Методическая статья

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем мышиную модель гематоэнцефалического барьера in vitro, которая использует импедансную клеточную спектроскопию, уделяя особое внимание влиянию на целостность и проницаемость эндотелиальных клеток при взаимодействии с активированными Т-клетками.

Аннотация

Разрушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) является критическим этапом в развитии аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС) и его экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Этот процесс характеризуется трансмиграцией активированных Т-клеток через эндотелиальные клетки мозга (ЭК), основные составляющие ГЭБ. Тем не менее, влияние на функцию ЭК мозга при взаимодействии с такими Т-клетками в значительной степени неизвестно. В данной работе мы описываем анализ, который позволяет оценить первичную функцию микрососудистого EC мозга мыши (MBMEC) и целостность барьера во время взаимодействия с Т-клетками с течением времени. В анализе используется импедансная спектроскопия, мощный инструмент для изучения целостности и проницаемости монослоя EC, путем измерения изменений трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и емкости клеточного слоя (Ccl). При непосредственном контакте с ЭК стимулированные, но не наивные Т-клетки способны индуцировать дисфункцию монослоя ЭК, что визуализируется снижением TEER и увеличением Ccl. Анализ непрерывно и автоматически регистрирует изменения целостности монослоя EC. Он достаточно чувствителен, чтобы различать различную силу стимулов и уровни активации Т-клеток, а также позволяет исследовать последствия целенаправленной модуляции взаимодействия Т-клеток с ЕС с использованием широкого спектра веществ, таких как антитела, фармакологические реагенты и цитокины. Этот метод также может быть использован в качестве контроля качества целостности EC в анализах трансмиграции Т-клеток in vitro. Эти приложения делают его универсальным инструментом для изучения свойств ГЭБ в физиологических и патофизиологических условиях.

Введение

Гематоэнцефалический барьер отделяет системный кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) , 1 - 3. Она обеспечивает физический барьер, который препятствует свободному движению клеток и диффузии водорастворимых молекул и защищает мозг от патогенов и потенциально опасных веществ. В дополнение к барьерной функции, ГЭБ обеспечивает доставку кислорода и питательных веществ к паренхиме головного мозга, что обеспечивает надлежащее функционирование нервной ткани. Функциональные свойства ГЭБ высоко регулируются его клеточных и межклеточных компонентов, с узкоспециализированными КЭ является ее основным структурным элементом. КЭ ГЭБ характеризуются наличием плотного контакта (TJ) комплексов, отсутствие фенестраций, крайне низкой пиноцитозные активностью и постоянно активных транспортных механизмов. Другие компоненты ВВВ базальная мембрана EC, перицитов вложения эндотелий, астроцитов концевые ноги и = ассоциированных парenchymal базальная мембрана также внести свой вклад в развитие, поддержание и функции ВВВ 2,4 - 6 и, вместе с нейронами и микроглии, образуют сосудисто - нервный узел (НВУ), что позволяет надлежащее функционирование ЦНС 7 - 9.

В различных неврологических заболеваний, таких как нейродегенеративные, воспалительные или инфекционные заболевания, функция ГЭБ скомпрометирован 2,5,10. Дисрегуляция TJ комплексов и механизмов молекулярных транспорта приводит к повышению проницаемости ГЭБ, лейкоцитов, воспаление и повреждение нейронов. Для изучения свойств ГЭБ при таких патофизиологических условиях, различные модели в пробирке ВВВ были установлены 9,11,12. Вместе они предоставили ценную информацию о изменениях целостности барьера, проницаемости, а также транспортных механизмов. Эти модели используют эндотелиальные клетки человека, мыши, крысы, свиньи или бовечьего происхождения 13 - 18; Первичные эндотелиальные клетки или клеточные линии культивируют либо в виде монокультуры или вместе с перицитов и / или астроцитов, чтобы более точно имитировать ГЭБ в естественных условиях 19 - 25. В последние годы, измерение трансэндотелиальном электрического сопротивления (Тир) стала широко распространенным инструментом для оценки эндотелиальной барьерных свойств 26,27.

