Лимфоциты являются основными игроками в адаптивных иммунных реакциях. Здесь мы представляем протокол очистки лимфоцитов для определения физиологических функций желаемых молекул в активации лимфоцитов in vitro и in vivo. Описанные экспериментальные методики пригодны для сравнения функциональных возможностей контрольных и генетически модифицированных лимфоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и активация мышиных лимфоцитах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
B и Т-клетки, с их чрезвычайно разнообразным антиген-рецепторным репертуаром, обладают способностью вызывать специфические иммунные ответы против практически любого вторгающегося патогена1,2. Понятно, что такие сложные способности контролируются большим количеством молекул, участвующих в различных клеточных процессах, чтобы обеспечить своевременные и пространственно регулируемые иммунные реакции. Здесь мы описываем экспериментальные процедуры, которые позволяют быстро выделить высокоочищенные лимфоциты мышей с помощью технологии магнитной сортировки клеток. Полученные очищенные лимфоциты затем могут быть подвергнуты различным функциональным анализам in vitro или in vivo, таким как определение сигнальной способности лимфоцитов при стимуляции с помощью иммуноблоттинга4 и исследование пролиферативных способностей путем включения 3-H-тимидинаили мечения карбоксифлуоресцеином диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE)5-7. В дополнение к сравнению функциональных возможностей контрольных и генетически модифицированных лимфоцитов, мы также можем определить стимулирующую способность Т-клеток антигенпрезентирующих клеток (APC) in vivo, как показано в наших репрезентативных результатах с использованием трансплантированных CFSE-меченых OT-I T-клеток.
Введение
Зрелые лимфоциты обычно существуют в состоянии покоя, если у человека нет ранее существовавшей инфекции или воспаления. Поэтому важно сохранить наивный статус лимфоцитов в процессе выделения перед выполнением функциональных анализов in vitro или in vivo. Ключом к обеспечению стабильных и воспроизводимых результатов является ограничение любых ненужных манипуляций с клетками.
Магнитная сортировка клеток использует антитела и микрогранулы для маркировки клеток, чтобы обогатить интересующую популяцию клеток. При таком подходе существуют две стратегии очищения: положительное обогащение и отрицательное истощение. Положительное обогащение обогащает интересующую клеточную популяцию с помощью антитела, которое связывается с клетками-мишенями. Отрицательное истощение, с другой стороны, истощает клетки, не являющиеся мишенями, оставляя популяцию клеток, представляющую интерес. В нашей лаборатории мы предпочитаем отрицательное истощение положительному обогащению, потому что связывание антител с клетками-мишенями потенциально может изменить особенности и поведение клеток. На самом деле, многие установленные маркеры клеточной поверхности, пригодные для выделения определенной клеточной популяции, также являются функциональными рецепторами.
Магнитная сортировка клеток не только позволяет получить высокочистые популяции жизнеспособных клеток-мишеней, но и занимает меньше времени и позволяет избежать клеточного стресса, вызванного потоком под высоким давлением, используемым при флуоресцентно-активируемой сортировке клеток (FACS). Маркируя нежелательные клеточные популяции и истощая их с помощью магнитной разделительной колонки, мы можем выполнить быструю изоляцию клеток без ущерба для жизнеспособности целевой популяции клеток. В этом протоколе мы демонстрируем использование стратегий негативного истощения для очистки наивных В-клеток или Т-клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
У всех мышей разводят и поддерживается при определенных патогена условиях и все протоколы мыши проводятся в соответствии с руководящими указаниями по уходу и использованию комитета Institutional животных.
1. Приготовление буферами и реагентов
- Готовят институт Мемориальный полный Roswell Park (RPMI) среды (10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 МЕ / мл) / стрептомицин (100 мкг / мл), 55 мкМ 2-меркаптоэтанола ).
- Подготовить 20x сбалансированный солевой раствор (BSS) Фото 1 и 2 Наличие на складе, отдельно.
- Подготовка 20x ПБС запас 1 (111 мМ декстроза, 8,8 мМ фосфата калия, 26,7 мМ двухосновного фосфата натрия в 1 л стерильной воды) и добавляют 40 мл 0,5% фенолового красного до 20x ПБС складе 1 до окончательной регулировки громкости. Стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 ° С.
