Мы описываем надежную стратегию замены генов генетически манипулировать головне гриба Ustilago maydis. Этот протокол объясняет, как генерировать делеционных мутантов для исследования инфекции фенотипы. Он может быть расширен , чтобы модифицировать гены любым желаемым способом, например, путем добавления последовательность , кодирующую флуоресцентный белок тег.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генетическая Манипуляция растений Возбудитель
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
делеции гена играет важную роль в анализе функции гена. Одним из наиболее эффективных способов сорвать генов в качестве целевой группы является замена всего гена с селективным маркером посредством гомологичной рекомбинации. В процессе гомологичной рекомбинации, обмен ДНК происходит между последовательностями с высоким сходством. Таким образом, линейные геномные последовательности, фланкирующие ген-мишень, может быть использован, чтобы специально направить селективный маркер на нужный сайт интеграции. Тупые концы делеций конструкции активировать систему восстановления ДНК клетки и, таким образом, способствовать интеграции конструкции либо с помощью гомологичной рекомбинации, либо не-гомологичной отслуживших присоединения. В организмах с эффективной гомологичной рекомбинации, скорость успешного удаления гена может достигать более 50% решений эта стратегия является ценным система разрушение гена. Головне гриб Ustilago maydis является эукариотической модель микроорганизм показывает такую эффективную гомологичной рекомбинантногоиона. Из его около 6900 генов, многие из них были функционально характеризуется с помощью мутантов с делецией, и неоднократный отказ замены гена покушений точек на основной функции гена. Последующая характеристика функции генов с помощью мечения с флуоресцентными маркерами или мутации предсказанных доменов также опирается на обмен ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Здесь мы представляем U. maydis стратегия генерации штамма подробно , используя простой пример, удаление гена.
Введение
Ustilago maydis является фитопатогенные модель грибок , который интенсивно изучали в течение многих десятилетий 1,2. Он существует в двух морфологией, дрожжей типа, непатогенных стадии и мицелиальных, инфекционная форма 3. Универсальные прорывные открытия , такие как гомологичные механизмы рекомбинации и репарации ДНК были сделаны в дрожжеподобных стадии роста этого гриба 4. Кроме того, морфологический переход к инфекционным и филаментов факторов вирулентности важных для инфекции хорошо характеризуются 5,6. Растущий молекулярно знания о биологии и вирулентность этого гриба головне опирается на стратегию замещения п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация делеционных конструкций
- Сформировать плазмиду , содержащую конструкцию удаления (рисунок 1) , содержащий соответствующий 1 т.п.н. вверх по течению (UF флангом) и вниз по течению флангом (DF) каждый и соответствующую кассету сопротивления по бокам тупыми сайтов рестрикции резки.
Примечание: Любая стратегия клонирования может быть использована (для клонирования см ссылку 22) мы рекомендуем Golden Gate клонированию для таких плазмид 9. - Акцизный удаление построить из плазмиды с помощью тупого ножа для получения 1 мкг ДНК делеции построить 9. Очищают удаления конструкции для устране....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Делеционные конструкции для всех четырех хитинолитических генов , закодированных в U. maydis генома были получены путем клонирования Golden Gate с использованием кассеты HYGR для удаления CTS1, то NaTr для удаления Cts2, то G418R кассета для удаления cts3 и cbxR для удаления cts4 20. Общий обзор стратегии замещения гена можно проиллюстрировать на примере удаления cts3 (рисунок 1)........