TEER отражает полное сопротивление ионного потока через клеточный монослой и его снижение обеспечивает чувствительное измерение целостности эндотелиальной скомпрометированы барьера и, следовательно, повышенной проницаемости. Различные системы измерения Teer были разработаны, в том числе эпителиальной Voltohmmeter (EVOM), электрический Cell-подложка импеданса зондированию (ВЕ) и клеточного анализа в реальном масштабе времени 15,28 - 30. TEER отражает сопротивление потока ионов между соседними КЭ (парацеллюлярная маршрута) и прямо пропорциональнацелостности барьера. В импедансной спектроскопии 27,31, комплексное полное сопротивление (Z) измеряется, которая обеспечивает дополнительную информацию о целостности барьера путем измерения CCL. Ccl относится к емкостной ток через клеточную мембрану (трансцеллюлярного маршрут): Клеточный слой действует как конденсатор в эквивалентной электрической цепи, разделяющей заряды на обеих сторонах мембраны и обратно пропорционален целостности барьера. При выращивании на проницаемые вставок, КЭ прилипать, пролиферируют и распространяются на микропористой мембраны. Это противодействует фоновый емкостного тока вставки (который сам по себе действует как конденсатор) и приводит к уменьшению емкости до тех пор, пока не достигнет своего минимального уровня. За этим следует путем создания TJ комплексов, которые перекрывают пространство между соседними КЧС. Это ограничивает поток ионов через маршрут парацеллюлярной и ТЭЭУ увеличивается, пока не достигнет своего плато. При воспалительных процессах, однако, endotheliаль барьер скомпрометирована: TEER уменьшается по мере TJ комплексы получают нарушается и Ccl возрастает по мере емкостной составляющей вставки снова поднимается.

Наше измерение TEER использует автоматизированную систему мониторинга ячейки 32: он следует принципу импедансной спектроскопии и расширяет свои предыдущие приложения. Здесь мы опишем экстракорпорального ВВВ модели в том , что позволяет исследовать барьерных свойств, в том числе взаимодействие мозга эндотелий с иммунными клетками; в частности, активированных Т-клеток. Такие патофизиологических условиях наблюдаются при аутоиммунных заболеваниях центральной нервной системы , таких как рассеянный склероз и его модели для животных экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита 33 - 37. Здесь решающим шагом является трансмиграция энцефалитогенных, миелин-специфических Т-клеток через ВВВ. Это сопровождается их реактивации в периваскулярной пространстве и вступление в паренхиме головного мозга, где они принимают на работу других иммунных клеток и меняственной воспаления и последующего демиелинизация 1,35,38. Однако молекулярные механизмы взаимодействия таких Т-клеток и эндотелиальных клеток, основными составляющими ГЭБ, не до конца понятны. Наш протокол призван восполнить этот пробел и дать новое понимание последствий на эндотелиальных клетках (то есть, целостность барьера и проницаемости) при их непосредственном контакте и взаимодействии с комплексным активированными Т - клетками.

Протокол, описанный здесь, использует первичный мозга мыши микрососудистой эндотелиальных клеток, выращенных в виде монослоя на проницаемых вставках с микропористым мембранам. Эндотелиальные клетки культивировании совместно с CD4 + Т - клеток, которые могут быть предварительно активированными либо поликлонально или в моде антиген-специфической. Совместное культивирование MBMECs с предварительно активированные, но не наивным Т-клеток индуцирует снижение TEER и увеличение в БКК, которая обеспечивает количественную меру дисфункции и разрушения барьера MBMEC. техникаявляется неинвазивным: он использует встроенный вместо Chopstick электродов, которые предотвращают серьезное нарушение общественного порядка монослоя ЕС; он может быть использован для мониторинга барьерной функции без использования клеточных маркеров. Это делает непрерывные измерения в автоматическом режиме и позволяет провести независимую оценку двух параметров барьера (Тир и CCL) одновременно с течением времени. Этот метод также достаточно чувствителен, чтобы различать разные уровни активации Т-клеток и эффектов таких Т-клеток на КЧС.