- Подготовка 20x ПБС запас 2 (25,8 мМ дигидрат хлорида кальция, 107 мМ хлорид калия, ч 2,73 М натрияloride, 19,6 мМ хлорид магния гексагидрат, 16,6 мМ сульфата магния в 1 л стерильной воды). Стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 ° С.
- Для подготовки 1x BSS для экспериментального использования, развести 50 мл ПБС запас 1 и 50 мл ПБС запас 2, отдельно, в 400 мл стерильной воды каждый. Объединить оба разбавленные растворы, доведения рН до 7, и добавляют 20 мл FBS (2%). Долить до 1 л, используя стерильную воду и стерильный фильтр с использованием фильтра 0,2 мкм.
Примечание: BSS исходные растворы должны быть приготовлены отдельно, поскольку смешивание концентрированных запасов РвСС непосредственно может привести к осаждению.
- ЭРИТРОЦИТОВ (РБК) лизирующего буфера
- Для подготовки RBC буфер для лизиса, смешайте 9 частей хлорида аммония (сток 155 мм хлорида аммония в стерильной воде) на 1 часть акций Трис-основание (130 мМ трис (гидроксиметил) в стерильной воде, рН 7,65) перед использованием.
Примечание: Храните стерильные исходные растворы хлорида аммония и Трис-основания при 4 ° С. Подготовить лизис бuffer свежей для обеспечения эффективного лизис эритроцитах.
- Для подготовки RBC буфер для лизиса, смешайте 9 частей хлорида аммония (сток 155 мм хлорида аммония в стерильной воде) на 1 часть акций Трис-основание (130 мМ трис (гидроксиметил) в стерильной воде, рН 7,65) перед использованием.
2. Формирование суспензии лимфоцитов из селезенки или лимфатических узлов
Примечание: Важно, чтобы подготовить все реагенты и оборудование, необходимые для проведения эксперимента до эвтаназии мыши и генерировать одиночные клеточные суспензии лимфоцитов как можно скорее для поддержания высоких viabilities клеток.
- Эвтаназии экспериментальная мышь путем смещения шейных позвонков или CO 2 удушья.
Примечание: Начиная с этого этапа и далее, все экспериментальные процедуры должны выполняться в асептических. - Dip всю мышь в 70% этанола, прежде чем принимать какие-либо надрезы. Удалите селезенки и лимфатических узлов асептических 8, и поместить их в отдельные 15 мл пробирки , содержащие 5 мл ледяной RPMI / FBS (RPMI с 2% FBS) или BSS / FBS (со стадии 1.2.3).
Примечание: Так как ПБС не позволяет создать эффективную RBC лизис, используют RPMI для приготовления селезеночной клеточной суспензии и переключения на ПБС Afteг РБК лизиса. - Для создания суспензии отдельных клеток из селезенки или лимфатических узлов, поместите орган (ы) между двумя кусками стерильной фильтрующей сетки 100 мкм клеток в чашке Петри, содержащую 2 мл ледяной RPMI / FBS или BSS / FBS. Используя поршень шприца емкостью 1 мл, разомните орган (ы), пока она не была разорвана на очень мелкие части.
- Передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку и промыть сетчатый фильтр сетка ячейка с охлажденным льдом RPMI / FBS или ПБС / FBS. Собрать оставшуюся клеточную суспензию, добавить его в том же 15-мл пробирку, и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
Примечание: Повторное приостановить осажденные клетки слегка ударяя по пробирке с пальцами перед добавлением буфера для лизиса эритроцитов или среду на последующих стадиях. - Готовят при комнатной температуре (RT) RBC буфер для лизиса во время центрифугирования суспензии клеток (этап 1.3.). После того, как гранулирование клетки и удаления надосадочной жидкости, повторно приостанавливать клетки с 1 мл буфера для лизиса эритроцитов за каждые 10 8 клеток. INCUBATE реакция лизиса при комнатной температуре в течение 3-4 мин.
- Прекратить RBC лизис с 14 мл охлажденного льдом BSS / FBS и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
3. Очистка В- и Т-клеток
- Очистка В-клеток
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Повторное приостановить до 10 8 клеток селезенки в 300 мкл BSS / FBS и добавить 50 мкл анти-CD43 магнитные микрогранулы 9,10. Для того, чтобы удалить мертвые клетки, добавьте 30 мкл аннексина V магнитных шариков. Инкубируйте клеточной суспензии в холодильнике C 4 ° С в течение 30 мин.
- После очистки Т-клеток
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Повторное приостановить до 10 8 клеток в не-T коктейль истощение клеток антител (биотинилированных антител против CD19, B220, Gr-1, ТКС-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 и CD4 или CD8 в зависимости от популяции клеток - мишеней к очищаться), разведенной 1: 200 в 200 мкл ПБС / FBS 4,5. Выдержите суспензии клеток у4 ° С холодильником в течение 15 мин.
- После инкубации добавляют 10 мл раствора ПБС / FBS, чтобы промыть клетки и спином вниз на 453 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и вновь приостановить клетки в 165 мкл ПБС / FBS с 30 мкл стрептавидин микрошариков и 15 мкл аннексина V магнитных шариков. Инкубируйте клеточной суспензии в холодильнике C 4 ° С в течение 30 мин.
Примечание: Для того, чтобы обеспечить даже маркировка с магнитными микрогранул, инкубировать клетки с микрогранул в течение 15 мин, затем смешать клеточную суспензию осторожно коснувшись 15 мл трубки и инкубировать еще 15 минут в течение стадии 3.1.1. или 3.2.2.
- Получение разделения колонок для очистки клеток
- Подготовьте неиспользуемый разделительную колонну во время микрогранулами мечения клеток (шаг 3.1.1. Или 3.2.2.). Предварительно теплая ПБС (без FBS) до комнатной температуры и используют 2 мл, чтобы вымыть и уравновешивают колонку асептически. После уравновешивания с ПБС, промытый столбец не следует допускать, чтобы высохнуть.
Примечание: Мы используем LS Column вместо рекомендованного столбца LD из-за его повторного использования (см шаг 3.4.). - После того, как маркировка с использованием магнитных шариков, добавьте 14 мл ПБС / FBS, чтобы промыть клетки и спином вниз на 453 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и повторно приостанавливать клетки в 1-3 мл RT ПБС.
- Приложить стерильный 21 G иглу на кончик колонны, чтобы уменьшить скорость потока в процессе очистки. Нагрузка клеточной суспензии на уравновешенную колонку и собирают поток через содержащие очищенные клетки-мишени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков в колонке во время загрузки. - Промывают колонку один раз с 1 мл ПБС / FBS и собрать поток через содержащие очищенные клетки-мишени. Обновить колонку с потоком через еще раз. Собирают поток через после второй загрузки в той же 15 мл трубки.
- Промыть колонку 3 раза с 1 мл BSS / FBS и собрать поток через содержащий очищенные клетки-мишени. Затем добавляют 5 мл BSS / FBS к йе столбец и, с помощью ударника, промойте магнитно меченых клеток из колонны в новый 15 мл пробирку.
- Проверьте чистоту клеток , собранных с помощью проточной цитометрии с использованием антител , которые связываются с поверхностным антигенам очищенного В или Т - клеток 4,5.
- Подготовьте неиспользуемый разделительную колонну во время микрогранулами мечения клеток (шаг 3.1.1. Или 3.2.2.). Предварительно теплая ПБС (без FBS) до комнатной температуры и используют 2 мл, чтобы вымыть и уравновешивают колонку асептически. После уравновешивания с ПБС, промытый столбец не следует допускать, чтобы высохнуть.
- Повторное использование разделения колонок
Примечание: В столбце LS могут быть повторно использованы до 4-х раз, не затрагивая эффективность очистки.- Промывают колонку 3 раза с 5 мл фосфатно-буферным раствором (PBS) и 3 раза с 5 мл дистиллированной воды с вершины, используя поршень.
