Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ

16K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи мы представляем высокопроизводительную, полуавтоматическую криогистологическую платформу для создания выровненных составных изображений множественных мер отклика из нескольких раундов флуоресцентной визуализации на замороженных срезах минерализованных тканей.

Аннотация

Существует растущая потребность в эффективном фенотипировании и гистопатологии различных тканей. Эта потребность в фенотипировании очевидна в амбициозных проектах по разрушению каждого гена в геноме мыши. Исследовательское сообщество нуждается в быстрых и недорогих способах фенотипирования тканей с помощью гистологии. Гистологические анализы тканей скелета часто отнимают много времени и в лучшем случае являются полуколичественными, регулярно требуя субъективной интерпретации слайдов от обученных людей. В данной работе мы представляем криогистологическую парадигму эффективного и недорогого фенотипирования минерализованных тканей. Во-первых, мы представляем новый метод ленточной стабилизированной криосекции, который сохраняет морфологию минерализованных тканей. Затем эти срезы жестко приклеиваются к предметным стеклам и многократно визуализируются в течение нескольких циклов окрашивания. Полученные изображения затем выравниваются вручную или с помощью компьютерного программного обеспечения, чтобы получить составные стеки из нескольких слоистых изображений. Протокол позволяет ко-локализовать многочисленные молекулярные сигналы к конкретным клеткам в пределах заданного участка. Кроме того, эти флуоресцентные сигналы могут быть объективно количественно определены с помощью компьютерного программного обеспечения. Этот протокол преодолевает многие недостатки, связанные с гистологией минерализованных тканей, и может служить платформой для высокопроизводительного фенотипирования тканей опорно-двигательного аппарата с высоким содержанием в будущем.

Введение

Биологические исследования часто требует эффективного фенотипирования, который часто ассоциируется с какой - то гистологического анализа 1-3. Эта потребность становится еще более очевидным с амбициозными проектами , чтобы сорвать каждого гена в геноме мыши 4. Эти гистологические анализы могут варьироваться от оценки морфологии клеток и / или анатомических особенностей для отображения экспрессии специфических генов или белков на отдельные клетки. На самом деле, одним из основных вкладов гистологии в области геномики является способность ассоциировать определенный молекулярный сигнал к определенной области или клеточного типа.

Традиционные методы гистологии, особенно для костно-мышечной ткани, часто отнимает много времени и трудоемкий, требующий иногда несколько недель, чтобы исправить, ДЕКАЛЬЦ, раздел, пятен и изображения образец затем анализируют изображения через человеческой интерпретации. Анализ нескольких молекулярных сигналов, будь то с помощью иммуногистохимии, на месте hybridizat виона, или специальных красителей, требует нескольких разделов и даже несколько образцов для выполнения надлежащим образом. Кроме того, эти множественные ответы могут не быть совместно локализованы в той же самой клетке, а иногда может не быть совместно локализованы в определенной области в пределах данного образца. В поле геномика и Epigenomics переходит в цифровую эпоху, гистологическое поле должно также последовать этому примеру, чтобы обеспечить эффективную, высокой пропускной способностью, а также автоматизированный анализ различных молекулярных сигналов в пределах одного гистологического среза.

Действительно, существует потребность в улучшенных гистологических методов, которые можно связать несколько молекулярных сигналов к специфическим клеткам в пределах данного образца. Недавно мы опубликовали новый высокой пропускной способностью cryohistological метод оценки нескольких ответных мер в рамках данного раздела из минерализованной ткани 5-14. Процесс включает в себя стабилизацию cryosection с замороженными cryotape, приклеивания приклеенный участок жестко предметное стекло микроскопа, ипроведение нескольких раундов окрашивания и обработки изображений на каждой секции. Эти раунды изображения затем выравнивается вручную или с помощью компьютерной автоматизации для предварительного анализа изображений (рисунок 1). Здесь мы приводим подробные протоколы этого процесса и привести примеры, когда эти методы улучшили наше понимание различных биологических процессов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Университет штата Коннектикут медицинского центра институционального и использованию животных комитета одобрил все процедуры животных.