Он может быть использован в широком диапазоне функциональных анализов: различные цитокины и / или хемокины замешанные в воспалительных процессах могут быть добавлены к совместной культуре MBMECs и Т-клеток; можно использовать блокирующие антитела против молекул клеточной адгезии либо на ЕС или стороне Т-клеток; и ингибиторы маркеров активации Т-клеток или их цитолитического свойств могут быть добавлены во время примирования Т-клеток или их совместном культивировании с КЧС. Анализ также полезен для Т-клеток переселенииАнализы, так как он может служить в качестве контроля качества целостности монослоя MBMEC перед добавлением Т-клеток. Все это делает этот метод универсальный и надежный инструмент для изучения ГЭБ в пробирке, с акцентом на эффекте активированных Т - клеток на целостность монослоя EC. Это имеет особое значение для понимания механизмов нарушения ГЭБ в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как MS и его животной модели EAE, где самореактивными, энцефалитогенных Т-клетки проникает через ГЭБ и вызывать воспаление и повреждение нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для всех экспериментов мышей разводили и поддерживали под конкретного патогена условий в центральном виварии в Университете Мюнстера, в соответствии с немецкими руководящими принципами для ухода за животными. Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике экспериментальных животных и одобрены местными властями земли Северный Рейн-Вестфалия, Германия (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Выделение и культура

Примечание: Изолировать MBMECs , как описано выше в деталях 14 со следующими изменениями:

  1. Жертвоприношение 20 взрослых мышей C57BL / 6 (6-8 недель) с помощью CO 2 ингаляции и подтвердить их смерть и установления сердечной остановки дыхания.
  2. Ополосните мышь с 70% этанола и обезглавить его с помощью ножниц; удалить кожу головы с помощью пинцета и ножниц. Сделайте надрезы на левой и правой стороне черепа, начиная от затылочного отверстия. Поднимите череп с его стороны хвостового и Takе из головного мозга с пинцетом.
  3. Под капотом ламинарного потока, используйте стерильного пинцета поместить мозг в чашку Петри и удалить ствол мозга, мозжечок и таламус, сохраняя только кору головного мозга.
    Примечание: Использование микроскопа не является необходимым для любого из этих шагов.
  4. Поместите корку на кусок стерильной Вестерн-блоттинга бумаги и раскатайте его осторожно пинцетом до тех пор, пока Оболочек больше не видны.
  5. После механического и ферментативного расщепления ( в соответствии с протоколом 14), собирают эндотелиальные клетки от градиента плотности с помощью длинной, стерильной иглой и 5 мл плунжера. Эндотелиальные клетки появляются в мутном слое над красным кольцом с эритроцитами. Передача 20-25 мл этого слоя в новый 50 мл центрифужную пробирку; долить трубку с DMEM.
  6. После двух циклов промывки 14, клетки вновь суспендируют в 6 мл среды , содержащей пуромицин MBMEC (4 мкг / мл) и семя их на шесть лунок 24-луночного планшета; оставить их в тканикультура инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 (упоминается как 'инкубаторе' , начиная с) в течение трех дней.
    Примечание: Для получения дополнительной информации раствора покрытия MBMEC см Материалы табл.
  7. Изменение среды путем добавления 1 мл в каждую лунку свежей MBMEC среды без пуромицин; положил пластину обратно при 37 ° С и 5% CO 2 в течение еще двух дней.

2. Заготовка MBMECs

  1. На пятый день после MBMEC изоляции, предварительно пальто проницаемые вставки с MBMEC раствором для нанесения покрытия: добавить 80 мкл раствора на вставку и оставить их при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 часов.
  2. Тщательно пипеткой из раствора для покрытия, и пусть Вставки высушенного на воздухе в течение 30 мин. Добавить 2 мл комнатной температуре (RT) PBS в каждую лунку планшета, используя MBMECs мыть среды; повторите этот шаг. Добавить 0,05% трипсин-ЭДТА (300 мкл на лунку) и оставить пластину в инкубаторе в течение 5-10 мин.
  3. Добавляют 2 мл MBMEC среды в каждую лунку, чтобы остановитьтрипсинизации. Передача собранных клеток в 15 мл центрифужную пробирку и в отцентрифугированы при 700 х г в течение 8 мин при 4 ° C. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл среды MBMEC без пуромицин.
  4. Граф клеток; смешать 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл 0,04% трипановым синим (10x разведения клеток). Внесите 10 мкл этой смеси между стеклянной крышкой и счетной ячейки камеры (гемоцитометра). Граф Трипановый Blue-свободных ячеек во всех четырех квадрантах камеры (N) и определяют среднее число подсчитанных клеток (N ') следующим образом: N' = N / 4.
  5. Вычислить концентрацию клеток (в 10 6 клеток / мл) , используя следующую формулу: C = N 'х 10 4 х 10, где 10 4 задается размерами гемоцитометра и 10 коэффициент разбавления с шага 2.4.
  6. Затравочного монокристалла 2 х 10 4 клеток в объеме 260 мкл на вставку. Добавьте 810 мкл среды MBMEC в нижнем отсеке каждой лунки, Поместите пластину со вставками в инкубаторе до готовности приступить к разделу 4.
    Примечание: Объемы для верхнего и нижнего отсека являются вставки конкретных и не работают для всех форматов 24-а.

