Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фагосоме Миграция и скорость, измеренная в живых первичных макрофагах человека, инфицированных ВИЧ-1

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54568

⸱

5 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод измерения скорости движения фагосом к клеточному центру в живых клетках, инфицированных или не инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1, с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии с вращающимся диском для идентификации флуоресцентных инфицированных клеток и светлопольной микроскопии для обнаружения фагосом.

Аннотация

Макрофаги — это фагоцитарные клетки, которые играют важную роль на перекрестке между врожденным и специфическим иммунитетом. Они могут быть инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)-1 и из-за своей устойчивости к его цитопатическим эффектам могут рассматриваться как стойкие вирусные резервуары. Кроме того, ВИЧ-инфицированные макрофаги проявляют дефектные функции, способствующие развитию оппортунистических заболеваний.

Точный механизм, с помощью которого ВИЧ-1 ухудшает фагоцитарный ответ макрофагов, был неизвестен. Ранее мы показали, что поглощение различных частиц макрофагами ингибируется при инфицировании ВИЧ-1. Это ингибирование было лишь частичным, и фагосомы действительно образовывались внутри ВИЧ-инфицированных макрофагов. Поэтому мы сосредоточились на анализе судьбы этих фагосом. Созревание фагосом сопровождается миграцией этих компартментов к центру клетки, где они сливаются с лизосомами, образуя фаголизосомы, ответственные за деградацию проглоченного материала. Мы использовали IgG-опсонизированные эритроциты овец в качестве мишени для фагоцитоза. Для измерения скорости центростремительного движения фагосом в отдельных ВИЧ-инфицированных макрофагах мы использовали комбинацию светло-польной и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Мы разработали метод вычисления расстояния от фагосом до ядра, а затем вычисления скорости фагосом. ВИЧ-инфицированные клетки были идентифицированы благодаря вирусу, экспрессирующему GFP, но этот метод применим к неинфицированным клеткам или любому типу инфекции или лечения.

Введение

Макрофаги играют важную роль во врожденной иммунной системе и в гомеостазе. Это профессиональные фагоциты, которые усваивают и уничтожают патогены и мусор с помощью процесса, называемого фагоцитозом 1,2. Фагосома, замкнутый компартмент, который образуется после поглощения твердого материала, претерпевает ряд событий слияния и деления с эндоцитарными компартментами, что приводит к деградационному компартменту, называемому фаголизосомой. Этот компартмент имеет кислый рН, благодаря приобретению протон-накачающих v-АТФазы, содержит гидролитические ферменты и обогащен лизосомно-ассоциированными мембранными белками (LAMP). Созревание фагосом сопровождается их миграцией по микротрубочкам 3,4 в сторону клеточного центра до достижения перинуклеарного места, где накапливаются лизосомы.

Сообщалось, что многие патогены препятствуют созреванию фагосом, включая бактерии с внутриклеточным образом жизни, которые изменяют вакуолярную среду, в которой они пребывают 5. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1 нацелен на макрофаги в дополнение к Т-клеткам. Поскольку макрофаги устойчивы к цитопатическим эффектам вируса, в отличие от Т-клеток, их можно рассматривать как резервуар для вируса. Кроме того, инфицированные ВИЧ-1 макрофаги проявляют дефектные фагоцитарные функции и способствуют возникновению оппортунистических заболеваний. В частности, тяжелая инвазивная нетифоидная сальмонелла, вызываемая Salmonella Typhimurium ST313, преобладала в течение последних трех десятилетий среди детей и взрослых в странах Африки к югу от Сахары, инфицированных ВИЧ 6. Было подсчитано, что риск развития туберкулеза у людей, живущих с ВИЧ, более чем в 20 раз выше, чем у людей без ВИЧ-инфекции.

