Генерация двухцветного Antigen микрочипов для одновременного определения IgG и IgM Аутоантитела

Краткое содержание

Мы описываем здесь метод создания настраиваемых антигенных микрочипов, которые можно использовать для одновременного обнаружения сывороточных аутоантител IgG и IgM у людей и мышей. Эти матрицы позволяют с высокой пропускной способностью и количественно обнаруживать антитела против любых антигенов или эпитопов, представляющих интерес.

Аннотация

Аутоантитела, которые являются антителами против аутоантигенов, присутствуют во многих болезненных состояниях и могут служить маркерами активности заболевания. Уровни аутоантител к специфическим антигенам обычно определяются с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). Тем не менее, скрининг на множественные аутоантитела с помощью ИФА может занять много времени и потребовать большого количества образцов пациента. Метод антигенных микрочипов является альтернативным методом, который может быть использован для скрининга аутоантител в мультиплексном режиме. В этом методе антигены размещаются на предметных стеклах микроскопа со специальным покрытием с помощью роботизированного микрочипера. На предметных стеклах прощупываются образцы сыворотки крови пациента, а затем добавляются флуоресцентно меченные вторичные антитела для обнаружения связывания сывороточных аутоантител с антигенами. Реактивность аутоантител выявляется и количественно оценивается путем сканирования предметных стекол с помощью сканера, который может обнаруживать флуоресцентные сигналы. Здесь мы опишем методы генерации пользовательских антигенных микрочипов. Наши современные матрицы напечатаны с 9 твердыми контактами и могут включать до 162 антигенов, обнаруженных в двух экземплярах. Матрицы можно легко настроить, изменив антигены в исходной пластине, используемой микрочипером. Мы разработали двухцветную схему обнаружения вторичных антител, которая позволяет различать реакции IgG и IgM на одной и той же поверхности предметного стекла. Система обнаружения была оптимизирована для изучения связывания аутоантител человека и мыши.

Введение

Аутоантитела присутствуют при многих болезненных состояниях и часто могут иметь прямую патогенную активность¹. Идентификация аутоантител важна для диагностики определенных заболеваний, для прогнозирования исхода заболевания и для классификации пациентов, которым может быть полезна конкретная терапия². Аутоантитела обычно идентифицируются в сыворотке крови пациента с помощью метода ИФА; Тем не менее, скрининг на множественные антигены с помощью этого метода является трудоемким и требует большого количества образцов пациента. Поэтому необходимы новые технологии для профилирования аутоантител в более широких масштабах.

Метод антигенного микрочипа представляет собой протеомную технологию, которая позволяет профилировать аутоантитела в мультиплексном режиме³. На первом этапе этого процесса библиотека антигенов размещается на поверхности предметного стекла с помощью роботизированного микрочипера. Предметные стекла прощупывают разбавленной сывороткой, а затем добавляют флуоресцентно меченные вторичные антитела. Реактивность антител визуализируется путем сканирования предметных стекол с помощью сканера микрочипов и количественно определяется интенсивностью флуоресценции. Антигенные микрочипы имеют множество преимуществ по сравнению с методом ИФА при скрининге аутоантител: 1) они требуют всего микролитров сыворотки для профилирования аутоантител к нескольким антигенам одновременно, 2) они используют антиген экономно, так как на матрицах обнаруживаются только нанолитры антигена, 3) они имеют повышенную чувствительность³ по сравнению с ИФА и 4) они позволяют проводить одновременный тест, Отдельное обнаружение более чем одного изотипа антител. Антигенные микрочипы использовались для профилирования аутоантител при аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и системная красная волчанка^4-6. При всех трех этих заболеваниях новое понимание патогенеза заболевания было получено путем профилирования аутоантител в больших масштабах с помощью матриц.

Здесь мы описываем протокол для генерации антигенных микрочипов с использованием предметных стекол, покрытых нитроцеллюлозой. Различные антигены, включая белки, пептиды и лизаты клеток, могут быть размещены на предметных стеклах с помощью этого метода. Матрицы могут быть легко настроены путем включения интересующих антигенов в исходную пластину, на которой находится библиотека антигенов. Кроме того, мы показываем, как пара вторичных антител может быть использована для разделения реакций IgG и IgM на одной и той же поверхности предметного стекла. В настоящее время мы оптимизировали эту методику для измерения аутоантител как у людей, так и у мышей.

