Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54542

⸱

10 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Cardiovascular & Metabolic Disease, MedImmune, 2Lab Automation and Support, MedImmune

В этой статье

Краткое содержание

Адсорбция пептидов на пластиковой посуде во время традиционных серийных разведений на основе наконечников может значительно повлиять на определение потенции и затруднить понимание взаимосвязей между структурой и активностью, используемое для идентификации свинца и оптимизации свинца на этапах разработки лекарств. Здесь описаны методы автоматизированного акустического бесконтактного серийного разведения образцов пептидов.

Аннотация

Как и в случае небольшого обнаружения наркотиков молекулы, скрининг пептидных агонистов требует последовательного разведения пептидов для получения кривых концентрация-ответ. Скрининг пептидов обеспечивает дополнительный уровень сложности, как обычные методы обработки образцов наконечников на основе пептидов, разоблачить на большой площади поверхности из пластмассы, что обеспечивает повышенную возможность потери пептида посредством адсорбции. Предотвращение чрезмерного воздействия снижает потери из пластмассы пептида посредством присоединения к пластмассам и , таким образом , сводит к минимуму неточности в прогнозировании потенции, и ранее мы описали преимущества бесконтактной акустических раздаточного для высокопроизводительного скрининга в пробирке пептидных агонистов 1. Здесь мы обсудим полностью интегрированное решение автоматизации для бесконтактного акустической подготовки пептидных серийных разведений в микротитровальных планшетах с использованием в качестве примера для скрининга пептидных агонистов у мышей глюкагон-подобный пептид-1 рецептора (GLP-1R). Наши методы позволяют высокой-throughput клеток на основе анализов для скрининга агонистов и легко масштабируются для поддержки повышенную пропускную способность образца, или для обеспечения увеличения числа копий планшета для анализа (например, для панели более целевых клеточных линий).

Введение

GLP-1R является признанным целевой препарат в лечении сахарного диабета 2 типа 2. Нативный пептидного агониста рецептора для этого, ГПП-1, имеет в естественных условиях полураспада 2-3 мин 3. Связывание ГПП-1 с его белком мишени приводит рецепторов G в нисходящем производства вторичного мессенджера цАМФ через нативного белка муфте G к активации аденилатциклазы. Измерение накопленного цАМФ обеспечивает надежный анализ для контроля за активацию рецептора и экран для активных GLP-1 аналоги с предпочтительными физико-химическими свойствами. Такой анализ требует серийного разведения образцов тест построить кривые зависимости ответа от концентрации, и это особенно сложным при передаче пептидных образцов. Потенциальные ошибки от зондового подготовки последовательного разбавления были описаны ранее 1,4,5. Пептиды будет адсорбироваться из пластмассы, что приводит к недостоверным потенцией оценок. Потеря Пептид может быть сведено к минимуму с помощью тон включение бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферах и использование силиконизированный, все же из пластмассы связывания с белками остается непредсказуемой. В частности, изменение связывания GLP-1 в экспериментальных контейнерах было описано 6. Существует еще одна сложность в том , что стабилизационные агенты , используемые в лаборатории из пластмассы могут вымываться из советов и микротитровальных пластин в водные буферы анализа и препятствуют функции белка 7, 8. Поэтому методы для уменьшения воздействия Пластик необходимы для повышения точности измерений.

Акустические жидкие распылители фокусировать звуковой сигнал высокой частоты на поверхность образца жидкости, что приводит к выбросу капельки точных nanoliter в смежную планшет для анализа 9. Использование акустического выброса является стандартом в фармацевтической промышленности для подготовки и скрининга больших синтетических библиотек соединений, а технология была хорошо подтверждена для малых moleculэс 10. Насколько нам известно, мы первая группа для описания акустического дозирования для получения рекомбинантных и синтетических пептидов , и мы уже ранее сообщали улучшенную точность по сравнению с обычными зондовых методов , основанных на 1.

