10-кратным увеличением.
Блок управления HTMinitube12055/0400Система нагрева, прикрепленная к стереомикроскопу.
Микроскоп с подогревом StageMinitube12055/0003Система нагрева, прилагаемая к стереомикроскопу.
Dextran-RedThermo ScientificD1828Для инъекций используется стерильный раствор 10 мг/мл.
Минеральное маслоsigmaM8410Хранить минеральное масло при комнатной температуре и защищать от света с помощью фольгированной бумаги.
KSOMaa Evolve BovineZenitZEBV-100с добавлением 4 мг/мл BSA. Планшеты КСОМ для культивирования эмбрионов перед использованием следует отбалансировать в инкубаторе не менее 4 часов.
FBSGemini-Bio100-525Используйте стволовые клетки, сертифицированные FBS.
ЗиготыЗиготы вводятся в дозе 17 - 20 hpf и могут быть in-vitro- или in-vivo-производные.
NaClSigmaS5886Конечная концентрация: 107,7 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
KClSigmaP5405Конечная концентрация: 7,16 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
KH2PO4SigmaP5655Конечная концентрация: 1,19 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
MgCl2 6H2OSigmaM2393Конечная концентрация: 0,49 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
DL-лактат натрияSigmaL4263Конечная концентрация: 5,3 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O SigmaC7902Конечная концентрация: 1,71 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
D-(−)-Фруктоза SigmaF3510Конечная концентрация: 0,5 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
HEPES SigmaH4034Конечная концентрация: 21 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
MEM-NEAASigmaM7145Конечная концентрация: 1x. Компонент среды SOF-HEPES.
BME-EAASigmaB6766Конечная концентрация: 1x. Компонент среды SOF-HEPES.
NaHCO3SigmaS5761Конечная концентрация: 4 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
Пируват натрияSigmaP4562Конечная концентрация: 0,33 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
GlutamaxGibco35050Конечная концентрация: 1 мМ. Компонент среды SOF-HEPES.
BSASigmaA-3311Конечная концентрация: 1 мг/мл. Компонент среды SOF-HEPES.
ГентамицинСигмаG-1397Конечная концентрация: 5 мкм; г/мл. Компонент среды SOF-HEPES.
Вода для переноса эмбрионовSigmaW1503Компонент среды SOF-HEPES.
Среда SOF-HEPESИзготовлена в лабораторииpH 7,3 - 7,4, 280 & 10 mOs. Фильтр стерилизованный через 22 мкм; m можно хранить в холодильнике при 4°Г; C на 1 месяц. Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед использованием.

Ссылки

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лазерная микроинъекцияцитоплазматическая инъекцияблестящая оболочкамикропипетка с тупым концомразрыв плазматической мембраныинъекция в эмбрионметод микрофоржингадоставка раствораразвитие бластоцисты
Помощью лазера цитоплазматических микроинъекции в животноводстве зиготы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.