Методическая статья

Эффективная спороношение Saccharomyces CEREVISIAE В 96-луночные Format

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 сентября 2016 г.

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь проводится спороношение Saccharomyces cerevisiae в формате 96 multiwell.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время пищевого стресса Saccharomyces cerevisiae подвергается гаметогенезу, известному как спороношение. Диплоидные дрожжевые клетки, которым не хватает азота и углерода, инициируют процесс спорообразования. Процесс спороношения включает в себя мейоз с последующим образованием спор, когда гаплоидные ядра упаковываются в споры, устойчивые к окружающей среде. Мы разработали методы эффективного спорообразования почковающихся дрожжей в 96 многолуночных планшетах для увеличения пропускной способности скрининговых дрожжевых клеток на фенотипы спорообразования. Эти методы совместимы со скринингом дрожжевых плазмид, требующих отбора питательных веществ, когда используется соответствующее минимальное количество сред, или со скринингом дрожжей с геномными изменениями, когда используется богатый режим преспоруляции. Мы обнаружили, что для этого метода аэрация во время спорообразования имеет решающее значение для образования спор, и разработали методы для обеспечения достаточной аэрации, совместимые с форматом 96 многолуночных планшетов. Несмотря на то, что эти методы не позволяют достичь типичного ~80% уровня спорообразования, который может быть достигнут в экспериментах с использованием колб большого объема, эти методы позволят надежно достичь около 50-60% уровня спороношения в многолуночных планшетах малого объема.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спороношение в почкующихся дрожжей было изучено , чтобы дать представление о многих аспектах биологии, в том числе контроль сегрегации хромосом во время мейоза 1, механизмы генетической рекомбинации 2, контроль развития клеткой сигнализации 3, питательная контроль развития 4, транскрипционный регулирование развития 5, а также рассмотрение спорообразования 6. Спорообразование включает новое событие деление клеток , предусматривающий создание новых мембранных отсеков внутри материнской клетки с последующим нанесением защитного споровой стенки 6. Эти исследования , которые исследуют спорообразующих клеток часто используют быстро спорообразующих штамма дрожжей SK1, который может пройти процесс спорообразования примерно 24 ч в относительно эффективным способом 7,8. Хотя оптимизация условий спорообразования для почкующихся дрожжей были описаны 9-13, это экспериментs исследовали споруляции на твердой среде или в более крупных жидких культурах, где споруляция осуществляется с использованием культуры трубок или колб.

Здесь мы опишем метод спорообразующих дрожжей в многоямного формате пластины 96. Мы считаем, что для этого метода, аэрация имеет решающее значение для синхронного и эффективного споруляции, и разработали методы, чтобы обеспечить достаточное количество споруляцию малого объема многоямный формат. Спорообразующих в формате 96 многоямный пластины позволяет клеткам быть подвергнуты скринингу с использованием методов с высокой пропускной способностью и реагенты , оптимизированные для многоямного формата пластины, такой скрининг для высоких супрессоров копирования с использованием черепичную библиотеки 14-16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка к споруляцией

Примечание:. Средства массовой информации , описанные в этом протоколе выполнены с использованием стандартных рецептов и методов 13,17 Таблица 1 дает формулировку 1 л различных носителей , используемых в данном протоколе.

Бакто пептон Экстракт дрожжей Бактоагар Декстроза ацетат калия глицерин DDH 2 O
YPG пластины 20 г 10 г 20 г - - 30 мл 970 мл
YPD пластины 20 г 10 г 20 г 20 г - - 1000 мл
YPD жидкость 20 г 10 г - 20 г - - 1000 мл
YPA жидкость 20 г 10 г - - 20 г - 1000 мл
споруляцией СМИ - - - - 10 г - 1000 мл

Таблица 1:. СМИ составы Суммы указаны за 1 л СМИ. Особенности о средствах массовой информацииингредиенты можно найти в таблице материалов.