3. CD4 + T Выделение клеток и стимуляция

  1. CD4 + Т - клеток изоляции
    1. Жертвоприношение одного взрослого мышь (6-8 недель) с помощью CO 2 ингаляции и подтвердить свою смерть от установления сердца и остановка дыхания.
    2. Поместите мышь на спине на чистую рассечение борту и промыть его 70% -ным этанолом; использовать стерильные ножницы и пинцет, чтобы открыть брюшины и удалить селезенку и лимфатические узлы (паховые, подмышечные, плечевое и шейки матки); И, наконец, перевести ткани в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 5 мл PBS на льду.
    3. Под капотом ламинарного потока, переноса ткани путем декантации PBS с тканью в центрифужную пробирку объемом 50 мл с ситом клеток на вершине 70 мкм; гомогенизироватьткань, нажав на нее с 1 мл плунжером через сито.
    4. Добавьте 30 мл FACS буфера и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и клетки вновь суспендируют в 10 мл буфера FACS. Суспензию фильтруют через сито 40 ячейки мкм, добавляют еще 20 мл буфера FACS в пробирку.
    5. Центрифугируйте при 500g в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 500 мкл буфера FACS.
    6. Добавьте 20 мкл мыши CD4 магнитных микрогранул, хорошо перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Добавьте 25 мл FACS буфера и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    7. В то же время, поместите разделительную колонку LS в магнит и промойте его с 3 мл буфера FACS. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 3 мл буфера FACS.
    8. Добавить клетки в колонну. Промыть колонку с 3 мл FACS буфера три раза. Удалить столбец из магнита и поместите его на новый Centri 15 млfugation трубки. Добавляют 5 мл буфера FACS, вымывать меченые клетки с плунжером колонку и центрифугируйте при 500 мкг в течение 5 мин 4 ° C.
    9. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 3 мл среды Т-клеток. Граф клеток , как описано в 2.4 и семени 1 × 10 5 клеток в 100 мкл среды на лунку.
  2. CD4 + Т - стимуляции клеток
    1. Стимуляция поликлональных CD4 + Т - клеток
      1. Предварительное покрытие с круглым дном 96-луночный планшет с очищенным анти-мышиного CD3-антителом (клон 145-2С11) в PBS, при желаемой конечной концентрации. Например, для предварительного покрытия полная пластина с альфа-CD3 при 1 мкг / мл, смешивают 10 мкл антитела (концентрация запас = 0,5 мг / мл) с 5 мл PBS, вихря и добавляют 50 мкл смеси для каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
      2. Оставьте пластину в инкубаторе в течение 3 часов. После выделения Т-клеток, мыть пластины с предварительным покрытием в два раза с PBS. Добавить очищенные анти-CD28-антитела (клон37,51) к изолированным Т - клеток в желаемой конечной концентрации (например, при концентрации 1 мкг / мл); хорошо перемешать. Семенной Т-клетки, и оставить их в инкубаторе в течение двух-трех дней.
    2. Антиген-специфическая стимуляция клеток CD4 + T с дендритные клетки (ДК)
      Примечание: Если контроллеры домена используют в качестве антиген-представляющих клеток (АРС), следовать протоколу для изоляции Т-клеток, со следующими исключениями:
      1. Перед гомогенизацией селезенку, вводят его с 1 мл коллагеназы типа IA в PBS при 0,5 мг / мл и переносят его в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      2. Инкубировать в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 15 мин. После промывания PBS, ресуспендируют осадок в буфере FACS и добавить 20 мкл мышь CD11c магнитных микросфер, вместо CD4 микрошарики.
      3. Используйте разделительную колонну МС и соответствующие объемы: полоскание колонку с 1 мл буфера FACS; Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера FACS и колонку промывают 1 мл FACS буфера в три раза.
      4. Объявлениеd антиген выбора для контроллеров домена (например, миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG) аа 35-55 при 20 мкг / мл), хорошо перемешать и семя 5 × 10 4 клеток в 100 мкл Т клеточной культуральной среды на 96-раундовом-низ- Что ж.
      5. Добавить 1 × 10 5 Т - клеток в 100 мкл Т клеточной культуральной среды на 96-круглым дном-колодца в конце, как описано в Протоколе для Т выделения клеток.
    3. Антиген-специфическая стимуляция CD4 + Т - клеток с В - клетками
      Примечание: Если В-клетки используются в качестве АРС, следовать протокол для изоляции Т-клеток, со следующими исключениями:
      1. Используйте селезенок от трансгенных мышей, B - клетки являются антиген-специфические (например, IgH MOG (Th) мышей, чьи B - клетки специфически распознают MOG 35-55).
      2. Используйте антиген-специфические Т - клетки (например, от TCR MOG (2D2) мышей). Добавьте 20 мкл мыши CD19 магнитных микросфер вместо CD4 микрошарики.
      3. Добавляют выбранного антигена к B CELLs (например, MOG 35-55 при 20 мкг / мл), хорошо перемешать и семя 5 × 10 4 клеток в 100 мкл B клеточной культуральной среды на 96-круглым дном, хорошо.
      4. Добавить 1 × 10 5 Т - клеток в 100 мкл Т - клеточной культуральной среды на 96-круглым дном, хорошо, как описано в протоколе для выделения Т - клеток.