В данной статье описывается интеграция получения пептидных последовательных и прямых разбавление бесконтактной передачи акустической на полностью автоматизированной обработки пластин роботизированной системы. Ряд методов , охватывающих акустический перенос образцов были описаны ранее 11. Мы используем двухступенчатый метод для подготовки промежуточных концентраций запаса и серийно разбавить пептидные аналоги для генерации полной кривой доза-реакция. Полученные пептиды инкубируют с клетками, экспрессирующими целевой мыши GLP-1R, и мы используем имеющиеся в продаже гомогенным с временным разрешением флуоресценции (HTRF) анализа для измерения накопления цАМФ внутри этих клеток в качестве считывании пептидных агонистов Activность. Анализ является надежной и поддаются высокой пропускной формате 384-луночного и обычно применяется как для анализа развития и скрининг лекарств проектов 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Пептид серийным разведением

  1. Подготовка буфера для анализа: Хенкса солевой раствор (HBSS) с добавлением 25 мМ HEPES, 0,1% BSA и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), рН 7,4.
  2. Используйте насыпную дозатор реагента систематически добавляют 5 мкл буфера для анализа в каждую лунку пяти 384-луночных низких анализируемый объем пластин.
    1. Используйте внутреннее программное обеспечение, чтобы создать программу для раздаточного 5 мкл объема дополнение к каждой лунку 384-луночного планшета в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Погрузитесь дозирования кассеты трубки в буфере для анализа и премьер жидкости.
    3. Поместите 384-низкий объем пробы пластины на несущей пластине.
    4. Нажмите старт.
  3. Развести все образцы пептидов, независимо от того, транспортное средство хранения, в буфере для анализа с получением 100x пептидный запас.
    Примечание: Пептиды , требующие скрининга могут быть представлены в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) или диметилсульфоксиде (ДМСО) в качестве сочтено целесообразным (например, ДМСО Wбольным оказывают вредное влияние на пептиды с вторичными изменениями, такими как ПЭГилированием).
  4. 25 мкл 100x акции пептидные в колонках 1-5 акустически квалифицированных 384-луночного полипропиленового микропланшет. Эта пластина обозначена 'источник пластины А'. Убедитесь в том, что исходные пластины, но не назначения плиты, плоские дном и соответствовать определенным акустическим допусков, как это определено изготовителем акустических инструментов.
  5. 25 мкл 100x эталонного контроля в лунки А23 и А24 из источника пластины А.
  6. Разлить 10 мкл буфера для анализа в колонках 11-15 и 30 мкл буфера для анализа в колонках 21-22 источника пластины А.
  7. Разлить 10 мкл буфера для анализа в колонках 6-10 и столбцы 16-20 второго акустически квалифицированным 384-луночного полипропиленового микропланшет. Эта пластина обозначена 'источник пластины B'.
  8. Центрифуга исходные пластины А и В при 300 мкг в течение 1 мин. Включите соответствующий баланс пластины.
  9. Использование акустической Флуиг диспенсеры интегрированы в автоматизированную систему роботизированной подготовить три последовательных 1: 100 промежуточных разведений (в аналитическом буфере) от 100x пептидных запасов из колонки 1 в исходном А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программирование требует переформатирования пластины и программное обеспечение ответа от дозы (как это предусмотрено изготовителем дозатора акустической жидкости) , чтобы обеспечить три акустические передачи между источниками А и источника B (см рисунок 1 для плит макетов). Шаг 1.9 детали конкретно использование жидкостных распылителей , используемых в этой лаборатории под автоматизированного роботизированного контроля (см Материалы таблицу):
    1. Нагрузка Источник пластины и аналитические планшеты в пластины отеля секции робототехники.
    2. Open роботизированная программного обеспечения и загрузки пластины переформатирование и протоколы расширения программы доза-ответ. Нажмите кнопку "Выполнить".
      Примечание: Автоматизация инструктирует акустический дозатор жидкости для передачи 250 NL из столбцов 1-5 исходной пластины А в колонках 6-10 из источника пластины B, и второй acoustiс жидкостью дозатор способен обрабатывать большие объемы жидкости для обратной засыпки с 15 мкл буфера для анализа для смешивания. Автоматизация затем передает источник пластины B к интегрированным центрифуге и центрифугах при 300 мкг в течение 1 мин (соответствующий баланс пластины включен для всех этапов центрифугирования). Источник пластина B возвращается к дозатору акустической жидкости для передачи 250 нл из колонок 6-10 из исходной пластины B в колонках 11-15 исходной пластины А и обратной засыпки с 15 мкл буфера для анализа, чтобы перемешать. Автоматизация передает источник пластины А интегрированный центрифуге и центрифуг при 300 мкг в течение 1 мин. Источник пластины А затем возвращается к дозатору акустической жидкости для передачи 250 нл из столбцов 11-15 исходной пластины А в колонках 16-20 исходного пластины B и засыпки с 15 мкл буфера для анализа, чтобы перемешать. Автоматизация затем передает источник пластины B к интегрированным центрифуге и центрифуг при 300 мкг в течение 1 мин.
      Примечание: Наконец протокол доза-ответ направляет акустическую раздачу передаватьтребуемый объем от каждого из 4-х серийно разведенными скважин источника пластины (как в исходной пластины А и источника пластины В), чтобы построить полную кривую 11-балльной в двух экземплярах в планшеты для анализа (предварительно заполненный 5 мкл буфера для анализа на шаге 1.2 выше ). переводы Автоматизация планшета для анализа в интегрированной центрифуге и центрифуги при 300 мкг в течение 1 мин.