По всем этим причинам важно лучше определить молекулярные механизмы, лежащие в основе фагоцитарных дефектов в ВИЧ-инфицированных макрофагах. Мы показали, что поглощение твердого материала, опсонизированных частиц, бактерий или грибков было ингибировано у ВИЧ-инфицированных макрофагов 7. Учитывая, что это ингибирование является частичным, мы приступили к анализу судьбы интернализованных фагосом в ВИЧ-инфицированных макрофагах человека8. Поскольку созревание фагосом тесно связано с миграцией к центру клетки и слиянием с лизосомами, дефект созревания фагосом может быть обусловлен модификациями модальностей транспорта в инфицированной клетке. В описанном здесь методе используются IgG-опсонизированные эритроциты овец (IgG-SRBCs) в качестве модели для нацеливания на рецептор-опосредованный фагоцитоз и, в частности, рецепторы для Fc-части иммуноглобулинов (FcR). Эти частицы легче визуализировать в светлом поле (БТ), чем латексные шарики, поскольку внеклеточные и внутриклеточные СЦП демонстрируют различные свойства преломления 9. Для измерения скорости движения фагосом к ядру у ВИЧ-инфицированных макрофагов мы использовали флуоресцентный вирус 10 и настроили простой метод ручного слежения, который описан здесь. Метод не требует продвинутого программирования и просто использует ImageJ. Он поддается воздействию адгезивных клеток и любого типа частиц или патогенов, которые могут быть визуализированы с помощью микроскопии в светлом поле или с помощью флуоресцентной визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол должен осуществляться в строгом соответствии с национальным и международным законодательством и местными правилами. Кровь от здоровых доноров, которые дали свое согласие сдавать кровь для исследовательских целей, была получена из переливанию центров крови, с которыми институты подписали соглашение. Специальные средства защиты должны быть приняты при использовании человеческой крови. Эксперименты с ВИЧ-1, должны быть выполнены в уровне биологической безопасности 3 или 2 (BSL-3 или 2) Laboratory в соответствии с местным законодательством.

1. Подготовка человеческих моноцитов макрофаги (hMDMs) по плотности градиентное центрифугирование и селекции адгезией

  1. Начнем с свежей крови здоровых доноров (9 мл). Развести весь объем свежей крови стерильной 1х фосфатно - солевым буфером (PBS) без Са 2+ и Mg 2+ , для получения конечного объема 70 мл и осторожно добавить разбавленную кровь в две 50 мл конические пробирки (35 мл на пробирку) , на вершине 15 мл смесиeutral, сильно разветвленные, с высокой массой, гидрофильный полисахарид в растворе уже в каждой пробирке.
  2. Центрифуга обе трубки крови при 537 мкг в течение 20 мин при 20 ° C без тормоза. Затем собирают мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) , содержащихся в пасмурную кольце клеток на границе раздела фаз и перенести их в новый 50 мл пробирку , содержащую 15 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+.
  3. Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при 20 ° С и ресуспендируют осадок в 45 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+.
  4. Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С, вновь суспендируют таблетку в 10 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+, и подсчитывать клетки путем разбавления до окончательного разведения 1/200 в трипановым синим.
  5. Центрифуга клетки при 218 х г в течение 5 мин при 20 ° С и ресуспендируют осадок в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, дополненной 2 мМ L-глутамина и 100 мкг / мл PenicIllin-стрептомицин иметь 7 х 10 6 РВМС на лунку в объеме 2 мл среды в каждую лунку 6 луночного планшета.
  6. Инкубируйте пластин при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 2 часов. Через 2 ч моноциты будет приклеен к пластмассе.
  7. Для того, чтобы позволить свеже-изолированные моноциты дифференцируются в hMDMs, аспирата среду и заменить его на 2 мл hMDM среды (RPMI 1640, 10% decomplemented фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицин), дополненной рекомбинантный человеческий колониестимулирующий фактор макрофагов (RHM-CSF), в конечной концентрации 10 нг / мл.
  8. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 11 дней (Рисунок 1).
  9. На 11-й день удалить среду и промывки 2 раза 2 мл холодной hMDM среды на лунку. Затем промыть каждую лунку 2 раза 1 мл холодной 1x PBS.
  10. Чтобы отделить полностью дифференцированные hMDMs, промойте каждую лунку 1 раз с 1 мл холодной 1x PBS с 2 мМ ethylenediaminetetraacetatic кислоты (ЭДТА) и инкубировать клетки в 2 мл холодной 1x PBS с 2 мМ ЭДТА на лунку в течение 15-60 мин при температуре 4 ° С.
    Примечание: Альтернативные методы для отсоединения существуют клетки (например, трипсин или трипсиноподобной деятельность) , которые могли бы дать хорошие результаты 11.
  11. После того, как отряд (завершенного пипеткой осторожно вверх и вниз в скважине), собирают клетки и поместить их в 50 мл пробирку на льду, содержащую 10 мл холодной hMDM среды.
  12. Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С, вновь суспендируют таблетку в 10 мл холодной hMDM среды, и подсчет клеток путем разбавления 1/20 в трипановым синим.
  13. Семенной клеток в количестве 1 х 10 6 hMDMs на 35 мм микроскопию класса со стеклянным дном тарелки и инкубировать пластин при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 1 дня.

