Методическая статья

Колометрической Обнаружение бактерий с помощью лакмусовой тест

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54546

⸱

17 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол колориметрического обнаружения кишечной палочки с использованием модифицированного лакмусового теста, который использует ДНК-фермент, уреазу и магнитные шарики, расщепляющие РНК.

Аннотация

Растут потребности в простых, но все же эффективных методах, которые могут быть использованы для обнаружения конкретных патогенов в местах оказания медицинской помощи или в полевых условиях. Такие методы должны быть удобными для пользователя и давать достоверные результаты, которые могут быть легко интерпретированы как специалистами, так и непрофессионалами. Лакмусовый тест на pH является простым, быстрым и эффективным, поскольку он сообщает о pH исследуемого образца путем простого изменения цвета. Мы разработали подход, позволяющий использовать лакмусовую бумажку для обнаружения бактерий. Метод использует специфичную для бактерии ДНКфермент, расщепляющую ДНК, для достижения двух функций: распознавания интересующей бактерии и обеспечения механизма контроля активности уреазы. С помощью магнитных шариков, иммобилизованных конъюгатом ДНК-фермент-уреаза, присутствие бактерий в исследуемом образце передается на высвобождение уреазы из гранул в раствор. Высвобожденную уреазу переносят в тестовый раствор для гидролиза мочевины в аммиак, в результате чего происходит повышение pH, которое можно визуализировать с помощью классической лакмусовой бумажки.

Введение

Бактериальные патогены являются одной из основных причин глобальной заболеваемости и смертности. Вспышки, вызванные внутрибольничными инфекциями, пищевыми патогенами и бактериальными загрязнителями в окружающей среде представляют серьезную и постоянную угрозу общественному здоровью и безопасности. Для предотвращения этих вспышек необходимы эффективные инструменты, позволяющие своевременно выявлять патогены в различных условиях. Простые, но все же эффективные тесты, которые являются портативными и экономичными, пользуются большим спросом, особенно в регионах, которые подвержены вспышкам, но не могут позволить себе дорогостоящее оборудование для тестирования. 1-3 Несмотря на то, что существует множество методов обнаружения бактерий, многие из них не подходят в качестве инструментов для скрининга или тестирования на месте, поскольку требуют длительного времени испытаний, дорогостоящих инструментов и сложных процедур тестирования.

Колориметрические тесты особенно привлекательны для применения в местах оказания медицинской помощи или в полевых условиях, поскольку изменения цвета могут быть легко обнаружены невооруженным глазом. Лакмусовая бумажка для определения pH проста, быстра и эффективна. Несмотря на то, что это очень старая технология, она до сих пор широко используется благодаря своей простоте и эффективности. Удивительно, но этот простой тест никогда не модифицировался для обнаружения других аналитов до тех пор, пока мы недавно не разработали подход к модификации этого теста для тестирования на E. coli. 4

Расширенный лакмусовый тест на E. coli использует три дополнительных компонента: ДНК, активируемую E. coli (EC1), 5 уреазу и магнитные шарики. ДНКферменты относятся к синтетическим одноцепочечным молекулам ДНК с каталитической активностью. 6 Они могут быть выделены из пулов ДНК со случайными последовательностями с помощью селекции in vitro. 7,8 Они обладают высокой стабильностью и могут быть получены с минимальными затратами с использованием высокоэффективного автоматизированного синтеза ДНК. 9 По этим причинам ДНК-ферменты, в частности ДНКферменты, расщепляющие РНК, широко исследовались для применения в биосенсорике. 6,10,11 РНК-расщепляющие ДНКферментные сенсоры были разработаны для обнаружения ионов металлов,12-16 малых молекул,17,18 бактериальных патогенов5,19-21 и раковых клеток. 22 Учитывая большую доступность ДНКферментов, индуцированных мишенями, расщепляющими РНК, любой анализ, использующий ДНКфермент, может быть потенциально расширен для обнаружения разнообразного диапазона аналитов.