4. Настройка и измерение Выполнение Teer

  1. Поместите модуль 24-луночного прибора Тир под капотом ламинарного потока. Снять крышки и место вставки с MBMECs в приборе с помощью щипцов.
  2. Пипетировать 810 мкл свежей среды в нижний отсек модуля скважин: добавить его тщательно между вставкой и стенкой модуля скважины.
  3. Закройте крышки и поместите прибор в инкубатор. Подключите прибор к своему компьютеру; включите контроллер прибора и откройте программное обеспечение.
  4. Выберите 'новое измерение' в всплывающем окне. Ческ 'шоу TEER' и коробки 'Show CCL'; затем нажмите кнопку "Старт". После завершения первого измерения, выберите "проверить все ячейки" на вкладке "Результаты", чтобы увидеть все значения Тир и CCL.
  5. Сохраните файл: Файл> Сохранить как> 'имя файла'.
    Примечание: Как TEER и Ccl непрерывно измеряются в автоматическом режиме, контролировать свои ценности в течение трех-пяти дней. Изменение среды не является необходимым, если жизнеспособность клеток не является неоптимальным, а визуализируются отсутствием увеличения TEER.
  6. Выберите момент времени для совместного культивирования MBMECs с Т - клетками , когда Ccl является стабильным и менее 1 мкФ / см 2 и TEER достигла своего максимального уровня.
  7. Тщательно осмотрите абсолютные значения Тир и CCL и исключить скважины, в которых MBMECs не разработаны вырожденные достаточно монослоев отключив таких скважин.
  8. Группа остальные лунки: щелкните правой кнопкой мыши на лунку и выберите "хорошо добавить к новой средней скважины. Наме его в всплывающем окне; сделать то же самое для всех индивидуальных скважин, которые будут сгруппированы.
  9. Проверьте все средние колодцы, чтобы подтвердить, что все они имеют одинаковые начальные условия перед совместной культуры. Если некоторые из них существенно отличаются абсолютные значения Тир или TEER склонах, или стандартные ошибки слишком велики, повторить группировку.
    Примечание: Оптимальная группировка скважин обеспечивает минимальное изменение в значениях Тир, как внутри, так и между экспериментальными группами.
  10. На вкладке «эксперимент», нажмите 'пауза', отключите прибор и выньте его из инкубатора. Снять крышки под капотом ламинарного потока.
  11. Подготовка предварительно активирован, и / или наивные Т-клетки с добавлением или без специфических цитокинов, антител или других веществ, как хотелось бы: Например: Смешать очищенный NA / Л.Е. анти-мышиных ИФН-γ-антителом (клон XGM1.2) с подготовленной T клетки, в 20 мкг / мл на лунку прибора Тир.
    Примечание: Если вещества, такие как ингибитор гранзимом B используются, они являютсяdded к культуре клеток Т в начале Т стимуляции клеток: например, Гранзим Ингибитор II (Калбиохем) смешивают с изолированными Т - клетками при конечной концентрации 10 мкМ в диметилсульфоксиде. Смотрите материалы и оборудование для получения более подробной информации.
  12. Удалите часть среды из вставки (верхний отсек хорошо): например, тщательно пипеткой из 150 мкл (удаление всех среды следует избегать , поскольку это может нарушить монослой MBMEC).
  13. Добавить Т - клетки MBMECs осторожно пипеткой 150 мкл среды , содержащей 2 × 10 5 клеток / вставки.
    Примечание: При заготовке предварительно активированные Т-клетки, рассчитывать только взрывные, Трипановый Blue-свободных ячеек.
  14. Закройте крышки и поместите инструмент обратно в инкубатор. Снова подключите прибор и нажмите 'измерения резюме'. Через 24 часа, нажмите 'стоп' на вкладке «эксперимент» и сохраните файл (File> Save).