Протокол

1. разбавляя Антигены и генерации Антиген Microarrays

1. Развести антигены в PBS до конечной концентрации 0,2 мг / мл. Печать до 162 уникальных антигенов в двух экземплярах с конфигурацией microarrayer с 9-ю штырями. Включить IgG и IgM антигены в библиотеке антиген качестве положительного контроля. Включите PBS только в качестве отрицательного контроля.
2. Добавьте 20 мкл каждого антигена к 384 источника луночного планшета. Добавьте антигены к исходной пластине в группах , которые отражают установки печатающей головки (например, договоритесь антигены групп 9 , когда 9 штырьков используются для печати).
3. Крышка источника пластины с фольгой и заморозить при температуре -80 ° С до готовности к печати массивов.
4. Очистки твердых microarrayer штифты, при инкубировании их в ультразвуковую ванну, с деионизированной водой в течение 3 х 1 мин. Место булавки в стойке, чтобы высохнуть, а затем организовать контакты в микрочипов печатающей головки. За 9 штырьков, используйте конфигурацию 3 х 3.
5. Программа microarrayer для печати запуска путем установки цифровых контактов на печатающей головке,количество слайдов для печати, количество прокладок на каждом слайде, и количество повторных пятен для каждого антигена. Как правило, используют 9-контактный, 70 горок, 2 колодки / слайд и 2 дублирующие места для каждого антигена. Программа microarrayer на булавки в разрушать ультразвуком воде между различными группами антигенов.
6. Оттепель пластины источника, а затем центрифуге пластины в течение 1 мин при 100 х г. Поместите источник пластину в назначенном месте в microarrayer. Удалите участок фольги, которая покрывает первую группу антигенов, которые будут напечатаны.
7. Устройте непропечатанных скользит по поверхности arrayer и программы запуска печати. Печать слайдов при комнатной температуре с влажностью устанавливается на arrayer при 55 - 60% при сборке в увлажнителем машины массива.
8. После того, как каждая группа антигенов печатается на всех слайдов, пауза microarrayer. Накройте антигены, которые были только что напечатанные с фольгой (для предотвращения испарения) и раскрыть следующую группу антигенов, которые будут напечатаны. Продолжить программу печати.
9. После того, как все антигены были напечатаны, источник крышки плел с новым куском фольги и заморозить при температуре -80 ° С. Поместите напечатанные слайды в окне слайдов и вакуумное уплотнение. Слайды могут быть использованы на следующий день или до одного месяца позже.

2. Зондирование Antigen Microarrays с разбавленных сывороток

1. Поместите слайды в кадры с использованием инкубационных камер. Добавить 700 мкл блокирующего буфера (2,5% [об / об] эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0,1% [об / об] твин 20 в PBS) для каждой поверхности массива.
2. Поместите клейкую пленку на раме и поместить в герметичный контейнер с куском влажной ткани. Выдержите O / N при 4 ° С на качалке.
3. Развести образцы сыворотки 1: 100 в блокирующем буфере. Отберите блокирующего раствора из массивов и добавить 500 мкл разведенного образца к каждой поверхности массива.
4. Покрытие с клейкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при 4 ° С с качалки.
5. Развести вторичными антителами в блокирующем буфере. Для получения человеческих исследований, разбавьте Су3 меченый козий антитела против человеческого IgG до 0,33 мкг / мл, и Cy5 меченый козий анти-HUMAN IgM-антитела к 0,25 мкг / мл. Для исследований на мышах, разбавьте Су3 меченый козий против мышиного IgG антитела к 0,38 мкг / мл и Cy5 меченый козий анти-мышиных IgM-антител до 0,7 мкг / мл.
6. Аспирируйте образцы из массивов и промыть поверхность массива 4 раза буфером для ополаскивания (0,1% Tween 20 в PBS). Налейте буфер на к слайдам и смахнуть быстро.
7. Добавить 700 мкл блокирующего буфера, чтобы вымыть каждую поверхность массива и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре с качалки. Повторите шаг мыть два раза больше.
8. Добавьте 500 мкл разведенной вторичного антитела к каждой поверхности скольжения и накрыть клейкой пленкой. Инкубировать 45 мин при 4 ° С с качалки.
9. Отберите вторичной смеси антител с горками и прополоскать в 4 раза выше. Вымойте слайды 3 раза 700 мкл блокирующего буфера / разбавления, как указано выше.
10. Удалить слайды из рамок и места в металлической стойке слайд, который погружают в PBS. Выдержите 20 мин при комнатной температуре с орбитальным встряхивании. Место в новом контейнере PBS и инкубировать еще 20 мв при встряхивании.
11. Место слайд стойку в контейнере деионизованной воды 15 сек. Поместите стойку в новый контейнер с водой и инкубировать еще 15 сек.
12. Для сухих слайдов, поместите слайд-штатив на пластине адаптера ELISA в центрифуге и спина при 220 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
13. Поместите слайды в светонепроницаемый ящик до готовности для сканирования.

3. Сканирование Антиген Microarrays и экспортирование данных

1. Сканирование слайдов с помощью сканера микрочипов, который может обнаружить Cy3 и Cy5 флуоресцентные сигналы. Для того, чтобы изменить уровень фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) сканера в, предварительно отсканировать слайд, который был только испытанные с вторичными антителами.
   Примечание: Этот слайд должен иметь полную библиотеку антигена, напечатанный на нем в том числе положительных (IgG и IgM), а также отрицательного контроля (PBS). Предварительное сканирование является низкое разрешение сканирования, что позволяет пользователю быстро найти оптимальные настройки PMT.
2. Установите значения PMT так, что IgG особенности человека (на канале Cy3) и гулН. особенности IgM (на канале Cy5), имеют аналогичные медианы интенсивности флуоресценции минус величина фонового (ПТР-B) (как правило, 40 000). Уровни PMT устанавливаются нажатием кнопки "аппаратного". После установки, сохранить эти настройки PMT постоянной.
3. Сканирование экспериментальных скользит по двум каналам, нажав на кнопку "SCAN". Сохраните слайд-изображения (оба канала) после каждого сканирования.
4. Загрузите слайд для анализа в программное обеспечение микрочипов с помощью кнопки "Файл".
5. Загрузите файл списка массива генов (GAL) с помощью кнопки "Файл". Файл GAL имеет расположение массива с идентичностей функций массива.
6. Поместите шаблон массива над отсканированного изображения таким образом, чтобы массивы функции соответствуют шаблону настолько близко, насколько это возможно.
7. Совместите функции во всех блоках с шаблоном, нажав на кнопку "Align". Программа, как правило, найти схему круговых функций, но некоторые ручные корректировки могут быть необходимы, Эти поправки могут быть сделаны путем ввода в режим функции. Программное обеспечение будет вычислять MFI-B для каждого из антигенов.
8. экспортировать эти результаты в виде текстового файла Используйте кнопку "Файл".

4. Анализ массива данных со значением анализа микрочипов (SAM)

1. Загрузите отдельные текстовые файлы в Excel и идентифицировать столбцы, которые имеют MFI-B для каналов Cy3 и Cy5.
2. Вычислить среднее значение для дублирующих функций.
3. Для любого отрицательного MFI-B, заменить отрицательное число с 10. Преобразование данных путем деления сырой MFI-B на 100, а затем путем вычисления логарифма по основанию 2.
4. Анализ лог - преобразованных данных со значением анализа микрочипов (SAM) , как описано выше ^7.
5. Для исследования с помощью двух групп (например, здоровых людей против пациентов), этикетки одна группа "1" и группа "2." Используйте два класса, непарный анализ в SAM, чтобы идентифицировать антигены, которые являются реакционные significantly отличается между двумя группами (Q значение <0,05).
6. Используйте кластерами и теплогенерирующего-карта программное обеспечение , чтобы сделать изображения для презентации ^8.

Результаты

Антигены расположены в 384 - луночный планшет и распечатываются на предметные стекла с помощью роботизированной microarrayer , как показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает слайды помещается в рамку с инкубаторе и отсканированного слайда после обработки. На рисунке 3 показаны положительные и отрицательные контрольные слайды. Отрицательный салазки только зондируют вторичными антителами, а положительный контроль салазки зондируют с сывор...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, позволяет для количественного определения аутоантител с использованием метода антигена микрочипов. Антиген микрочипов имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционным методом ELISA в скрининг на аутоантитела. Во-первых, различные антигены, включая нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, и клеточные лизаты могут быть выстроены на слайдах нитроцеллюлозные покрытием, что позволяет мультиплексированных скрининг аутоантител. Кроме того, только микрограмм антигена необходимы для создания массивов, так...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Рибосомальный P0	Diarect	14100	развести до 0,2 мг/мл в PBS
IgG человека	Jackson Immuno	009-000-003	развести до 0,2 мг/мл в PBS
IgM человека	Jackson Immuno	009-000-012	развести до 0,2 мг/мл у
мыши PBS IgG	Sigma-Aldrich	I5381	развести до 0,2 мг/мл у
мыши PBS IgM	Biolegend	401601	развести до 0,2 мг/мл в
двухцепочечной ДНК	Sigma-Aldrich	D1626	развести до 0,2 мг/мл в
одноцепочечной ДНК	Sigma-Aldrich	D8899	развести до 0,2 мг/мл в
микрочипере	PBS Virtek	VersArray Chipwriter Pro	многие типы массивов подходят
твердые печатные штифты	Arrayit Corporation	SSP015
программное обеспечение для роботизированного микромассива	Virtek	Chipwriter Pro
Горки FAST (2 Pad)	Рама GVS Northa America	10485317
рама FAST	GVS Northa America	10486001
FAST инкубационные камеры (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
384 луночные пластины	Whatman	7701-5101
пластины уплотнители VWR		60941-062
крышки	для фольгированных пластинVWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Эмбриональная телячья сыворотка	Invitrogen	12483020
Cy3 козы против человека IgG	Jackson Immuno	109-165-096	использовать рабочий состав в 50% глиеркол
Cy5 козы против человека IgM	Jackson Immuno	109-175-129	использовать рабочий состав в 50% глиеркол
Cy3 козы антимышиный IgG	Jackson Immuno	115-165-071	использовать оборотный запас в 50% глиеркол
Cy5 козий антимышиный IgM	Jackson Immuno	115-175-075	использовать оборотный запас в 50% глиеркол
микрочип сканер	молекулярных устройств	Axon 4200A
программное обеспечение микрочипа	Молекулярные устройства	Genepix 6.1
Кластеризация программного обеспечения	eisenlab.org	3.0
статистическое программное обеспечение для микрочипов		Стэнфордский университет SAM 4.0 (Анализ значимости микрочипов)