2. Производство и Количественное ВИЧ-1 Вирусные запасов

Примечание: NLR4.3 ВИЧ-1 Gag-iGFP (зеленый флуоресцентный белок), несущий R5-тропные конверт, подарок от М. ШиндльER 10 используют для инфицирования макрофагов и видеть инфицированных клеток в режиме реального времени.

  1. Продуцировать вирусные запасы путем трансфекции клеток эмбриональной почки человека 293T (2 х 10 6 в 100 мм чашку) с 6 мкг соответствующего провирусной ДНК с использованием коммерческого реагента для трансфекции.
  2. Количественно инфекционность вируса натуральной оспы с использованием индикаторных клеток HeLa ПЗМ-бл (несущий ген бета-галактозидазы под контролем LTR HIV-1) с использованием серийных разведений вирусных акций, за которыми следует бета-галактозидазы окрашиванию клеток и подсчета голубые клетки 12.

3. Заражение hMDMs с ВИЧ-1

  1. Добавьте вирус при множественности инфекции (MOI) 0,02-0,03 в 1 мл среды hMDM к hMDMs (посеянных клеток в 1.13). Для того, чтобы контролировать лунки добавляют только 1 мл hMDM среды и инкубировать блюда при температуре 37 ° С с 5% СО 2 в течение 2 -х дней (рисунок 1).
  2. В день 2 мыть клетки с hMDM медНМУ 3 раза и добавляют 1 мл свежей среды hMDM на чашку. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 6 дней (рисунок 1).

4. Опсонизация овец Эритроциты

  1. Для приготовления 7 х 10 6 SRBCs на чашку, промойте SRBCs два раза в 100 мкл раствора , содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS с 1х центрифугированием при 600 х г в течение 4 мин.
  2. Ресуспендируют отмытых SRBCs в 500 мкл 1X PBS / БСА 0,1% кроличьим IgG анти-SRBCs на суб-агглютинации концентрации на 5 мкл SRBCs и инкубировать с вращением при комнатной температуре в течение 30 мин.
    Примечание: Чтобы определить суб-агглютинации концентрации анти-IgG SRBCs, готовят серийные разведения IgG (концентрации акций по 13,1 мг / мл) от 1/50 до 1/25600 в 20 мкл в 96-луночный планшет. Добавить 2 × 10 6 SRBCs в 20 мкл в каждую лунку и положить пластину в темной комнате в течение нескольких часов. Концентрация суб-агглютинированная являетсяразведение скважины непосредственно перед хорошо агглютинации (IgG + SRBCs формирования сети).
  3. После того, как вращение, центрифугировать IgG-опсонированных-SRBCs при 600 х г в течение 4 мин и промывают 100 мкл 1X PBS / БСА 0,1% с центрифугированием при 600 х г в течение 4 мин.
  4. Ресуспендируют IgG-опсонированных-SRBCs в предварительно нагретый среде без фенолового красного RPMI, дополненной 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (1 мл / чашку).

5. Живая Cell видеомикроскопия Фагоцитоз Assay

  1. С помощью конфокальной системы формирования изображения , таких как система , вращающийся диск , снабженный нагревательной камере при температуре 37 ° С с помощью СО 2 проходит через бутылку с водой для увлажнения воздуха.
  2. Включите камеру нагрева до эксперимента, чтобы иметь предметный столик микроскопа при 37 ° C перед началом анализа фагоцитоза. Включите микроскоп и компьютер, и загрузить программное обеспечение визуализации.
  3. Оптимизация параметров обработки изображений, такие как скорость сканирования, Магнификатаион, разрешение и т.д. , чтобы иметь по меньшей мере одну ячейку на поле и изображения по одному кадру каждую минуту от 60 до 120 мин.
    Примечание: В данном случае образец проецируется на один кадр каждую минуту в течение 60 мин с 63x объективом.
  4. Поместите блюдо на изображения столик микроскопа. Отрегулируйте фокусировку и место, чтобы найти только одно целое инфицированных ВИЧ-1 макрофагов в поле. Используйте соответствующие параметры возбуждения / выбросов на основе используемой системы формирования изображения и зонда. Включите канал светлого поля (BF) для наблюдения фагосомах (рис 1II). Оптимизация внешнего вида различных изображений каналов, регулируя процент пропускаемого света и времени экспозиции.
    Примечание: Здесь NLR4.3 ВИЧ-1 Gag-iGFP был возбужден с использованием 491 нм лазер с 50 мс выдержки времени с 20% лазера (рис 1i).
  5. Удалить блюдо изображений и добавить 1 мл ЭБ суспензии при 7 × 10 6 SRBCs / мл на блюдо (рисунок 1).
  6. Центрифуга при 500 мкг в течение2 мин при комнатной температуре, чтобы синхронизировать фагоцитоз, записывать время в конце этого центрифугирования и вернуть блюдо на сцену.
  7. Оптимизация фокусировки и съемки GFP и BF изображения в Z-стеки (по всей толщине ячейки с шагом расстояния 0,3 мкм - как правило, 20 самолетов) каждую минуту в течение не менее 1 ч. Сохраните замедленную видео в родном файле формата используемой системы формирования изображения.
    Примечание: Здесь, покадровой фильмы были сохранены в собственном формате, * .stk файлы.