Urаза выбрана из-за ее способности гидролизовать мочевину в аммиак,23,24 что приводит к повышению pH. Уреаза также обладает высокой эффективностью, стабильностью и способностью к конъюгации с другими биомолекулами. Таким образом, мы предположили, что конъюгат ДНК-расщепления РНК с уреазой позволит использовать лакмусовую бумажку для обнаружения других мишеней. 5

Действие ДНКфермента, расщепляющего РНК, связано с опосредованным уреазой повышением pH за счет использования магнитных шариков, которые иммобилизованы конъюгатом ДНК-уреаза. Поскольку активность исследуемого ДНКфермента строго зависит от E. coli, присутствие этой бактерии в исследуемом растворе приведет к высвобождению уреазы из магнитных шариков в раствор, который затем берут и используют для гидролиза мочевины в репортерном растворе, содержащем pH-чувствительный краситель. Конечным результатом этой процедуры является изменение цвета, о котором можно удобно сообщить с помощью красителя или бумаги pH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление реагентов и буферные

  1. 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)
    1. В 2 л лабораторный стакан, добавляют 186,1 г ЭДТА в 800 мл деионизованной дистиллированной воды (DDH 2 O). Доводят рН раствора до 8,0 с помощью NaOH гранул. Добавить DDH 2 O до конечного объема 1,0 л и передача раствора на автоклавируемом стеклянная бутылка для автоклавирования и хранят при температуре 4 ° С.
  2. 10 × Трис-борат ЭДТА (10x КЭ)
    1. В пластиковом стакане емкостью 4 л, добавляют 432 г Трис-основание, 200 г борной кислоты, 80 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) и DDH 2 O до конечного объема 4 L. Mix не используя мешалку , пока все компоненты растворены. Переносят раствор до 1 л стеклянные бутылки для автоклавирования и хранить при температуре 4 ° С.
  3. 10% денатурирующих полиакриламидном Stock
    1. В пластиковый стакан 4 л, добавить 1681.7 г мочевины, 400 мл 10x TBE 1 л 40% акриламид / бис - акриламид (29: 1) раствор и DDH 2 O до FИнал объем 4 L. Mix, используя мешалку, пока мочевины не растворится. Переносят раствор до 1 л бутылках из желтого стекла и хранят при температуре 4 ° С.
  4. 2x Гель буфера для загрузки (2x GLB)
    1. В стекл нный стакан емкостью 200 мл, добавляют 44 г мочевины, 8 г сахарозы, 10 мг бромфеноловый синий, 10 мг ксилолцианола FF, 400 мкл 10% додецилсульфата натрия и 4 мл 10 × КЭ. Добавить DDH 2 O до конечного объема 40 мл и растворения компонентов с мягким нагреванием при 50 ° С при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Передача 1 мл аликвоты по 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при температуре 4 ° С.
      Примечание: Перед использованием этой команды требует кратковременного нагревания при 90 ° С для повторного растворения любых твердых веществ.
  5. 1 М Трис-гидрохлорида (трис-HCl) (рН 7,5)