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол описывает , как генерировать делеционных мутантов для обратного генетических исследований в U. maydis. Отправной точкой является делеция конструкция , которая содержит фланкирующие последовательности гена представляющей интерес , содержащий последовательности около 1 кб вверх по течению от начала и вниз по течению от стоп-кодона, а также соответствующей кассете сопротивления , как это было ранее оптимизирован 7,9 , Конструкции должны быть индивидуально генерируется для каждого гена и тщ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Особая благодарность д-ром Бенедиктом Steuten за критическое прочтение рукописи. Оригинальный работа над хитиназы была проведена доктором Торстен Ланглер. Лаборатория VG поддерживается кластером передового опыта в области растений наук (CEPLAS, DFG EXC 1028) и BioSC, лаборатория KS поддерживается BioSC. KB поддерживается BioSC. Научная деятельность биоэкономике научного центра (BioSC) при финансовой поддержке Министерства инноваций, науки и исследований в рамках NRW Strategieprojekt BioSC (№ 313 / 323-400-00213). LF поддерживается докторская общение 1525 iGRADplant DFG International Training Group Research.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аминобензоэиновая кислота (свободная кислота) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| Bacto peptone | BD | 211677 | альтернативно используйте местный поставщик |
| дрожжевой экстракт Bacto | BD | 212750 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| CaCl2*2H2O | Grü ssing GmbH | 10234 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. соль) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Казаминокислоты | BD | 223050 | |
| Холинхлорид | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Лимонная кислота | ChemSolute | 24,321,000 | альтернативно использовать местного поставщика |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | альтернативно использовать местного поставщика |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| ДНК без кислоты | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grü ssing GmbH | 10288 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| Geneticin (G418) дисульфатная соль | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Триходерма лизирующие ферменты | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Глюкоза | Caelo | 2580 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| Glycerin | качестве альтернативы | Fisher Chemical | G065015 |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | . Пожалуйста, ознакомьтесь с инструкциями производителя по технике безопасности. |
| Гепарин натриевая соль | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Гигромицин B-раствор | Roth | 1287.2 | Опасное вещество. |
| KCl | VWR | 26764298 | альтернативно использовать местного поставщика |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| MgSO4 безводный | Merck | 7487-88-9 | Безводный имеет решающее значение. В качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | альтернативно использовать местного поставщика |
| Na2SO4 | Grü ssing GmbH | 12174 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | альтернативно используйте местного поставщика |
| NaOH | ChemSolute | 13 751 000 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| Никотиновая кислота (свободная кислота) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Нурсеотрицин дигидросульфат | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Питательный бульон | Местные поставщики | Difco | |
| Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1) pH 6,7 | Sigma Aldrich | P3803 | Опасное вещество. Пожалуйста, ознакомьтесь с инструкциями производителя по технике безопасности. |
| полиэтиленгликоль (ПЭГ) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Ацетат калия | AppliChem | 121479 | альтернативно использовать местного поставщика |
| Пиридоксин (моногидрохлорид) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | альтернативно использовать местный поставщик |
| небольшой шприц | BD | 300300 | альтернативно использовать местный поставщик |
| стерильный фильтр, 22 & микро; m | VWR | 28145-477 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | альтернативно использовать местного поставщика |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | в качестве альтернативы использовать местного поставщика |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | альтернативно использовать местного поставщика |