5. Экспорт данных и статистический анализ

  1. Экспорт результатов, выбрав Файл> Экспорт.
  2. На вкладке "Настройки" во всплывающем окне выберите ".dot" в опции "Десятичный разделитель" и "табулятором" в опции "разделителя полей".
  3. На вкладке "Экспорт результатов", введите имя файла, проверьте все скважины, которые будут экспортированы, и установите флажок "TEER" и ящики "CCL" в "выбрать данные" вариант.
  4. Нажмите кнопку "Экспорт данных" открыть экспортированный файл, а затем скопировать данные в электронную таблицу.
  5. Нормализация экспортируемые данные (отсортированы по каждой повторности, со значениями Тир и CCL данных для каждого прогона (измерение)): Set Тир и CCL значения последнего момента времени до начала совместной культуры до 100% и изменить соответствующим образом значения для всех остальных работает, по отношению к перспективе '100%'.
  6. Копирование нормализованные данные в программное обеспечение выбора для создания графика, с использованием отдельных скважин и отображать стандартную ошибку среднего для каждой группы обработки.
  7. пerform Двусторонний ANOVA статистический тест с коррекцией Бонферрони для множественных сравнений, с помощью статистического программного обеспечения выбора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлен общий обзор модели в пробирке ВВВ используется для изучения взаимодействия между Т - клеток и эндотелиальных клеток. Эксперимент состоит из трех основных этапов. Первым шагом является выделение первичных MBMECs из коры головного мозга головного мозга, и их культура в течение пяти дней. Когда они достигают впадения в клеточной культуральной пластины, MBMECs трипсином и пересевали на проницаемые вставки, которые затем помещают в прибор Тир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несколько шагов описанного протокола имеют важное значение для успешного эксперимента. В ходе первоначальной изоляции и культуры MBMEC, крайне важно, что работа выполняется в стерильных условиях в максимально возможной степени, чтобы предотвратить загрязнение культуры клеток грибковых спор или бактерий. Для того , чтобы получить чистую культуру КЭ, рекомендуется использовать среду , содержащую пуромицин в течение первых трех дней, что дает выживание КЭ, но не другие типы клеток (особенно перицитов) 41,42. Дру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

И. Кузманову, А. М. Херрману, С. Г. Мойту, Х. Виндлю и Л. Клотцу нечего раскрыть. Х.-Й. Галла является научным консультантом компании nanoAnalytics GmbH, производителя автоматизированного клеточного монитора.