6. Анализ ЗАМЕДЛЕННАЯ Фильмы

  1. Для редактирования видео, нажмите на выпадающее меню "Приложения" и на вкладке "Обзор многомерные данные" в программное обеспечение для редактирования видео.
    1. Чтобы открыть файл, нажмите на кнопку "Select Base File", а затем на "Select Directory". В "наборы данных" окне выберите приобретение для анализа (на .nd формате) и нажмите на кнопку "View". Данные представлены в виде таблицы с течением времени в колонкуd Z-план в линии.
    2. Для того, чтобы представить инфекцию в Z-проекции (рис 2, левые панели), выберите 491 нм в поле "Wavelengths" и нажмите на вкладку "проекции Z" с "всех плоскостей».
    3. Для анализа временной последовательности, выберите BF длину волны в поле "Длины" и выбрать оптимальную плоскость на Z-оси , чтобы различать внешние SRBCs (рисунок 2, красный Arrowhead), внутренние SRBCs (рисунок 2, красный круг) и ядро ( Рисунок 2, синий круг).
    4. Для сохранения видео монтажи, нажмите на вкладку "Выбор [Х]", а затем на "Load Image (ы)". И, наконец, сохранить загруженные изображения в формате .tif и открывать их рядом на программное обеспечение ImageJ.
  2. Используйте плагин "Manual Tracking" на программное обеспечение ImageJ для измерения положения ядра и различные фагосомах наблюдаемые в BF канала (рисунок 3).
    1. Доуnload "Ручной отслеживания" плагин на веб-сайте ImageJ. На ImageJ, откройте плагин и последовательность изображений для анализа (рисунок 3, шаг 1 и 2).
    2. Введите параметры , такие как "интервал времени" , который представляет количество времени между соседними кадрами, а "х / у калибровки" , которая представляет собой расстояние на пиксель (рисунок 3, стадия 3).
      Примечание: Здесь, сохранить последовательность изображений с временным интервалом 1 мин между каждым кадром и х / у калибровки 0,205 мкм , так как масштабирование 63X и камеру с размером пикселя 6,45 х 6,45 мкм 2 используются.
    3. Чтобы начать отслеживание, нажмите на кнопку "Добавить трек" (рисунок 3, стадия 4) и нажмите на ЭБ центре в первый раз , когда она была усвоена. Следующий кадр появляется автоматически.
    4. Продолжайте нажимать на ЭБ центра во всех кадрах , чтобы иметь различные позиции в течение времени (рисунок 3, пункт 6 в красной коробке).
      1. Начните отслеживать ядро, чтобы иметь свою позицию во всех кадрах, щелкнув по его центру. Далее отслеживать фагосомах (щелкнув по его центру) один за другим, в то время (кадр) их интернализации, различны в зависимости от SRBCs. Для удобства , чтобы увидеть SRBC на BF канале, используйте окно "Яркость и контрастность" во время отслеживания (рисунок 3, шаг 5).
    5. Между каждым ЭБ слежения, нажмите на кнопку "Добавить трек" (рисунок 3, стадия 4) , чтобы иметь новый трек. Номер отслеживания будет изменен во второй колонке, "Трек N °" из таблицы результатов (рис 3, стадия 6).
    6. Сохранение данных в электронной таблице, чтобы перейти к следующему этапу анализа.
  3. Используйте программное обеспечение работы с электронными таблицами для расчета пройденного расстояния фагосомах , содержащих SRBCs к ядру и скорости фагосомах в течение первых 5 мин после интернализации SRBCs (Fi4 цифра).
    1. Откройте электронную таблицу и новый файл электронной таблицы. Переход в этот новый файл только следующие параметры, время, х- и у- координаты ядра и всех SRBCs (рис 4а).
    2. Для того, чтобы вычислить расстояние между SRBCs и ядром только с их координатами, рассмотрим ядро и SRBC в XY-координатной плоскости (рис 4В).
      Примечание: Расстояние между двумя точками является длина пути, соединяющего их. В плоскости, расстояние между ЭБ и ядром дается теоремой Пифагора.
      1. Если с (расстояние между ядром и ЭБ) обозначает длину гипотенузы и а и Ь обозначают длины двух других сторон, выражают теорему Пифагора в качестве Пифагора уравнения:
        figure-protocol-1
        Примечание: В то же время, на ортонррмированными, расстояние по горизонталиа есть (х ядро -х ЭБ) и вертикальное расстояние Ь (у ядра -y ЭБ).
      2. Таким образом, вычислить расстояние между ядром и ЭБ (рис 4A, фиолетовый коробка) путем:
        figure-protocol-2
        Примечание: Умножьте полученное значение расстояния (в пикселях) при калибровке х / у, чтобы расстояние в мкм. Здесь, калибровка х / у составляет 0,205 мкм.
      3. В каждый момент времени, вычесть расстояние между ядром и ЭБ до начального расстояния (рис 4в).
      4. Участок измерения от времени, в течение первых 5 мин. Применить линейный тренд-линии (рис 5А) на участке и определить наклон линейного тренда линией , которая представляет скорость фагосоме к ядру в течение первых 5 мин после ЭБ интернализации.
      5. Разобрать данные для расчета средней и статистическую погрешностьзначения скорости и построить их в соответствующей форме с использованием соответствующего программного обеспечения (Рисунок 5Б).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