| Tris- (гидроксиметил) аминометан | VWR | 103156X | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | в качестве альтернативы используйте местного поставщика |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | альтернативно использовать местного поставщика |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | альтернативно использовать местного поставщика |
| Состав растворов/приготовление материала | Состав растворов | ||
| Карбоксин | Запас: 5 мг/мл в метаноле, конечная концентрация: 2 &микро; г/мл | ||
| CM пластины | 0,25 % (w/v) казаминокислоты, 0,1 % (w/v) дрожжевой экстракт, 1,0 % (v/v) раствор витамина Холлидея, 6,25 % (v/v); Раствор соли Холлидея, 0,05 % (мас./об.) ДНК дегр. свободная кислота, 0,15 % (масс>масса) NH<суб4NO<суб>3, 2,0 % (мас./об.) бактоагар; отрегулировать до pH 7,0 с помощью 5 М NaOH; После автоклавирования добавить 1 % глюкозы; | ||
| Генетин (G418) | Запас: 50 мг/мл в H2O, конечная концентрация: 500 &m; г/мл | ||
| промытые HCl стеклянные шарики (0,35-0,45 мм) | Накройте стеклянные шарики концентрированными HCl (25 %, 7,8 М) и выдержите в течение 60 мин. Покачайте несколько раз. Сцедите HCl (храните сцеженную жидкость) и промойте стеклянные шарики 3 M HCl (храните сцеженную жидкость). Промойте стеклянные шарики несколько раз с помощью H2O до тех пор, пока pH не станет 7 (жидкость больше не должна быть желто-зеленой). Нанесите на стеклянные бусины и высушите их при 180 °C. Сцеженный HCl должен быть нейтрализован перед утилизацией. | ||
| Гепарин | бульон: 15 мг/мл | ||
| соли Холлидея | 16,0 &пермил; (б/в) KH2PO4, 4.0 ‰ (б/в) Na2SO4, 8.0 ‰ (б/в) KCl, 1.32 ‰ (б/в) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) микроэлементы, 2.0 ‰ (б/в) MgSO4; стерильный фильтрат | ||
| витаминный раствор Холлидея | 0,1&пермил; (б/в) Тиамин, 0,05&пермил; (б/в) Рибофлавин, 0,05&пермил; (б/в) Пиридоксин, 0,2 & (б/в) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (б/в) Аминобензоэиновая кислота, 0,2&пермил; (б/в) Никотиновая кислота, 0,2&пермил; (б/в) Холинхлорид, 1,0; (б/в) мио-инозитол; может храниться при температуре -20 °°°; C | ||
| Запас гигромицина | : 50 мг/мл в PBS, конечная концентрация: 200 и микро; г/мл | ||
| Нурсеотрицин | Запас: 200 мг/мл в H2O, конечная концентрация: 150 &m; г/мл | ||
| NSY-глицерин-среда | 0,8 % (w/v) Питательный бульон, 0,1 % (w/v) Экстракт дрожжей, 0,5 % (w/v) Сахароза, 80,0 % (v/v) 87% Глицерин (f.c. 69,6%) | ||
| RegLight | 1,0% (w/v) Экстракт дрожжей 0,4% (w/v) Бактопептон, 0,4% (w/v) Сахароза, 18,22% (w/v) Сорбит, 1,5% (w/v) Агар | ||
| SCS, pH 5,8 | Раствор 1: 20 мМ три-Na-цитрат, 1 М сорбит; колуят 2: 20 мМ Лимонная кислота, 1 М сорбит, добавить раствор 2 в раствор 1 до достижения pH 5,8; автоклав | ||
| STC, pH 8 | 1 М сорбит, 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 100 мМ CaCl2; фильтр стерильный | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG в STC-буфере; | ||
| TE буфер, pH 8 | 1,31 мМ трис-основание, 8,69 мМ Tris-HCl, 10 мМ Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/РНКаза | 10 &микро; г/мл РНКаза в TE буфере | ||
| Микроэлементы | 0,06&пермил; (б/в) H3BO3, 0.14‰ (б/в) MnCl*4H2O, 0,4 ‰ (б/в) ZnCl2, 0,4 ‰ (б/в) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (б/в) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (б/в) CuSO4*5H2O | ||
| раствор лизирующих ферментов | 12,5 мг/мл SCS; фильтровать стерильно; готовить незадолго до применения | ||
| Tris-HCl pH 7,5 | 806 мМ Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; проверять pH и при необходимости корректировать с помощью HCl; автоклав | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 10 мМ NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Не измеряйте pH с помощью pH-метра. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 с 1x TE в соотношении 1:1 | ||
| YEPS-Light medium | 1,0% (w/v) Дрожжевой экстракт, 0,4% (w/v) Bacto Pepton, 0,4% (w/v) Сахароза, для планшетов: 1,5% (w/v) Bacto Agar |
Ссылки
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