2. Подготовка сотового

  1. Оттепель криоконсервированных яичника китайского хомячка (СНО), экспрессирующие рецептор целевой мыши GLP-1 быстро в 37 ° С на водяной бане и ресуспендируют в 20 мл буфера для анализа с.
  2. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре (RT). Включите соответствующий баланс.
  3. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл буфера для анализа.
  4. Развести сотовому складе 1: 1 в трипанового синего и определения жизнеспособной плотности клеток с использованием автоматического счетчика клеток. Ресуспендируют клеток в буфере для анализа при 1,6 × 10 6 клеток на мл ( что эквивалентно 8000 клеток на достл планшеты для анализа).
  5. Используйте насыпную дозатор реагента для добавления 5 мкл суспензии клеток в каждую лунку планшеты для анализа (содержащие пептиды, серийно разбавленных в 5 мкл буфера для анализа) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

3. HTRF обнаружения цАМФ анализа

  1. Доведите HTRF цАМФ набора для анализа до комнатной температуры в течение 30 мин перед использованием.
  2. Подготовка каждого HTRF реагента (криптат и d2) отдельно при разбавлении 1:20 в буфере для лизиса (патентованного препарата, предоставленного производителем анализа для обнаружения цАМФ).
    Примечание: ВНИМАНИЕ: Лизис буфер содержит фторид калия (KF) , который является токсичным и тератогеном 13. Для утилизации, аналитические планшеты, содержащие KF должны быть герметизированы и сжигаются, и любые жидкие отходы должны быть ослаблены до <1 ммоль / л с водой перед удалением вниз раковиной.
  3. Используйте насыпную дозатор реагента для добавления реагента криптатом 5 мкл во все лунки планшеты для анализа.
  4. Используйте объемный дозатор реагента для добавления реагента d2 5 мкл в Columнс 1-22 из аналитических планшетов.
  5. Немедленно вручную пипеткой 5 мкл буфера для лизиса в лунки А23-D24 пробирного пластин, чтобы дать неспецифического связывания (NSB) контрольные лунки, и 5 мкл реагента d2 в лунки E23-P24.
  6. Центрифуга Планшеты в течение 1 мин при 200g при комнатной температуре, чтобы смешивать лунки.
  7. Накройте Планшеты свести к минимуму испарение и фото-отбеливание и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
  8. Измерение сигнала флуоресценции резонансного переноса энергии (FRET) с использованием возбуждения при 320 нм и излучение на длине волны 620 нм и 665 нм с использованием планшет-ридера.