Благодарности

Мы благодарны Анника Engbers и Франк Курта за их отличную техническую поддержку и д-р Маркус Шефер (nanoAnalytics GmbH) за полезные обсуждения, касающиеся измерений Тир. Эта работа была поддержана Немецким Исследовательским (DFG), SFB1009 проект A03 к HW и LK, CRC TR128, проекты A08; Z1 и B01 для LK и HW и Межотраслевой Центр клинических исследований (медицинский факультет Мюнстере) Номер гранта kl2 / 2015/14 для LK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comв том числе: 24-луночный модуль ячейки, контроллер, ПК с программным обеспечением cellZscope v2.2.2 
УльтрацентрифугаThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; ротор F21S-8x50y; для MBMEC
изоляционный проточный цитометрBeckman Coulterwww.beckmancoulter.comдля анализа трансмиграции Т-клеток
FlowJo7.6.5 программное обеспечениеTree Starwww.flowjo.comдля анализа трансмиграции Т-клеток
Oak Ridge центрифужные пробирки, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 мл; для выделения MBMEC
мембранные вставки Transwell - размер пор 0,4 &; mCorning3470для измерения TEER в качестве основного считывания
мембранных вставок Transwell - размер пор 3 &; mCorning3472для измерения TEER в качестве контроля качества перед анализом трансмиграции Т-клеток
24-луночный лабораторный планшет для клеточной культурыGreiner650 180с плоским дном; для культуры MBMEC
96-луночный планшет для клеточной культурыCostar3526с круглым дном; для иммунных клеточных культур
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976для выделения Т-клеток и В-клеток; поддерживает MACS LS колонки
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109для выделения дендритных клеток; поддерживает колонки MACS MS
Neubauer счетная камераMarienfeldMF-0640010для подсчета клеток
Cell sit, 70 & микро; mCorning352350для изоляции иммунных клеток
Клеточный фильтр, 40 & микро; mCorning352340для выделения иммунных клеток
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303для выделения иммунных клеток
MACS LS разделительные колонкиMiltenyi Biotec130-042-401для выделения Т-клеток и В-клеток
MACS MS разделительные колонкиMiltenyi Biotec130-042-201для выделения дендритных клеток
Мышиные CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201для CD4+ Выделение Т-клеток
Мышь CD19 МикрогранулыMiltenyi Biotec130-052-201для выделения В-клеток
Мышь CD11c МикрогранулыMiltenyi Biotec130-052-001для выделения дендритных клеток
Коллаген IV типа из плаценты человекаSigmaC5533для покрытия MBMEC раствор покрытия
Фибронектин из Плазма крупного рогатого скотаSigmaF1141-5MGдля покрытия MBMEC раствор
Коллагеназа 2 (CSL2)WorthingtonLS004176для выделения MBMEC
Коллагеназа/Диспаза (C/D)Roche11097113001для выделения MBMEC
DNase ISigmaDN25для выделения MBMEC
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF7524для выделения MBMEC
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Amresco0332-100Gдля выделения MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lдля выделения MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021для выделения MBMEC и питательной среды MBMEC
Penicillin/StreptomycinSigmaP4333для выделения MBMEC и питательной среды MBMEC
Phosphate-Buffered Физиологический раствор (PBS)SigmaD8537для MBMEC и выделения иммунных клеток
HeparinSigmaH3393для культуральной среды MBMEC
Основной фактор роста фибробластов человека (bFGF)PeproTech100-18Bдля культуральной среды MBMEC
PuromycinSigmaP8833для культуральной среды MBMEC; только в течение первых трех дней
0,05% Trypsin-EDTAGibco25300-054для забора MBMECs
Коллагеназа типа IASigmaC9891для выделения дендритных клеток
раствор Trypan Blue, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061подсчета клеток
EDTASigmaE5134для выделения иммунных клеток
IMDM + 1% L-глутаминGibco21980-032для культуры Т-клеток среда
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qзащитить от света; для среды для культуры В-клеток
Gibco31350-010для среды для культуры В-клеток
L-глутамин (100x Глутамакс)Gibco35050-061для среды для культуры В-клеток
мыши MOG35— 55 пептидBiotrendBP0328для активации антиген-специфических Т-клеток
очищенный антимышиный CD3 AbBioLegend100302клон 145-2C11; для активации поликлональных Т-клеток
очищенный NA/LE антимышиный CD28 AbBD Pharmingen553294клон 37.51; для активации поликлональных Т-клеток
Recombinant Мышиный ИФН-&гамма;PeproTech315-05для анализов трансмиграции Т-клеток
Рекомбинантный мышиный TNF-αPeproTech315-01Aдля анализов трансмиграции Т-клеток
NA/LE очищенное антитело против мышиного ИФН-&гаммаBD Biosciences554408клон XMG1.2; рекомендуемая конечная концентрация: 20 &m; г/мл
Ингибитор Гранзима В IICalbiochem368055рекомендуемая конечная концентрация: 10 &микро; M
PE антимышиное антитело CD4Biolegend116005клон RM4-4; для анализа трансмиграции Т-клеток
для

Ссылки

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи