Мы описываем метод измерения скорости движения фагосом к клеточному центру в живых клетках, инфицированных или не инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1, с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии с вращающимся диском для идентификации флуоресцентных инфицированных клеток и светлопольной микроскопии для обнаружения фагосом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фагосоме Миграция и скорость, измеренная в живых первичных макрофагах человека, инфицированных ВИЧ-1
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Макрофаги — это фагоцитарные клетки, которые играют важную роль на перекрестке между врожденным и специфическим иммунитетом. Они могут быть инфицированы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)-1 и из-за своей устойчивости к его цитопатическим эффектам могут рассматриваться как стойкие вирусные резервуары. Кроме того, ВИЧ-инфицированные макрофаги проявляют дефектные функции, способствующие развитию оппортунистических заболеваний.
Точный механизм, с помощью которого ВИЧ-1 ухудшает фагоцитарный ответ макрофагов, был неизвестен. Ранее мы показали, что поглощение различных частиц макрофагами ингибируется при инфицировании ВИЧ-1. Это ингибирование было лишь частичным, и фагосомы действительно образовывались внутри ВИЧ-инфицированных макрофагов. Поэтому мы сосредоточились на анализе судьбы этих фагосом. Созревание фагосом сопровождается миграцией этих компартментов к центру клетки, где они сливаются с лизосомами, образуя фаголизосомы, ответственные за деградацию проглоченного материала. Мы использовали IgG-опсонизированные эритроциты овец в качестве мишени для фагоцитоза. Для измерения скорости центростремительного движения фагосом в отдельных ВИЧ-инфицированных макрофагах мы использовали комбинацию светло-польной и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Мы разработали метод вычисления расстояния от фагосом до ядра, а затем вычисления скорости фагосом. ВИЧ-инфицированные клетки были идентифицированы благодаря вирусу, экспрессирующему GFP, но этот метод применим к неинфицированным клеткам или любому типу инфекции или лечения.
Введение
Макрофаги играют важную роль во врожденной иммунной системе и в гомеостазе. Это профессиональные фагоциты, которые усваивают и уничтожают патогены и мусор с помощью процесса, называемого фагоцитозом 1,2. Фагосома, замкнутый компартмент, который образуется после поглощения твердого материала, претерпевает ряд событий слияния и деления с эндоцитарными компартментами, что приводит к деградационному компартменту, называемому фаголизосомой. Этот компартмент имеет кислый рН, благодаря приобретению протон-накачающих v-АТФазы, содержит гидролитические ферменты и обогащен лизосомно-ассоциированными мембранными белками (LAMP). Созревание фагосом сопровождается их ми....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол должен осуществляться в строгом соответствии с национальным и международным законодательством и местными правилами. Кровь от здоровых доноров, которые дали свое согласие сдавать кровь для исследовательских целей, была получена из переливанию центров крови, с которыми институты подписали соглашение. Специальные средства защиты должны быть приняты при использовании человеческой крови. Эксперименты с ВИЧ-1, должны быть выполнены в уровне биологической безопасности 3 или 2 (BSL-3 или 2) Laboratory в соответствии с местным законодательством.
1. Подготовка человеческих моноцитов макрофаги (hMDMs) по плотности градиентное центрифугировани....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
FCR-опосредованный фагоцитоз ВИЧ-1-инфицированных и неинфицированных hMDMs описано здесь с использованием IgG-опсонированных SRBCs в качестве модельных целей (Рисунок 1). Критические шаги этого протокола являются подготовка hMDMs и инфекция ВИЧ-1. Действительно, урожайность и качество дифференцированных макрофагов варьирует среди доноров, а также уровень инфекции с КПД в диапазоне 10-40%. Кроме того, препарат IgG-опсонизированного-SRBCs Важно также, чтобы избежать повреж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод имеет несколько важных шагов. Во-первых, подготовка hMDMs и их заражение ВИЧ-1 является критическим, поскольку процент заражения зависит от донора. Следует отметить, что мы решили использовать макрофаги, которые не поляризован в пробирке до инфицирования, поскольку статус макрофагов потенциально , с которыми сталкиваются вируса в естественных условиях не был хорошо охарактеризован до сих пор. Мы проверили экспрессию нескольких поверхностных маркеров, что указывает, что макрофаги не являются .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Джамиля Джубраила за прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 включая докторскую стипендию для GLB) и Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, включая постдокторскую стипендию для CD).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Falcon 100 мм TC-обработанная чашка для клеточных культур | Corning | 353003 | Для вирусного производства |
| Стеклянные донные тарелки 35 мм без покрытия 1,5 | MatTek corporation | P35G-1,5-14-C Кейс | Для приобретения |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-луночные Thermo | Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | Для моноцитарных макрофагов человека |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | нейтральный, сильно разветвленный, высокомассовый, гидрофильный полисахарид в растворе для центрифугирования |
| плотности DPBS, без кальция, без магния | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, жидкая (с высоким содержанием глюкозы) | GIBCO, молекулярные зонды | 31966-021 | Консервируется при 4 & град; C ; для культуры клеток |
| HEK RPMI 1640 среда GLUTAMAX Добавка | Life technologies | 61870-010 | Законсервирована при 4°С; C; для культуры hMDM |
| Fœ тал Сыворотка для телят (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Консервация при -20 °° C ; декомплементарный |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Консервировано при -20 ° C ; для hMDM культура |
| RPMI 1640 средняя, без фенола красного (10x 500 мл) | Life technologies | 11835-105 | Теплый в 37 °° C водяная баня перед использованием; для анализа на фагоцитоз |
| FuGENE6 Трансфекционный реагент | Promega | E2692 | Консервированный при 4 °°; C ; для производства вирусов |
| Эритроциты овец (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Консервируется в буфере Альсевера при 4 & град; C перед применением |
| Антиовечьи эритроциты IgG | MP Biomedicals | 55806 | Консервировано при 4 ° C |
| Фракция теплового шока сывороточного альбумина крупного рогатого скота, pH 7, ≥ 98% | Sigma | A7906 | Консервация при -20 °°; C |
| Инвертированный микроскоп DMI600 | Leica | ||
| Конфокальный вращающийся дисковый блок CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 нм 50 мВт лазер | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Объектив | Objectif Leica | ; Увеличение 100X; Числовая апертура 1,40 ; Погружное масло | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) | Фотометрическая | Размер пикселя 6,45 и микро; м х 6,45 & микро; m ; Определение 1,392 x 1,040 ; Кодирование изображения в программе 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 | Молекулярные устройства | Для управления микроскопом | |
| Программа GraphPad Prism Для | анализа статистики |
Ссылки
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