Анализ 4. Данные

  1. Используйте NSB значит вычесть фон из всех лунок.
  2. Рассчитать% Delta F от 620/665 нм соотношение нм следующим образом:
    Отношение = (A 665nm / A 620nm) х 10 4
    Delta F = ((Образец Ratio - Коэффициент NSB) / Коэффициент NSB)) х 100
    где коэффициент NSB = скважины с реагентом не Д2.
  3. Вычислить% activatионов между нестимулированных клеток и клеток, стимулированных максимальной GLP-1 лиганда, следующим образом:
    % Активации = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated клетки) / (% DeltaFGLP-1 стимулируются клетки -% DeltaF нестимулированных клеток) × 100
  4. Анализ кривых концентрация-ответ через 4 параметра материально - технического анализа, а также графа как активации% , как это определено эталонным контролем 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы регулярно использовать двухступенчатый метод для разбавления пептидов с помощью акустической передачи. Для первого шага, акустический диспенсер совмещен с автоматизацией используется для создания четырех акций пептидных промежуточных разведений через два исходных пластин (рис 1а, б). Для второго этапа, мы используем акустический дозатор для дальнейшего разбавить запаса разведений от источника пластин А и В , чтобы создать диапазон концентраций 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает успешное применение автоматизированного акустического дозирования серийно разбавить образцы пептидов в диапазоне концентраций от 3 х 10 6 , требующей меньше , чем 1 мкл образца. Основным преимуществом этого метода является то, чтобы повысить качество данных путем минимизации пептидный адсорбции с помощью уменьшенной из пластмассы подверженности образцов экспериментальных контейнеров и из пластмассы (например, наконечники пипеток), которые обычно требуются для переноса реагентов и перем...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хэнкс Сбалансированный солевой растворSigma-AldrichH8264
HEPESSigma-AldrichH3375
Бычья сыворотка АльбуминSigma-AldrichA9418
3-изобутил-1-метилксантинSigma-AldrichI7018Приготовлен в виде 0,5 М бульона в DMSO
GLP-1 (7-36) амидBachemH-6795Изготовлен в виде бульона 1 мг/мл в PBS, называемого '100x референтным контролем'Тестовые
пептидыПроизведены на предприятии MedImmuneПоставляются в различных концентрациях в ДМСО или PBS в зависимости от обстоятельств
100x пептидный запасПроизведены на предприятии MedImmuneТестовый пептид разбавлен в буфере для анализа до 100-кратной конечной требуемой концентрации
Раствор трипанового синего цвета, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Cedex XS Cell AnalyzerInnovatis
Corning 384 луночные планшеты, малый объемSigma-Aldrich4514
Echo Qualified 384-луночный полипропиленовый микропланшетLabcyte Inc.P-05525
Квалифицированный резервуарEcho Labcyte Inc.ER-0055
Echo 550 Обработчик жидкостейLabcyte Inc.Объемы переноса капель с шагом 2,5 нл
Echo 525 Liquid HandlerLabcyte Inc.Объемы передачи капель с шагом 25 нл
ACell Benchtop Automation HighRes BiosolutionsMC522
Cellario Lab Автоматизация Программное обеспечение для планирования для медико-биологических наук РобототехникаHighRes Biosolutions
MultidropCombi Дозатор реагентовThermFisher Scientific5840300Упоминается как «дозатор реагентов для сыпучих материалов»
HTRF cAMP Dynamic 2 наборCisbio Bioassays62AM4PEJ
EnVision Multilabel ReaderПеркинЭлмер

Ссылки

  1. Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
  2. Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
  3. Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
  4. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  5. Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).
  6. Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
  7. McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917(2008).
  8. Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
  9. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
  10. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
  11. Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
  12. Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
  13. Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
  14. Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
  15. Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
  16. Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
  17. Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GLP 1
Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.