    1. В стеклянную колбу, добавляют 12,1 г трис-основания и 70 мл DDH 2 O и перемешивают до тех пор , пока твердое вещество не растворится. Доводят рН до 7,5 с использованием 1 М соляной кислоты (HCl). Добавить DDH 2 O до конечного объема 100 мл, автоклав и STOповторно при температуре 4 ° C
  6. 5 М хлорида натрия (NaCl)
    1. В стеклянную колбу, растворяют 58,4 г NaCl в 150 мл DDH 2 O. Отрегулируйте громкость до 200 мл с DDH 2 O. Хранить при температуре 4 ° С.
  7. ДНК-буфера для элюции
    1. В стеклянную колбу, смешивают 2,0 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,5), 8,0 мл 5 М NaCl и 0,4 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Отрегулируйте громкость до 200 мл с DDH 2 O, автоклав и хранят при температуре 4 ° C.
  8. 1 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) (рН 7,4)
    1. В стеклянной бутылке, растворяют 2,38 г HEPES в 80 мл DDH 2 O. Доводят рН до 7,4 с использованием 5 н NaOH и добавляют DDH 2 O до конечного объема 100 мл.
  9. 1 М хлорид магния (MgCl 2)
    1. В стеклянной бутылке, добавьте 2,03 г MgCl 2 -6Н 2 O и доводят объем до 100 мл с DDH 2 O.
  10. Реакция буфера (РБ)
    1. В 50 мл коническую пробирку, добавляют 50 мкл 1 М HEPES (рН 7,4), 1,5 мл 5 М NaCl, 0,75 мл 1 М MgCl 2, и 5 мкл Tween-20. Добавить DDH 2 O до конечного объема 50 мл. Приготовьте раствор и фильтруют в другую коническую трубку с помощью шприца управляемый фильтр (0,22 мкм) и хранят при температуре 4 ° С до использования.
  11. Связывающем буфере (ВВ)
    1. В 50 мл коническую пробирку, добавляют 500 мкл 1 М Трис-HCl (рН 7,5), 8,8 г NaCl, 50 мкл 1 М MgCl 2 и 5 мкл Tween 20. Добавить DDH 2 O до конечного объема 50 мл. Приготовьте раствор и фильтруют в другую коническую трубку с помощью шприца управляемый фильтр (0,22 мкм) и хранят при температуре 4 ° С до использования.
  12. Раствор субстрата (SS)
    1. В 50 мл коническую пробирку, добавляют 5,8 г NaCl, 3 мл 1 М MgCl 2, 1,5 г мочевины и 40 мл DDH 2 O. Доводят рН раствора до 5,0 с помощью 10 мМ HCl. Поскольку решение не буферизуется, регулирования рН с помощью HClтщательно путем добавления небольших аликвот HCl. Добавить DDH 2 O до конечного объема 50 мл.
    2. Приготовьте раствор и фильтруют в другую коническую трубку с помощью шприца управляемый фильтр (0,22 мкм) и хранят при температуре 4 ° С до использования.
  13. Лурия Бертани (LB) Бульон
    1. В химический стакан, растворяют 20,0 г LB порошка в 1 л DDH 2 O. Переложить в стеклянную колбу, автоклав, и хранят при температуре 4 ° С.
  14. 1,5% LB-агар
    1. В 250 мл колбу, добавляют 1,5 г агара и 100 мл LB бульона. Автоклавы и хранить при температуре 4 ° С.
  15. Чашки с агаром
    1. Растворяться агар LB в микроволновой печи и охлаждения раствора до ~ 50 ° C. Налейте раствор в чашки Петри, что делает ~ 5 пластин и позволить им затвердеть.

2. Синтез и очистка Е. coli- отзывчивым ДНКзим EC1

  1. Синтез EC1 Шаблона опосредованного ферментативного лигирования
    1. очищают комлинкercially синтезированные олигонуклеотиды БС1, DE1, и Т1 (последовательности , представленные в Таблице 1) 10% денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле (dPAGE) в соответствии со стандартными протоколами.
    2. Подготовьте 100 мкМ запас BS1, DE1 и T1. Хранить при -20 ° С до использования.
    3. В 1,5 мл микроцентрифужную пробирку, добавляют 38,5 мкл DDH 2 O, 5 мкл DE1 и 5 мкл 10х Т4 реакционного буфера полинуклеотид - киназы , предоставляемые поставщиком фермента (500 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 100 мМ MgCl 2, 50 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1,0 мМ спермидин).
    4. Добавить 1 мкл аденозинтрифосфата (АТФ) (100 мм). Добавьте 5 единиц Т4 полинуклеотидной киназы (10 ед / мкл). Смешать осторожно пипеткой реакционную смесь.
    5. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
    6. Гасят реакции при нагревании до 90 ° С в течение 5 мин.
    7. Добавьте 118 мкл DDH 2 O 5 мкл BS1 и 5 мкл T1. Реакционную смесь нагревают до 90 ° С в течение 2 милиN, а затем охлаждают до комнатной температуры в течение 10 мин.
    8. Добавьте 20 мкл 10 × Т4 ДНК - лигазы реакции предоставленный буфер поставщиком фермента (400 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 100 мМ MgCl 2, 100 мМ ДТТ, 5 мМ АТФ). Добавьте 10 единиц ДНК-лигазы Т4 (5 ед / мкл) и тщательно перемешать с помощью пипетки.
    9. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
    10. Добавьте 20 мкл 3 М ацетата натрия (NaOAc) (рН 5,2), 500 мкл холодного 100% этанола. Приготовьте раствор путем встряхивания и поместить трубку в C морозильной камере -20 ° С в течение 30 мин.
    11. Центрифуга микроцентрифуге при 20000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
    12. Промывают осадок с холодным 70% этанолом и снова центрифуге при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Снова удалить супернатант и высушить осадок под вакуумом в течение 10 мин.
    13. Ресуспендируют ДНК с 15 мкл DDH 2 O , а затем добавить 15 мкл 2х GLB.
    14. Вортексе и нагревают до 90 ° С в течение2 мин. Очищают ДНК полной длины, с помощью 10% -ного dPAGE, как описано ниже.
  2. Настройка 10% dPAGE
    1. Гладко две стеклянные пластины (одна полная и одна тарелка с надрезом), два 0,75 мм толщиной прокладки, и расчесывать 12-луночного. Положите одну стеклянную пластину на плоскую поверхность с двумя прокладками на каждой стороне и рифленые пластины на вершине. Клип две пластины вместе с помощью четырех клипов, предоставленных поставщиком.
    2. В пластиковый стакан емкостью 150 мл, заливают 40 мл 10% -ного dPAGE 40 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED) и 400 мкл 10% персульфата аммония (APS). Смешайте компоненты и вылить раствор между пластинами медленно.
    3. Вставьте гребень, а затем позволить гель полимеризуется в течение 10 мин. После того , как гель полимеризуется, медленно удалить расческу и промыть лунки с DDH 2 O.
    4. Установите пластины на гель-электрофореза устройства. Используйте металлическую пластину для рассеивания тепла для предотвращения перегрева.
    5. Налейте 1x КЭ на верхней и нижней палати гарантировать, что скважины хорошо погружают в буфер. Промыть лунки с 1x КЭ с помощью пипетки или шприца.
    6. Установите устройство для запуска при 35 мА и предварительный прогон в течение 15 мин до загрузки образцов.
  3. Элюирование с наложенной лигатурой, EC1 с 10% dPAGE
    1. После этапа 2.2.6, запустить гель при 35 мА пока нижний краситель (бромофенолового синий) достигает нижней части стеклянной пластины. Это должно занять примерно 1,5 часа. Выключите питание и удалите пластины из аппарата.
    2. Положите тарелки на несколько листов бумажных полотенец и аккуратно удалите распорки из стеклянных пластин. Осторожно снимите верхнюю стеклянную пластину и обернуть гель с полиэтиленовой пленкой.
    3. Флип гель над удалить вторую стеклянную пластину и снова накрыть полиэтиленовой пленкой. Будьте осторожны, чтобы избежать морщин полиэтиленовой пленкой.
    4. Визуализируйте лигирован продукт с помощью УФ-затенения (260 нм), что будет производить 4 отдельные полосы ДНК (полностью сшита ec1, dE1, BS1, и T1).
    5. Акцизный верхняя полоса (EC1) со стерильным лезвием бритвы и передачи в 1,5 мл пробирку микроцентрифуге. Раздавить гель с стерильным наконечником пипетки (200 мкл размера наконечника), пока она не превратится в тонкую пасту. Добавить 550 мкл ДНК-буфера для элюции, накройте трубу с алюминиевой фольгой для защиты встроенного флуорофор, и встряхивают в течение 15 мин.
    6. Центрифуга раствора геля при 20000 х г в течение 5 мин и осторожно передавать 400 мкл супернатанта в другую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Избегайте снятия геля частей во время пипеткой.
    7. К пробирке с передаваемым супернатанта добавляют 40 мкл 3 М NaOAc (рН 5,2) и 1,0 мл холодного 100% этанола. Приготовьте раствор путем встряхивания и поместить трубку в C морозильной камере -20 ° С в течение 30 мин.
    8. Центрифуга микроцентрифуге при 20000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки.
    9. Промывают осадок с холодным 70% этанолом и снова центрифуге при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Еще раз, удалитесупернатант и высушить осадок под вакуумом в течение 10 мин.
    10. Определить концентрацию EC1 путем измерения УФ-поглощению при 260 нм. Делают 10 мкМ запас и хранить пробу при -20 ° С до использования.

3. Сопряжение уреазы к ДНК

  1. Приготовление сукцинимидилового 4- (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) Фото
    1. Растворите 1 мг SMCC в 676 мкл ДМСО. Vortex и место на льду до использования.
  2. Приготовление уреазы запаса
    1. Растворите 1 мг уреазы в 1 мл 1 × PBS (без Mg 2+ или Ca 2+). Поместите на льду до использования.
      Примечание: Кристаллизированный уреазы медленно растворяться и нежное перемешивание необходимо, чтобы избежать денатурации.
  3. Синтез уреазы-ДНК (UrDNA)
    1. Добавляют 10 мкл 100 мкМ LD1 в 2,5 мл пробирке с. Добавьте 140 мкл DDH 2 O, 40 мкл 10х PBS, и вихрь.
    2. Добавить 80,5 мкл ККАП sTock, 159,5 мкл ДМСО, вихря и кратко центрифуге с использованием лабораторной центрифуге.
    3. Инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин. Избегайте конденсации влаги под микроцентрифуге крышкой.
    4. Добавить 200 мкл 1x PBS, 60 мкл 3 М NaOAc (рН 5,2) и 1,5 мл холодного 100% этанола. Приготовьте раствор путем встряхивания и инкубировать при температуре -20 ° С в течение 30 мин.
    5. Центрифуга решение при 20000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и высушить осадок под вакуумом. Избегайте пересушивания.
    6. К высушенному осадку добавляют 400 мкл уреазы запаса и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 часов.
    7. Перенести 200 мкл неочищенного конъюгата в предварительно промытую 100k MWCO центробежной колонке фильтра. Центрифуга колонку при 14000 х г в течение 5 мин.
    8. Перенесите оставшиеся 200 мкл сырого конъюгата в колонку и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин. Удалить столбец и поместите его вниз головой в новый 2,0 мл пробирке ( "коллекторной трубки").
    9. ЦентробежнаяУГЭ отборная труба (с перевернутой колонке) при 1000 мкг в течение 2 мин. Извлеките пробирку для сбора и добавить 30 мкл 1x PBS центробежной колонку для промывки мембраны для дополнительного извлечения конъюгатов.
    10. Еще раз перевернуть колонку и поместить обратно в пробирку. Центрифуга отборная труба (с инвертированным Column) при 1000 х г в течение 2 мин. Снимите и выбросьте колонку.
    11. Хранить UrDNA при температуре 4 ° С до использования.

4. Монтаж EC1 и UrDNA на магнитные шарики

  1. Смешайте магнитный шарик (MB) наличие хорошо и передавать 100 мкл суспензии МБ до 1,5 мл в пробирке. Поместите трубку на микроцентрифуге магнитный держатель стойки для изоляции МБ.
  2. Удалить супернатант с помощью пипетки и добавляют 150 мкл буфера для связывания (BB) к трубе. Снимите трубку из держателя и осторожно нажмите на трубку для ресуспендирования МБ до однородного раствора. Избегайте разбрызгивания суспензии в тОп трубки или колпачка. Если это произойдет, использовать центрифугу для стендовых испытаний на короткое время раскручивать остаток обратно в суспензии.
  3. Повторите шаг 4,2 еще два раза.
  4. К этой суспензии добавляют 10 мкл 10 мкМ EC1. Тщательно перемешать, нажав на трубе.
  5. Выдержите раствор с мягким встряхивания в течение 30 мин. Нажмите пробирку каждые 2-3 мин, чтобы избежать осаждения МБ.
  6. Поместите трубку обратно микроцентрифуге на магнитной стойке, чтобы изолировать МБ и удалить супернатант с помощью пипетки. Вымойте MB три раза с 150 мкл BB (как описано в пункте 4.2).
  7. После промывки завершена, приостановить МБ в общей сложности на 150 мкл ВВ. К этому раствору добавляют 15 мкл UrDNA и нагревают раствор до 45 ° С в течение 2 мин. Охлаждают раствор до комнатной температуры и инкубировать в течение 2 ч.
  8. Поместите трубку обратно микроцентрифуге на магнитной стойке, чтобы изолировать МБ и удалить супернатант с помощью пипетки.
  9. Добавляют 100 мкл реакционного буфера (RB). Удалить тон трубку от микроцентрифуге магнитной стойки и осторожно ресуспендируют MB.
  10. Вымойте MB еще три раза, повторяя шаг 4.9.
    Примечание: промытую надосадочную жидкость можно быстро испытания, чтобы определить, является ли негибридизированным UrDNA по-прежнему присутствует, что может привести к ложному положительному сигналу. Испытание может быть сделано путем добавления 10 мкл 50 мМ мочевины и 10 мкл 0,04% фенола красного в моющем растворе. Продолжайте промывать МБ до тех пор, пока промывной раствор не вызывает изменения цвета. 100 мкл суспензии хранят при температуре 4 ° С до использования.