1. Закрепление и встраивание

  1. Усыпить животное с помощью СО 2 удушья или других утвержденных методов.
  2. Заготавливают интересующую ткань (например, конечностей, позвонки и т.д.) и место в 10% нейтральном забуференном формалине при 4 ° С , пока должным образом не фиксирована. Соблюдайте особую осторожность, чтобы поддерживать последовательную анатомическое размещение до фиксации. Например, исправить конечности с суставами на последовательное сгибание, внутреннее вращение, и углы поворота внешнего 11. Как правило, исправить целые конечности мыши в течение 1 - 3 дней.
    Внимание: формалин является токсичным и должны быть обработаны в вытяжном шкафу при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты.
    Примечание: Временной интервал фиксации зависит от размера образца. Если эксперимент позволяет, разрезав кость улучшит фиксацию отсека мозга.Некоторые образцы могут потребовать перфузионной фиксации 15 , чтобы минимизировать флюоресцентный фон (например, слабые флуоресцентные сигналы в пределах костного мозга).
  3. Передача образцов из формалин до 30% сахарозы, сделанные в 1х PBS и инкубировать в течение 12 - 24 ч при температуре 4 ° С.
    Примечание: После того, инкубируют в течение 12 - 24 ч, образцы могут быть помещены при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Этот метод хранения рекомендуется для экспериментов , в которых исследователи намерены встроить несколько образцов в том же блоке , но не можно собирать из этих образцов , в то же время (например, эксперименты с несколькими точками времени).
  4. Удалить образцы из сахарозы и отсечь любую лишнюю ткань.
  5. Заполните cryomold (размер формы зависит от размера образца) часть пути с крио вложение среды. Поместите образец в форму таким образом, что плоскость вырезания для интересующей нас области параллельно с нижней частью литейной формы.
    Примечание: пример конкретного размещения ткани и ориентацииможно найти на рисунке 2А - B.
  6. не Поместите cryomold на кусок сухого льда, пока тонкий слой крио вложение среды замерзает, а затем фиксирует образец на месте. Заполните оставшийся объем cryomold с крио вложение среды при сохранении cryomold на сухой лед гранулы.
  7. Поместите cryomold в контейнере, содержащем 2-метил-бутан, предварительно охлажденное сухим льдом. После того, как образцы полностью заморожен, удалите cryomolds и стряхните 2-метил-бутан. Оберните cryomolds в целлофан и поместить в -20 ° C или -80 ° C морозильника для хранения.
    Примечание: Образцы могут высыхать в течение долгого времени при хранении в крио вложение среды, особенно при -20 ° С. Мы рекомендуем хранить образцы дольше, чем 1 - 2 месяца в крио вложение среды при -80 ° С или в 30% сахарозы при -80 ° С (см шаг 1.3).

2. Лента-стабилизированной ткани Секционирование

  1. Удалить из блоков с образцами морозильника и поместить в cryostaт с температурой, установленной от -20 до -25 ° C.
  2. Удалить блок из cryomold и обрежьте излишки крио вложение среды с лезвием бритвы.
  3. Поместите некоторое крио вложение среды на образец диска, а затем выровнять блок таким образом, что поверхность образца диска параллельна нижней поверхности блока, таким образом, создания надлежащей секущей плоскости для интересующей области.
  4. Поместите образец диска в криостат и позволяют крио вложение среды для замораживания.
  5. Поместите образец диска на голову образца и отрегулировать головку таким образом, что срезает, параллельно поверхности блока образца.
  6. Обрежьте блок вниз до уровня в пределах области, представляющей интерес и стряхните любые стружку с поверхности блока.
  7. Вырезать кусок cryotape достаточно большой, чтобы покрыть область интереса и обработки перед холодом в криостате.
    Примечание: Несколько компонентов могут быть сокращены последовательных размеров и хранятся в cryostв течение секционирования.
  8. Удалите неприлипающими защитную пленку с cryotape, взявшись за ленту, не-липкое серебро / золото вкладок с помощью щипцов затем поместите ленту на блок липкой стороной вниз.
  9. Надавите на cryotape с помощью валика (рис 2С).
  10. Сделать раздел (5 - 8 мкм), используя либо автоматический двигатель или ручной режущий диск криостата.
    Примечание: Это хорошая практика , чтобы удерживать край cryotape , как это происходит на стадии таким образом, что секция не падает со сцены во время секционирования (рис 2D).
  11. Поместите боковую часть ткани на пластиковом стекле микроскопа внутри криостата.
  12. Удалите пластиковую слайд из криостата и позволить крио вложение среды, чтобы расплавить таким образом, что секция прилипает к поверхности ползуна.
  13. Повторите секционирования для последовательных секций или других регионах, представляющих интерес.
  14. После завершения, сохраните секции в слайд-ящикт 4, -20 или -80 ° C в зависимости от длины хранения необходимой и ответных мер вниз по течению. Например, можно использовать слайды, которые собираются быть окрашены для ферментативной активности (см 5.2 - 5.3) в течение месяца при хранении при 4 ° С.