- Промывают колонку 5 мл 70% -ного этанола и высушивают колонку интенсивно используя воздушный кран, чтобы предотвратить накопление ржавчины в колонне.
- Для того, чтобы подготовить используемый столбец LS для отдельного эксперимента очистки, промывки колонки снизу вверх с 5 мл 70% этанола с помощью адаптера шприца. Затем промойте колонку снизу вверх дважды 5 мл стерильной PBS, а затем 5 мл PBS, как только из верхней части колонны. Добавить 2мл RT ПБС для уравновешивания колонки, а затем перейти к загрузке колонки меченых клеток.
4. CFSE Этикетировочное и стимулирование
Примечание: Очищенная клетки могут быть подвергнуты различным в пробирке и в естественных функциональных анализов. Здесь мы используем очищенные Т - клетки для определения Т клеточной стимуляции способности АРС 5.
- Предварительно теплый раствор мечение (0,1% FBS в PBS) до 37 ° С перед CFSE нагрузки.
Примечание: Используя низкий процент FBS в PBS снижает гибель клеток во время CFSE нагрузки и сводит к минимуму потерю клеток во время центрифугирования. Тем не менее, слишком много ФБС может помешать CFSE нагрузки. - Вымойте очищенные клетки дважды раствором маркировки, а затем ресуспендировали в 2 х 10 7 клеток / мл в подогретого раствора маркировки в 15 мл трубки.
- Приготовьте 10 мкМ раствор CFSE (1: 500 разбавление 5 мМ CFSE исходного раствора) в подогретого раствора маркировки. Решение CFSE должнобыть свежеприготовленной каждый раз, когда для достижения оптимальной маркировки.
- Для загрузки клеток с CFSE, добавить приостановку 1 часть клеток к 1 части 10 мкМ раствора CFSE в 15-мл пробирку и инкубировать в темноте в течение 10 мин при 37 ° С. В конечной концентрации 5 мкМ CFSE используется для обозначения 1 х 10 7 клеток / мл.
- Переверните пробирку каждые 2 мин, чтобы обеспечить однородную смесь клеток во время CFSE нагрузки.
- Для того, чтобы остановить реакцию, добавить несколько томов ледяной полной среде RPMI и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. При успешной загрузке CFSE, клеточный осадок появляется желтоватый.
- Мытье CFSE загружены ячеек еще один раз с ледяной полной среде RPMI и спином вниз на 453 мкг в течение 5 мин при 4 ° С перед использованием для культивирования в пробирке или в естественных условиях стимуляции.
5. In Vitro Стимуляция
- Подготовить 2х маточный раствор стимулов (2x раздражители основной раствор) непосредственно перед употреблением, так что 100 мкл 2х раздражители маточного раствора может быть добавлено к 100 мкл клеток до конечного объема 200 мкл на лунку в 96-луночный планшет.
- Если пластина покрыта раздражители (IgM или CD40 для В-клеток или CD3 и CD28 для Т-клеток) требуется, разбавить стимулы в PBS и предварительно пальто культуры пластины при 4 ° С в течение ночи. В качестве альтернативы, культура пластины может быть нанесено покрытие при температуре 37 ° С в течение 1 часа в день эксперимента. Промыть пластины с нанесенным покрытием дважды PBS (Не допускайте пластины высохнуть в любое время).
| Для В - клеток | |
| Стимулы | Конечная концентрация |
| F (аb ') 2 козьего анти-мышиных IgM | 0.6-2.4 мкг / мл |
| Анти-CD40 мыши мАт | 0.5-2 мкг / мл |
| рекомбинантмыши IL-4 | 25 ед / мл |
| липополисахарид | 0,1-10 мкг / мл |
| (LPS) из E. палочки серотипа 055: B5 | |
| Для Т - клеток | |
| Стимулы | Конечная концентрация |
| Анти-CD3 (пластина с покрытием) | 2-10 мкг / мл |
| (50 мкл / лунку для покрытия) | |
| Анти-CD28 (пластина с покрытием) | 2 мкг / мл |
| Рекомбинантный IL-2 | 40 ед / мл |
| PDBu (форболовыми эфир) | 5-50 нг / мл |
| А23187 (Ионофор кальция) | 250 нг / мл |
Таблица 1: Концентрации раздражителей , используемых для стимуляции лимфоцитов в культуре в пробирке.
- Для CFSE-меченых В - клеток, вновь приостановить до 3 х 10 6 клеток / мл в полной среде RPMI , и культуры в трех экземплярах с 3 х 10 5 клеток / лунку в 96-луночных плоскодонных пластины в течение 72 ч.
- Для CFSE-меченных Т - клеток, повторно приостанавливать до 0,5-3 × 10 6 клеток / мл в полной среде RPMI , и культуры в трех экземплярах с 0,5-3 × 10 5 клеток / лунку в 96-луночные планшеты круглые нижние 48 или 72 ч ,
6. В Vivo Стимуляция
- Для стимуляции в естественных условиях, адаптивно передачи 4 × 10 6 CFSE меченных Т - клеток на мышь (внутривенно (IV) в 200 мкл PBS) в каждую MHC подобранная мыши - реципиента.
Примечание: В этом протоколе CFSE-меченных Т-клетки могут быть перенесены с помощью адаптивно хвостовую вену или ретро-орбитальной инъекции, так как эти клетки будут домой лимфоидных органов, таких как селезенка и лимфатические узлы. - Призовите мышей-реципиентов один день позже с антигеном.
ЗАМЕТКА:В этом примере мы используем овальбумина (OVA белок, 50 мкг / мышь) в качестве антигена, так как OVA-специфический, Т-клеточного рецептора (TCR) -transgenic Т-клетки адаптивно переносили в организм мышей-реципиентов. Подготовьте OVA белок в стерильной PBS и вводят 100 мкл OVA белка / PBS или PBS контроля, с помощью подкожной инъекции (SI), в каждой мыши - реципиента 5. - Урожай и генерировать одиночные клеточные суспензии из лимфоидных органов (лимфатических узлов и селезенки) мышей-реципиентов через 3 дня после иммунизации белком OVA или PBS. Отдельные лимфатические узлы в проксимальных лимфатические узлы (злотый), которая включает в себя подмышечные, плечевой и поверхностные шейные лимфатические узлы) и дистальные лимфатические узлы (дина), которая включает в себя брыжеечных, подколенные, паховые, поясничного отдела позвоночника, и хвостовые лимфатических узлов. Пятно клетки с использованием соответствующих антител FACS для проверки пролиферации Т-клеток.
Примечание: В этом CFSE клеток эксперимента слежения, CFSE-меченных Т-клетки из PBS-инъекции у контрольных мышей установить базовые флуоресценции для не-диviding клетки. Деление клеток пролиферирующих, стимулированных антигеном, CFSE-меченые клетки визуализируют путем измерения флуоресценции пиков 12,13. С помощью контрольной среде ФБР, количество клеточных делений пролиферирующих, CFSE меченных Т - клетки могут быть определены 12,13. - Анализировать данные пролиферации клеток с CFSE меченных путем сравнения количества клеточных делений или пиков между образцами (рисунки 1 и 2).
Примечание: Например, CFSE-меченого, OVA-специфические Т - клетки , перенесенные в организм адоптивно мышей - реципиентов , получавших антиген OVA претерпит активной пролиферации по сравнению с PBS , вводили мышам 5,12 управления. Кроме того, следует отметить , указать на то , что существует множество способов анализа данных клеточной пролиферации CFSE, как показали Хокинс и его коллегами 14.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Очистка магнитной ячейки лимфоцитов позволяет очистить популяцию клеток-мишеней в относительно короткий промежуток времени. Используя наш протокол истощения, мы смогли увеличить процент CD8 Т-клеток (OT-I в рекомбинацией активации гена-1 (КГР-1) дефицитных мышей) от 72,8% (до очистки) до 94,2% (после очистки; Рисунок 1А) 4,5. Эти очищенные лимфоциты затем могут быть использованы для последующих функциональных анализов для определения пролиферации лимфоцитов и ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе, мы демонстрируем процедуру очистки лимфоцитов из лимфоидных органов. очистка клеток с помощью магнитной сортировки шарик представляет собой быстрый и простой метод, который дает жизнеспособные, высоко очищенные клетки-мишени.