5. Приготовление бактериальных клеток 20

  1. Культивирование Е. палочки из запасов
    1. Пластина E. палочки K12 (1655) на LB чашки с агаром из глицерина запаса под пламенем или в кабинете биологической безопасности.
    2. С помощью стерильной пипетки, осторожно прикоснитесь к глицерине и слегка полоса, поверхность агаровой пластины, чтобы избежать прокалывания агар LB.
    3. Инвертировать прожилкамипластины и инкубировать при 37 ° С в течение 14 ч.
    4. Уплотнение плита с парафильмом и хранить при температуре 4 ° С в течение не более 3-х недель.
  2. Культивирование Е. палочки для сотового Counting
    1. В стерильной культуральную пробирку объемом 14 мл, дозировать 2 мл LB бульона.
    2. С помощью стерильной пипетки, выбрать одну колонию с прожилками агаром, приготовленным на стадии 5.1, и передать ее в культуральную пробирку.
    3. Инкубируйте культуру при 37 ° С и встряхивают при 230 оборотах в минуту в течение 14 часов.
    4. Серийно разбавить бактериальной культуры в интервалах в 10 раз.
    5. Для каждого разведенного образца, равномерно пластины пять 100 мкл аликвоты на отдельных чашках с агаром LB. Инверсия пластины и инкубировать при 37 ° С в течение 14 ч.
    6. Подсчитайте клетки каждого образца, чтобы получить среднюю концентрацию клеток каждого разведения.
      Примечание: 10 7 клеток часто используются , чтобы создать эталонные бумажка для E. палочка , как этот уровень E. палочка может вызвать быстрый цвет чанGE. Тем не менее, тест выполнен правильно лакмусовой может обнаружить столь же низко как 500 клеток, как описано в разделе Результаты.
  3. Подготовка Е. Клетки палочки для тестирования
    1. Для получения требуемой суспензии клеток, перенос 1 мл культуральной запаса до 1,5 мл в пробирке.
    2. Центрифуга клеток при 6000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
    3. Добавьте 10 мкл реакционного буфера к осадку клеток и клетки вновь суспендируют. Разрушать ультразвуком суспензии клеток в течение 5 мин. Передачи клеточной суспензии в коробку со льдом в течение 5 мин.
    4. Разрушать ультразвуком суспензии клеток в течение еще 5 мин.
    5. Центрифуга клеточной суспензии при 13000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Используйте супернатант для тестирования (10 мкл).