3. Адгезия секций к предметные стекла микроскопа

  1. УФ-отверждаемый клей методом.
    1. Добавьте стекло микроскопа.
      Примечание: Для повышения автоматизации, образцы и слайды могут быть помечены штрих-коды.
    2. Нанесите каплю оптического клея УФ-активируемые для двух предметных стекол и использовать край пластиковой горкой, чтобы нанести тонкий слой клея по всей поверхности предметные стекла.
    3. Отрезанные / вкладку золото серебро и положите приклеенный боковую часть ткани на клей первого слайда. Применяют раздел в прокатном движения от одного края к другому, с тем чтобы свести к минимуму образование пузырьков, увлеченного расположенных под лентой.
      Примечание: Первый слайд используется для предварительного смачивания изнанка тон ленту перед размещением его на второй (постоянной) слайде (этап 3.1.4).
    4. Удалите приклеенный участок с первого слайда и поместить его на клеевой слой второго слайда (рис 3А). Опять же, позаботиться, чтобы избежать захвата пузырьков.
      Примечание: Этот шаг требует практики мастера.
    5. После того, как соответствующее количество секций для данного эксперимента помещается на каждом слайде, вытрите излишки клея из окружающих областей.
    6. Осмотрите каждую секцию близко для пузырьков или волокон, расположенных под лентой. Выполните эту проверку под микроскопом или лупой. Если есть препятствия, удалить отдельные секции, удалите препятствие, а затем повторно применить его к стеклу.
    7. После того, как определено, что не существует никаких препятствий под тесьмой секций, поместите предметные стекла микроскопа под УФ-черным светом в течение 5 - 10 мин сшивать клей.
  2. Хитозан клеевой метод.
    1. Приготовьте тысе 1% хитозана клей. Готовят раствор уксусной кислоты путем растворения 0,25 мл концентрированной уксусной кислоты в 100 мл деионизированной воды (0,25% об / об). Растворить 1 г хитозана порошка в 100 мл раствора уксусной кислоты и перемешайте раствор O / N или пока весь порошок хитозан не растворяется.
      Примечание: Раствор стабилен при комнатной температуре.
    2. Депозит каплю раствора хитозана для каждого раздела, который будет размещен на слайде.
    3. Отрезанные вкладку серебро / золото ленты и поместить каждую приклеенный боковой секции ткани вверх на клей (рис 3А). Используйте большую осторожность, чтобы избежать захвата пузырьков.
    4. После того, как все секции размещены на слайде, наклоняя слайд вверх на одном из своих длинных кромок и перетащите чрезмерное хитозан к нижнему краю с помощью щипцов.
    5. Поместите слайды в этой ориентации на верхней части бумажного полотенца в коробке слайдов. Сила тяжести будет вызывать избыток хитозан падать вниз на полотенце, получая плоский и однородный слой хитозана.
    6. Пласе ящик слайд с крышкой расклиненной открытым в холодильнике O / N, чтобы позволить хитозан высохнуть.
      Примечание: смотри таблицу 1 для сравнения между двумя клейкими методами.

4. Применение опорных маркеров к слайдам

  1. Готовят раствор сравнения маркера путем растворения 50 мкл зеленого и 50 мкл красных микросфер в 100 мкл воды. Храните раствор в темноте при 4 ° С.
  2. Поместите 10 мкл или 20 мкл пипеткой наконечник в раствор микросферы. Добавить небольшую каплю микросферы раствора в каждую секцию , примыкающей к интересующей области (рис 3C). Будьте осторожны, чтобы не получить микросферы в пределах области, представляющей интерес.
  3. Сухие слайды при комнатной температуре (защищенном от света месте) в течение 30 мин при обработке слайдов в этот день. Если нет, то поместите слайды в коробке слайдов при 4 ° С.
    Примечание: До тех пор пока раствор микросферы высыхает до увлажняющим между слайдами, милиcrospheres будет оставаться приклеены к слайдах во время многократных циклов окрашивания / визуализации.