Критические шаги в рамках Протокола
Жизнеспособность клеток и выход клеток
Поддержание жизнеспособности кроветворных клеток линии дифференцировки в пробирке имеет решающе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Министерства образования, Сингапур (ACRF Tier1-RG40 / 13 и Tier2-MOE2013-T2-2-038). Рукопись была отредактирована Эми Салливан из Obrizus Communications.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| RPMI 1640 (без L-глютамина) | Gibco | 31870025 | |
| Фетальная сыворотка | инактивирована | ||
| L-глутамин | Gibco | 25030024 | |
| пенициллин/стрептомицин | Gibco | 15140114 | |
| 2-меркаптоэтанол | Gibco | 21985023 | |
| магнитные микрогранулы Anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Хорошо перемешать перед применением |
| Стрептавидиновые микрогранулы | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Хорошо перемешать перед использованием |
| Антианнексин V магнитные | шарики Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Хорошо перемешать перед применением |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-луночный U-образный стерильный культуральный планшет | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-луночный стерильный питательный планшет с F-образным дном | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m сетка | для стерилизации с использованием УФ-излучения перед использованием | ||
| 0,2 мкм; М стерильные одноразовые фильтрующие блоки | Nalgene | 567-0020 | могут быть заменены на любые стерильные фильтрующие устройства |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV для краткости; альтернатива CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY для краткости; альтернатива CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR для краткости; альтернатива CFSE |
| Клеточный пролиферативный краситель eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 для краткости; альтернатива CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, альтернатива CFSE< |
| strong>Name | Company | Номер в каталоге | Comments |
| >Chemicals | |||
| Декстроза | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Фосфат калия одноосновной | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Фосфат натрия двухосновной | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Фенол красный | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Дигидрат хлорида кальция | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Хлорид калия | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Хлорид натрия | Merck Millipore | S7653 | Можно использовать из других источников |
| Гексагидрат хлорида магния | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Сульфат магния | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Хлорид аммония | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Трис-основание | |||
| Диметилсульфоксид | сигма Олдрич | D8418 | |
| (5-(и 6-) карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE) | Молекулярные зонды | C-1157 | восстанавливают в ДМСО |
| 12,13-дибутират Phorbol (PBDU, сложный эфир Phorbol) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (ионофор кальция) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name< | >Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| Антитела и рекомбинантный белок | |||
| CD11b биотин (клон m1/70) | Biolegend | 101204 | Коктейль истощения Т-клеток |
| CD11c биотин (клон N418) | Biolegend | 117304 | коктейль истощения Т-клеток |
| Gr-1 биотин (клон RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | коктейль истощения Т-клеток |
| Ter119 биотин (клон Ter119) | Biolegend | 116204 | коктейль истощения Т-клеток |
| TCR-γ &дельта; биотин (клон GL-3) | Biolegend | 118103 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD19 биотин (клон 6D5) | Biolegend | 115504 | Т-клеток |
| B220 биотин (клон RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD49b биотин (клон DX5) | Biolegend | 108904 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD4 биотин (клон GK1.5) | Biolegend | 100404 | Коктейль истощения Т-клеток |
| CD8 биотин (клон 53-6,7) | Biolegend | 100704 | коктейль истощения Т-клеток |
| F(ab')2 козьих антимышиных IgM (с пластинчатым покрытием) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 &микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Антимышиный CD40 mAb (с пластинчатым покрытием) | Pharmingen | 553722 | 50 & микро; л/луза для нанесения покрытий (96-лунка) |
| Рекомбинантный ИЛ-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS из E. coli Серотип 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (клон OKT3) (покрытый пластиной) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 & микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Anti-CD28 (клон 37.51) (с пластинчатым покрытием) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 &микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Рекомбинантный IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Альбумин из белка куриного яйца, овальбумин | Sigma Aldrich | A7641 |
Ссылки
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
- Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).
- Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
- Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
- Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
- Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