  1. Если все спорообразующих клетки будут же генотипа, выполните следующие действия:
    1. Оттепель штамм дрожжей, которые будут использоваться на (в) YPGlycerol пластины YPG. Grow дрожжи в течение 12-16 ч при 30 ° С. Важно отметить, что клетки SK1 также готовы образуют споры, так SK1 штаммы не должны оставаться слишком долго на YPG пластин, или же они могут образуют споры на пластине.
      Примечание: Свеже размораживают штамм выращивали на YPG является предпочтительным, поскольку использование глицерина в качестве источника углерода требует окислительного фосфорилирования, и, таким образом, выбирает для клеток, которые имеют функциональную митохондриальную ДНК. SK1 клетки имеют тенденцию терять функциональную митохондриальную ДНК и стать Petites. Функциональная митохондриальной ДНК необходима для споруляции.
    2. Streak дрожжи из YPG пластины на А (YPDextrose) пластины YPD для отдельных колоний. Grow дрожжей на YPD пластины 24-28 ч при 30 ° С.
    3. Примерно через 36-48 ч роста на YPD твердых средах, начать 25 мл YPD культуру, используя одну колониюот YPD пластины. Grow эту культуру , пока клетки около OD 600 = 4.0 до 7.0. Выполните этот шаг при 30 ° C в течение ночи в шейкере инкубаторе, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
    4. Из культуры YPD, используют соответствующее количество клеток , чтобы начать 1000 мл YPA (YPAcetate) культуры , что составляет ОД 600 = 0,1 для каждой потребности 96 - луночный планшет в разделе 2. Grow дрожжи в качалке инкубаторе 30 ° C (встряхиванием при 220 оборотов в минуту) до культуры OD 600 составляет от 1,3 до 1,5.
      Примечание: инокуляции 100 мл YPA культуры для каждого 96 многоямного пластины быть подвергнуты скринингу в разделе 2. Например, если скрининг четыре 96 луночные планшеты, потребуется 400 мл YPA культуры. Начиная с 10% дополнительного объема в культуре YPA необходимо защитить от испарительного потери объема. Как правило, это займет от 12-16 ч для клеток , чтобы достичь соответствующего OD 600; количество времени может варьироваться в зависимости от генотипа штамма дрожжей. YPA является presporulation СМИ. Pregrowthв ацетат помогает индуцируют экспрессию генов (например, IME1) , необходимые для эффективного и синхронного споруляцией 6.
    5. Спин на 1,800 XG в центрифуге таблицу в течение 5 мин, чтобы осадить клетки, выращенные в YPA. Мыть клетки 1x 0,5 объема стерильной автоклавного деионизированной воды. Спин снова, и выбросьте мыть. Ресуспендируют клеток в 1x объем споруляции СМИ. Продолжить в разделе 2.
  2. При использовании клеток для спорообразования , которые имеют разных генотипов (т.е. трансформированные с различными плазмидами или содержащие различные мутации, как правило , полученные и сохраненные в виде замороженных запасов), клетки массива различных генотипов в 96 многоямного формате. Затем выполните следующую процедуру:
    1. Используйте стерильный 96 зубца Frogger для переноса клеток из размороженных замороженных запасов в 96 многоямного пластины (ы) на YPG твердых средах. Grow дрожжей в течение ночи при 30 ° C.
    2. Используя стерильный 96 зубца Frogger, перенесите клетки от YPG твердых сред на YPD твердых средах или селективныйтвердые среды (т.е. синтетические минимальные средства массовой отсутствуют аминокислоты, если клетки содержат плазмид , которые требуют выбора). Grow дрожжей при температуре 30 ° С до образования колоний для каждого штамма, как правило, 1 день на YPD и 2 дня, если селективную среду необходимо.
    3. Аликвоты 1,2 мл YPD жидких сред или селективных жидких средах в каждую лунку 96 глубоких 2 мл многоямного пластины. Передача клетки из твердых носитель в жидких средах с использованием Frogger, крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты, и расти в течение ночи в 30 ° C шейкере, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
      Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму загрязнение, Накладки с использованием пластиковых крышек из прямоугольного чашку Петри. Держите крышки на месте с помощью куска ленты, так что циркуляция воздуха минимально ограничено.
    4. Центрифуга планшеты при 1800 мкг в течение 5 мин, используя Бакет центрифугу с адаптерами для размещения 96-луночные планшеты. Слить носитель из клеток; добавить 500 мкл YPA в каждую лунку и ресуспендируют осажденные клетки в YPA. Обложкас пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты.
    5. Рост клеток в течение 15 часов при 30 ° C в инкубаторном шейкере, встряхивая при 220 оборотах в минуту. Продолжить в разделе 2.

2. спорообразующих клетки в 96-луночные Format

  1. Добавить либо одну 3 мм стерильной твердой стеклянной бусинки или стерильном 5 мм х 2 мм магнитной мешалке в каждую лунку 96-луночного планшета с 1,3 мл лунки. (См Представитель Результаты ниже для обсуждения вопроса о том , чтобы использовать шарик или мешалку.)
  2. Если все клетки должны быть экранированные одного и того же генотипа, перейдите к 2.2.1. Если клетки должны быть экранированные имеют различные генотипы, перейдите к 2.2.2.
    1. Возьмем клетки от этапа 1.1.5 и аликвоты 500 мкл клеток плюс средства массовой информации в каждую лунку 96-многоямного пластины. Крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты. Перейдите к разделу 2.3.
    2. Спин клетки, которые находятся в YPA из 1.2.4 при 1,800 мкг в течение 5 мин, используя Бакет центрифугу с адаптерами для размещения 96-луночных планшетах. застыванияе СМИ из клеток. Добавьте 500 мкл спорообразования сред в каждую лунку и ресуспендируют осажденные клетки в спорообразования средах. Крышка с пластиковой крышкой удерживается на месте с помощью ленты. Перейдите к разделу 2.3.
  3. При использовании стеклянного шарика, поместите образцы в шейкере инкубаторе при температуре 30 ° C и трясти при 220 оборотах в минуту для споруляции. При использовании магнитной мешалке, место образцы на мешалке внутри 30 ° C инкубатор для споруляции.
    Примечание: Точная скорость размешать для магнитной мешалки баров не очень важно, до тех пор, как все бары двигаются энергично и культура аэрацию.
  4. Для того, чтобы следить за развитием через споруляцией, вывести образцы из спорообразующих культуры для визуализации, добавить 6 мкл клеток от спорообразующих культур до 24 мкл спорообразования сред в 96 хорошо покровного пластины (разведение 1: 5). Оставьте клетки урегулировать в течение 5 мин перед исследованием клеток с использованием инвертированного микроскопа.
    Примечание: В sk1 клетках дикого типа, компактные созревшие споры образуют на 36 часов после передачи в спорообразования СМИ. Прогрессирование через споруляцией можно контролировать с помощью микроскопии с использованием флуоресцентных маркеров, таких как ядерный маркер (т.е. Htb2-mCherry 18) для изучения деления мейоза или prospore мембранный маркер (то есть, 19 G20) , чтобы исследовать спорами морфогенез. В качестве альтернативы, образование рефрактильных спор можно увидеть с помощью Nomarski DIC микроскопии начиная примерно 12 ч после переноса в спорообразования средах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки этого протокола, эффективность споруляции , полученные из спорообразующих клеток в луночные планшеты (как описано выше) по сравнению с клетками спорулированных с использованием больших объемов в колбы (таблица 2). Использование луночные планшеты не достичь высокой эффективности, которая видна при спорообразующих в колбах, где эффективность ~ 80% может регулярно видеть. Спорообразующих в луночные планшеты с надлежащей аэрации (при условии, стеклянными бусами ил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим протокол для спорообразующих SK1 дрожжей в 96 многоямного формате. Аэрация является ключевым фактором для эффективной споруляции, что требует использования либо мешалкой или стеклянного шарика в каждую лунку. Когда клетки спорообразования в 96 многоямного пластины в шейкере инкубаторе без либо шарике или мешалкой, клетки не образуют споры эффективно. Лишь небольшое увеличение эффективности спорообразования наблюдается , когда клетки спорообразования без либо шарике или мешалкой в качалке инкубаторе, по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Джозеф П. Хили из Университета штата Массачусетс Бостон (LSH) и R15 GM86805 из NIH (LSH). SMP поддерживается частично посредством Sanofi-Genzyme стипендий в Университете штата Массачусетс в Бостоне.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Nunc 1,3 мл DeepWell PlatesThermoScientific260251Используется для спорообразования
Nunc 2,0 мл DeepWell platesThermoScientific278743Используется для роста до спороношения, шаг 1,2,3
мм Стеклянная бусина Fisher11-312AИспользуется для спорообразования
5 мм x 2 мм перемешивание, упаковка 12шт. Fisher14-511-82Используется для спорообразования
96 ну, лягушкаV& P ScientificVP407необходим для шага 1.2
библиотечного копировщикаV& P ScientificVP381необходим для этапа 1.2; для использования с
прямоугольной чашкой Петритребуется ThermoScientific264728для этапа 1.2
Bacto PeptoneBD211677необходим для среды
Дрожжевой экстрактBD212750необходим для среды
Bacto AgarBD212750необходим для среды
DextroseFisherD16-3нужен для среды
Ацетат калияFisherP171-500нужен для среды
ГлицеринFisherG33-500нужна для среды
Черная 96 лунка стеклянная нижняя пластинаMatTekPBK96G-1.5.5-Fнужна для шага 2.4
3 для лягушки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Saccharomyces cerevisiae96

Похожие статьи