5. Несколько раундов окрашивающего

Примечание: Выбирая согласованная последовательность изображений, окрашивания и этапы reimaging, можно обнаружить и совместно локализовать многие биологические сигналы на той же секции ткани. Каждый раунд визуализации / окрашивания / reimaging должен быть разработан для конкретного гистологического вопроса. Последовательность изображений / окрашивания / reimaging обычно включает в себя приобретение эндогенные флуоресцентные сигналы (например, сотовой связи, GFP минерализация красители, в естественных условиях зонды визуализации) на первом этапе обработки изображений с последующим флуоресцентным мультиплексной иммунным окрашиванием и несколько раундов ферментных пятен активности. И, наконец, раздел может быть окрашивали с использованием хромогенные красители (например, H & E, толуидиновым синим, Safranin O и т.д.) , чтобы выделить архитектуру ткани. Представленные в данном разделе, специальные методы, адаптированные изкоммерчески доступные протоколы.

  1. Кальцеин синего окрашивания накопленного минерала
    Примечание: Кальцеин синего окрашивания дает последовательную минеральную поверхность, которая поддается автоматическому анализу изображения в отличие от темнопольный или дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений. Проблема с кальцеиновой синего окрашивания является то , что спектр флуоресценции перекрывается с тетрациклин и демеклоциклина маркировки. Поэтому, если образец содержит эти минеральные этикетки, изображение метки в первом раунде визуализации предварительного окрашиванию кальцеиновой синим.
    1. Если эндогенные сигналы в ткани изображаются до этой стадии окрашивания, погрузить слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1xPBS, пока крышка проскальзывает не отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. Готовят 30 мг / мл кальцеиновой синий раствор в 2% раствором NaHCO 3 (при растворении 2 г NaHCO 3 в 100 мл H 2 O и регулироватьИнг до рН 7,4 с помощью HCl). Алиготе и хранить раствор при -20 ° С.
    3. Погрузитесь слайдов в Коплин сосуд, содержащий 1X PBS в течение 15 мин, чтобы гидратировать секции, если они уже не гидратированных из предыдущего раунда.
    4. Удалить слайды и высушить заднюю часть и края с бумажным полотенцем.
    5. Применить 100 - 500 мкл кальцеиновой синий раствор на слайд и инкубировать в течение 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
    6. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
    7. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
    8. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
  2. Тартрат устойчивостью кислой фосфатазы (TRAP) ферментативную активность окрашивания
    Примечание: TRAP выражается несколькими типами клеток в гемопоэтической линии, включая остеокласты. TRAP окрашивание , представленные здесь использует желтый кислой фосфатазы субстрат флуоресцентный. Некоторые флуоресцентные сигналы будут OVerlap с настраиваемой желтый набор фильтров, включая тетрациклина / демеклоциклина минерализацией этикетки, кальцеиновыми синий краситель, и DAPI контрастирующая.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. Готовят буфер 1 путем растворения 9,2 г ацетата безводного натрия и 11,4 г дигидрата двухосновного тартрата натрия в воде и доведение до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 4,2 с концентрированной ледяной уксусной кислоты (~ 1,5 - 2 мл). Хранить раствор при температуре 4 ° C в течение до 12 месяцев.
    3. Подготовка буфера 2 путем растворения 40 мг нитрита натрия в воде и доведение до конечного объема 1 мл. Хранить раствор при 4 ° С в течение до 1 недели.
    4. В день окрашивания, готовят Реакционный буфер путем смешивания 7,5 мл буфера 1 и 150 мкл буфера 2.
    5. Нанести буфер реакции без субстрата на слайдес в течение 10 - 15 мин для уравновешивания ткани при более низком рН.
      Примечание: Типичный объем составляет ~ 200 мкл, но должен быть достаточно большим, чтобы охватить все разделы.
    6. Развести желтый флуоресцентный кислую фосфатазу субстрат между 1:50 и 1: 100 в буфере для реакции.
      Примечание: Разбавление будет диктоваться ТРАППОВОГО активности в образце.
    7. Налейте буфер реакции от слайдов и применять буфер реакции с желтым флуоресцентным субстратом к слайдам.
    8. Поместите слайды под черным светом УФ на ~ 5 мин, чтобы активировать субстрат.
      Примечание: Время инкубации может изменяться в зависимости от активности TRAP в образце.
    9. Промыть слайдов в 1x PBS в течение 10 мин с 3-х изменений.