6. лакмусовая бумажка

  1. В 1,5 мл микроцентрифуге пробирку, предварительно промыть трубку путем добавления и встряхиванием 100 мкл реакционного буфера (RB) в пробирке иотбрасывания буфера.
  2. Передача 15 мкл собранной EC1 (протокол 4) к промытым пробирке.
  3. Вымойте магнитные шарики, поместив трубку на микроцентрифуге магнитной стойке. Удалить супернатант с помощью пипетки. Снимите трубку из микроцентрифуге стойки, добавьте 100 мкл РБ и осторожно ресуспендируют магнитные шарики.
  4. Вымойте MB еще два раза, повторяя шаг 6.3.
  5. Поместите трубку обратно микроцентрифуге на магнитной стойке, удалить супернатант и добавить 10 мкл E. Образец палочки получают из стадии 5.3.
  6. Смешайте образец и магнитные гранулы тщательно, осторожно постукивая по пробирке.
  7. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
  8. К реакции добавляют 90 мкл DDH 2 O и поместите трубку на микроцентрифуге магнитную стойку.
  9. Примерно через 3 мин магнитной сепарации, тщательно передачи 85 мкл супернатанта в 0,5 мл микроцентрифужную пробирку. Вывод супернатант медленноВо избежание взимания каких-либо магнитных шариков.
  10. К указанному выше микроцентрифужную пробирку добавляют по 15 мкл 0,04% фенола красного, и 100 мкл раствора субстрата.
  11. Сфотографировать через определенные промежутки времени, чтобы записать изменения цвета.
    Примечание: Изменение рН также можно контролировать с помощью рН-метра с микроэлектродом. Исходное значение рН должно быть приблизительно 5,2-5,5 (раствор желтого цвета). Если нет, то решение может быть отрегулирована путем добавления 1 мМ ацетатного буфера, рН 5,0).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принцип теста с бактериальной лакмусовой объясняется на рисунке 1 Тест использует три основных материалов:. РНК-расщепляющие ДНКзима , который активируется с помощью специфической бактерией, уреазы и магнитных шариков. ДНКзим используется в качестве элемента молекулярного распознавания для достижения высокой специфической детекции бактерии, представляющей интерес. Уреазы и магнитные гранулы используются для достижения трансдукцию сигнала РНК-расщепления активности ДНКзим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перевод действия расщепления РНК - активности бактерии реагирующих ДНКзима к лакмусовой бумажкой стало возможным благодаря использованию уреазы и магнитной сепарации, как показано на рисунке 1. Хотя демонстрация модифицированного лакмусовой бумажкой для бактериального обнаружения является сделано с E. -зависимая палочка РНК-расщепляющие ДНКзима, 5,19,20 конструкция может быть расширена , как правило для любой РНК-расщепляющие ДНКзима. Учитывая большое наличие РНК-расщепляющи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансирование этого исследовательского проекта было предоставлено Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) через грант на открытие для YL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)VWR AMRESCO0105
Гидроксид натрия (NaOH)гранулы BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Трис-основаниеVWR AMRESCO0497
Борная кислотаAMRESCO0588
МочевинаVWR AMRESCOM123
40% акриламид/бисакриламид (29:1) растворBIO BASIC CANADA INC.A0007
СахарозаБиошоп Канада инк.SUC507
Бромфенол синийBioshop Canada inc.BRO777
Ксиленецианол FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% додецилсульфат натрияBioshop Canada inc.SDS001
Соляная кислота (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Хлорид натрия (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Магния хлорид (II) гексагидратVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Аденозинтрифосфат (АТФ)AMRESCO0220
Тригидрат ацетата натрия (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
ЭтанолКоммерческие спиртыP016EAAN
тетраметилентилендиамин (TEMED)AMRESCO0761
10% персульфат аммония (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Сукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Диметилсульфоксид (ДМСО)CALEDON LABORATORIES803540
УреазаSIGMA-ALDRICHU0251
1x Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% Фенол красныйSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 полинуклеотидкиназный реакционный буферLucigen30061-1
10x T4 ДНК-лигаза реакционный буферBio Basics CanadaB1122-B
T4 ДНК-лигаза (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrothAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 полинуклеотидкиназа (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrifugeBeckman Coulter, Inc.
Стеклянные пластиныCBS scientificngp-250nr
Прокладки толщиной 0,75 мм CBSscientificVGS-0725r
12-луночный гребеньCBS ScientificVGC-7512
UVP95-0017-09
Спектрофотометр (NanoVue)GE HealthcareN/A
Металлическая пластинаCBS научныйCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Аппарат для гель-электрофорезаCBS научныйASG-250
Чашки ПетриVWR International25384-342
100 кДа MWCO центробежные фильтрыEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Штатив для магнитной сеперацииNew England BioLabsS1506S
Микрофуге пробиркиSarstedt72.69
Шприцевой фильтр (0.22 μ m)VWR International28145-501
Культуральная пробирка 14 млVWR International60818-725
Инкубатор для клеточных культурEppendorf ScientificM13520000
Branson Ультразвуковой очистительBransonN/A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 мл коническая трубкаVWR International89004-364
392187

Ссылки

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

E colipH

Похожие статьи