FCR-опосредованный фагоцитоз ВИЧ-1-инфицированных и неинфицированных hMDMs описано здесь с использованием IgG-опсонированных SRBCs в качестве модельных целей (Рисунок 1). Критические шаги этого протокола являются подготовка hMDMs и инфекция ВИЧ-1. Действительно, урожайность и качество дифференцированных макрофагов варьирует среди доноров, а также уровень инфекции с КПД в диапазоне 10-40%. Кроме того, препарат IgG-опсонизированного-SRBCs Важно также, чтобы избежать повреж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод имеет несколько важных шагов. Во-первых, подготовка hMDMs и их заражение ВИЧ-1 является критическим, поскольку процент заражения зависит от донора. Следует отметить, что мы решили использовать макрофаги, которые не поляризован в пробирке до инфицирования, поскольку статус макрофагов потенциально , с которыми сталкиваются вируса в естественных условиях не был хорошо охарактеризован до сих пор. Мы проверили экспрессию нескольких поверхностных маркеров, что указывает, что макрофаги не являются ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Джамиля Джубраила за прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 включая докторскую стипендию для GLB) и Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, включая постдокторскую стипендию для CD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Falcon 100 мм TC-обработанная чашка для клеточных культурCorning353003Для вирусного производства
Стеклянные донные тарелки 35 мм без покрытия 1,5MatTek corporationP35G-1,5-14-C КейсДля приобретения
Falcon Tissue Culture Plates 6-луночные ThermoFischer ScientificCorning. Inc. 353934Для моноцитарных макрофагов человека
Ficoll-Plaque PLUSDominique Dutscher17-1440-03нейтральный, сильно разветвленный, высокомассовый, гидрофильный полисахарид в растворе для центрифугирования
плотности DPBS, без кальция, без магнияThermo Fischer Scientific14190-094RT
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, жидкая (с высоким содержанием глюкозы)GIBCO, молекулярные зонды31966-021Консервируется при 4 & град; C ; для культуры клеток
HEK RPMI 1640 среда GLUTAMAX  ДобавкаLife technologies61870-010Законсервирована при 4°С; C; для культуры hMDM
Fœ тал Сыворотка для телят (FCS) EurobioCVFSVF0001Консервация при -20 °° C ; декомплементарный
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fischer Scientific15140-122Консервировано при -20 ° C ; для hMDM культура
RPMI 1640 средняя, без фенола красного (10x 500 мл)Life technologies11835-105Теплый в 37 °° C водяная баня перед использованием; для анализа на фагоцитоз
FuGENE6 Трансфекционный реагентPromegaE2692Консервированный при 4 °°; C ; для производства вирусов
Эритроциты овец (SRBCs)EurobioDSGMTN00-0QКонсервируется в буфере Альсевера при 4 & град; C перед применением
Антиовечьи эритроциты IgGMP Biomedicals55806Консервировано при 4 ° C
Фракция теплового шока сывороточного альбумина крупного рогатого скота, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906Консервация при -20 °°; C
Инвертированный микроскоп DMI600Leica
Конфокальный вращающийся дисковый блок  CSU-X1M1Yokogawa
491 нм 50 мВт лазерCOBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS ОбъективObjectif Leica; Увеличение 100X; Числовая апертура 1,40 ; Погружное масло
CoolSnap HQ2 (FireWire)ФотометрическаяРазмер пикселя 6,45 и микро; м х 6,45 & микро; m ; Определение 1,392 x 1,040 ; Кодирование изображения в программе 14 Bit
Metamorph 7.7.5Молекулярные устройстваДля управления микроскопом
Программа GraphPad Prism Дляанализа статистики
камера

Ссылки

  1. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  2. Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
  3. Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
  4. Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
  5. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  6. Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
  7. Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
  8. Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
  9. Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
  10. Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
  11. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
  12. Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  14. Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

1GFPZ
Фагосоме Миграция и скорость, измеренная в живых первичных макрофагах человека, инфицированных ВИЧ-1
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.