    10. Применить ~ 200 мкл 50% глицерина в 1x PBS к каждому слайду и смонтировать покровное.
    11. Удалите излишки глицерина и высушить в нижней части слайдов.
      Примечание: Кислотный буфер TRAP будет декальцинировать секции. Дополнительным преимуществом decalcificaние в том , что некоторые цвета будут снова доступны для окрашивания вниз по течению (например, минерализация этикетки). Например, кальцеин синего окрашивания будут удалены в процессе Ловушку окрашивания. Поэтому DAPI контрастирующая могут быть отображены в данном канале в течение последующего раунда.
  3. Щелочной фосфатазы (AP) ферментативную активность окрашивания
    Примечание: Несколько типов клеток, связанные с минерализацией включая остеобласты и Минерализующая хондроциты выразить AP. Быстрый Красный субстрат, используемый в этом протоколе вызывает как флуоресцентный красный и пигментной красный сигнал светофора. Из-за этого хромогенного субстрата утолит флуоресцентные сигналы в тех регионах, где подложка выпадает в осадок. Поэтому, лучше всего сделать это после того, как пятно визуализации флуоресцентных сигналов, которые могут быть закаленных субстратом AP.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку, заполненную 1x PBS до тех пор, пока крышка слипы отпасть от слайдах. Remoве и высушить покровных стеклах.
    2. Готовят 1 М Трис путем растворения 12,1 г Трис в 100 мл воды. Регулировка рН до 9,5 с помощью 1 М NaOH.
    3. Готовят 1 М MgCl 2 гексагидрат растворением 20,33 г MgCl 2 в 100 мл деионизированной воды.
    4. Приготовьте 2 М NaCl, растворяя 11,68 г NaCl в 100 мл деионизированной воды.
    5. Готовят 100x (20 мг / мл) раствор быстропротекающих Red TR соль путем растворения 1 г порошка в 50 мл деионизированной воды. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
    6. Готовят 100x (10 мг / мл) фосфатного запас нафтол AS-МХ раствор путем растворения 500 мг порошка в 50 мл N, N диметилформамида. Сделайте 100 мкл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.
    7. В день окрашивания, подготовить буфер AP путем добавления 1 мл 1 М Трис, 0,5 мл 1 М MgCl 2, 0,5 мл 2 М NaCl и довести до конечного объема 10 мл с использованием деионизированной воды (конечные концентрации: 100 мм Трис, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl).
    8. Поместите AP бuffer на каждом слайде и инкубировать во влажной камере в течение 10 мин при комнатной температуре.
    9. Готовят буфер подложки AP путем разбавления 100X запасы Fast Red TR Соль и нафтол AS-MX до 1 раза в буфере AP.
    10. Налейте AP буфера от слайдов и заменить буфером AP подложки. Инкубируйте слайды в течение 5 - 10 мин в камере влажности при комнатной температуре.
      Примечание: Время инкубации будет диктоваться AP активности образца.
    11. Промыть 3 раза скользит в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    12. Установить крышку сползает с раствором DAPI counterstaining (1: 1000 разбавления DAPI в 50% глицерина в 1x PBS).
  4. Толуидиновый синий O (TB) хромогенная окрашивание
    Примечание: Поскольку все предыдущие шаги изображаются под временной водной монтажа в 50% глицерина / раствора PBS, хромогенного стадия также изображается в водных условиях. Тем не менее, красящий раствор может иметь тенденцию к выщелачиванию в течение долгого времени. Таким образом, предлагается к изображению толуидиновым синим как можно скорее после окрашивания.
    1. Погрузите слайды из предыдущего раунда визуализации в Коплин банку , заполненную деионизированной водой до тех пор , пока крышка слипы отпасть от слайдах. Удалите и высушите крышку слипы.
    2. После снятия крышки слипы, заменить свежей водой и инкубировать слайды в течение не менее 10 мин, так что соли из РФБ, в достаточной степени удалены из ткани.
    3. Готовят 0,025% раствора ТБТ в деионизированной воде.
    4. Поместите слайды в растворе ТБ в течение 1 - 5 мин.
      Примечание: Время инкубации зависит от предпочтений пользователя, но следует держать одинаковым во всех образцах.
    5. Место слайды в Коплин банку с деионизированной водой и мыть слайдов 3x в течение 5 минут каждый.
    6. Установить крышку скольжения с 30% глицерина , растворенного в деионизированной воде (НЕ 1x PBS , поскольку это приведет к пятно вымываться из ткани). Примечание: Глицерин гистологическая среда может быть замещена фруктозный сироп, который помогает предотвратить диффузию пятна из ткани. кподготовить фруктозный сироп, растворить 30 г фруктозы в 10 мл деионизированной воды и нагревают до 60 ° С до растворения.

6. Несколько раундов визуализации

  1. Загрузите слайды в микроскоп лотки (рис 3D).
    Примечание: Лотки подпружинены.
  2. Вставьте лотки в стек лоток слайд - сканирования микроскопа (рис 3Е).
  3. Нажмите на список профилей, чтобы загрузить профиль для каждого слайда с соответствующими экспозициями для каждого флуорофора. Нажмите на название слайд, чтобы назвать каждого слайда вручную или программное обеспечение чтения штрих-код, предусмотренный на этикетке слайд. Нажмите кнопку Предварительный просмотр сканирования начать принимать изображение для предварительного просмотра слайда.
  4. Установить регионы, представляющие интерес в мастере обнаружения тканей и сохранить их для последующих раундов визуализации. После того, как каждый слайд установки, запустите процесс сканирования, нажав на кнопку запуска сканирования.
    Примечание: Система может содержать до 100 SLIдез одновременно.
  5. После завершения формирования изображения, экспортировать изображения из каждого отдельного канала и формирования изображения круглыми, как .tif или .jpg файлы для сборки и анализа изображений.

7. Изображение Ассамблея

  1. Ручной метод с использованием Photoshop (или подобное программное обеспечение для редактирования изображений, способных производить многослойные изображения).
    1. Открыть каждого отдельного канала изображения с каждого раунда визуализации.
    2. Собрать отдельные изображения в виде слоев в пределах одного составного изображения. Для этого щелкните на слое в палитре слоев из одного изображения. Затем перетащите слой на другое изображение. Это операция перетаскивания создаст новый слой в изображении. Сделайте это для всех других изображений. В качестве альтернативы, используйте скрипт (Файл> Сценарии> Загрузить файлы в стек ...), чтобы автоматизировать этот процесс путем загрузки нескольких файлов изображений в качестве слоев в стеке изображений.
    3. После того, как каждое изображение в списке в качестве отдельного слоя в комбинированном изображении, дважды щелкните по имени слоя, чтобы переименовать лаYers по мере необходимости различать разные каналы.
    4. Для того чтобы увидеть через каждый слой и создать действительно составного изображения, измените режим смешивания для каждого слоя из "Normal" на "Screen" в палитре слоев.
      Примечание: Чтобы ускорить этот шаг, изменить один слой на экране, а затем щелкните правой кнопкой мыши на слое, выберите "стиль слоя копия", а затем выделить все остальные слои и выберите "Вставить стиль слоя", чтобы применить стиль экрана к другому слои.
    5. При желании уменьшить непрозрачность (изменить значение на 10 - 40%) хромогенного слоя (то есть, толуидиновым синим) , чтобы лучше визуализировать флуоресцентные сигналы через хромогенного слой.
      Примечание: плиточный сканирующий микроскоп используется в данном протоколе держит слайды на 3-х ребер, тем самым сводя к минимуму количество вращения, которое может произойти на слайд во время каждого раунда визуализации. Таким образом, это намного проще для пользователя, чтобы вручную выравнивать изображения без необходимости поворачивать изображения, полученныеиз различных этапов обработки изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий рабочий процесс для высокой пропускной способности , Multi-Image Cryohistology

На рисунке 1 представлен общий рабочий процесс , используемый для этой техники. Она включает в себя несколько шагов от фиксации через несколько раундов визуализации и, наконец, изображения выравнивания / анализа. Этот процесс может занять всего лишь неделю, чтобы перейти от фиксации образца че...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представили подробный протокол cryohistology к сотрудничеству локализовать и количественно оценить несколько биологических мер, совместив изображения с нескольких раундов окрашивания / визуализации на одном участке. Способ изложены с использованием cryotape особенно полезна , поскольку она поддерживает морфологию трудно раздела ткани (например, минерализованной костной и хрящевой ткани). Кроме того, секционного ткани плотно приклеивают к стеклу, что позволяет для нескольких циклов окрашивания / изображ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить следующие источники финансирования: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 и T90-DE021989.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% нейтральный буферизованный формалинSigma AldrichHT501128-4LДоступно несколько поставщиков. Токсичный. Может быть заменен на 4% параформальдегид.
SucroseSigma AldrichS9378Доступно несколько поставщиков.
PBSSigma AldrichP5368Доступно несколько поставщиков.
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554Различные размеры могут быть использованы в зависимости от ткани
CryomatrixThermo Scientific6769006Может быть заменен другими криоматриями. Тем не менее, смолы на основе ПВА/ПЭГ лучше всего работают в наших руках.
2-метил-бутанSigma AldrichM32631Доступно несколько поставщиков.
CryostatLeica Biosystems3050sможет быть заменен на другие марки/модели.
Диск для образцовLeica Biosystems14037008587может быть заменен на другие марки/модели.
Криостатные лопастиThermo Scientific3051835Могут быть заменены на другие марки/модели.
Секция криолентыLabCryofilm 2C
RollerElectron Microscopy Sciences62800-46Может быть заменена другими брендами/моделями.
Пластиковые предметные стекла для микроскопаElectron Microscopy Sciences71890-01Могут быть заменены на другие марки/модели.
Предметные стекла для микроскопаThermo Scientific3051могут быть заменены на другие марки/модели.
Norland Оптический клей, 61Norland Оптическийклей Norland, 61
УФ черный светGeneral ElectricF15T8-BLB
Ледяная уксусная кислотаSigma AldrichARK2183Доступно несколько поставщиков.
ChitosanSigma AldrichC3646Доступно несколько поставщиков.
InSpeck красный микроскопThermoFisher ScientificI-14787
InSpeck зеленые микросферыThermoFisher ScientificI-14785
Кальцеин синийSigma AldrichM1255Доступно несколько поставщиков.
КальцеинСигма ОлдричC0875 Доступно несколько поставщиков.
Ализарин комплексонSigma AldrichA3882 Доступно несколько поставщиков.
ДемеклоциклинСигма ОлдричD6140 Доступно несколько поставщиков.
NaHCO3Sigma AldrichS5761Доступно несколько поставщиков.
ГлицеринSigma AldrichG5516Доступно несколько поставщиков.
ELF 97 желтый субстрат флуоресцентной кислой фосфатазыThermoFisher ScientificE-6588
DAPIThermoFisher Scientific62247Доступно несколько поставщиков. Может быть заменен на Hoechst 33342 или другие ядерные красители.
TO-PRO-3 (противоядерное пятно Cy5)ThermoFisher ScientificT3605
Йодид пропидияThermoFisher ScientificR37108Доступно несколько поставщиков.
Ацетат натрия безводныйSigma AldrichS2889Доступно несколько поставщиков.
Диосновной дигидрат тартрата натрия Sigma AldrichT6521Доступно несколько поставщиков.
Нитрит натрияSigma AldrichS2252Доступно несколько поставщиков.
TrisSigma Aldrich15504Доступно несколько поставщиков.
MgCl2 гексагидратSigma AldrichM9272Доступно несколько поставщиков.
NaClSigma AldrichS7653Доступно несколько поставщиков.
Fast Red TR SaltSigma AldrichF8764Доступно несколько поставщиков. Также может быть заменен другими наборами подложек, такими как Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX Sigma AldrichN4875Доступно несколько поставщиков.
N,N диметилформамидSigma AldrichD158550Доступно несколько поставщиков.
Толуидин синий OSigma AldrichT3260Доступно несколько поставщиков.
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1Также можно использовать другие линейные или мозаичные сканеры.
Набор фильтров DAPIChroma Technology Corp.Комплект фильтров 49000
CFPChroma Technology Corp.49001
Набор фильтров GFPChroma Technology Corp.49020
Комплект фильтров YFPChroma Technology Corp.49003
Пользовательский желтый (ELF 97) Набор фильтровChroma Technology Corp.обычай; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
Набор фильтров TRITCChroma Technology Corp.49004
Набор фильтров Cy5Chroma Technology Corp.49009
Система переноса ленты CryoJaneЭлектронная микроскопия Науки62800-10Доступно несколько поставщиков.
Лента CryoJane WindowsЭлектронная микроскопия Наука62800-72Доступно несколько поставщиков.
Клейкие слайды CryoJaneЭлектронная микроскопия Науки62800-4XДоступно несколько поставщиков.

Ссылки

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Криосекционирование со стабилизацией лентойУФ-отверждаемый адгезиввизуализация серийных срезовколичественное определение флуоресцентного сигналасканирующий микроскоп для предметных стеколсовмещение по референсным маркерамвысокопроизводительное фенотипированиеанализ опорно-двигательных тканей
Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.