Лимфоциты являются основными игроками в адаптивных иммунных реакциях. Здесь мы представляем протокол очистки лимфоцитов для определения физиологических функций желаемых молекул в активации лимфоцитов in vitro и in vivo. Описанные экспериментальные методики пригодны для сравнения функциональных возможностей контрольных и генетически модифицированных лимфоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и активация мышиных лимфоцитах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
B и Т-клетки, с их чрезвычайно разнообразным антиген-рецепторным репертуаром, обладают способностью вызывать специфические иммунные ответы против практически любого вторгающегося патогена1,2. Понятно, что такие сложные способности контролируются большим количеством молекул, участвующих в различных клеточных процессах, чтобы обеспечить своевременные и пространственно регулируемые иммунные реакции. Здесь мы описываем экспериментальные процедуры, которые позволяют быстро выделить высокоочищенные лимфоциты мышей с помощью технологии магнитной сортировки клеток. Полученные очищенные лимфоциты затем могут быть подвергнуты различным функциональным анализам in vitro или in vivo, таким как определение сигнальной способности лимфоцитов при стимуляции с помощью иммуноблоттинга4 и исследование пролиферативных способностей путем включения 3-H-тимидинаили мечения карбоксифлуоресцеином диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE)5-7. В дополнение к сравнению функциональных возможностей контрольных и генетически модифицированных лимфоцитов, мы также можем определить стимулирующую способность Т-клеток антигенпрезентирующих клеток (APC) in vivo, как показано в наших репрезентативных результатах с использованием трансплантированных CFSE-меченых OT-I T-клеток.
Введение
Зрелые лимфоциты обычно существуют в состоянии покоя, если у человека нет ранее существовавшей инфекции или воспаления. Поэтому важно сохранить наивный статус лимфоцитов в процессе выделения перед выполнением функциональных анализов in vitro или in vivo. Ключом к обеспечению стабильных и воспроизводимых результатов является ограничение любых ненужных манипуляций с клетками.
Магнитная сортировка клеток использует антитела и микрогранулы для маркировки клеток, чтобы обогатить интересующую популяцию клеток. При таком подходе существуют две стратегии очищения: положительное обогащение и отрицательное истощение. Положительное....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
У всех мышей разводят и поддерживается при определенных патогена условиях и все протоколы мыши проводятся в соответствии с руководящими указаниями по уходу и использованию комитета Institutional животных.
1. Приготовление буферами и реагентов
- Готовят институт Мемориальный полный Roswell Park (RPMI) среды (10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 МЕ / мл) / стрептомицин (100 мкг / мл), 55 мкМ 2-меркаптоэтанола ).
- Подготовить 20x сбалансированный солевой раствор (BSS) Фото 1 и 2 Наличие на складе, отдельно.
- Подготовка 20x ПБС запас 1 (111 мМ декстроза....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Очистка магнитной ячейки лимфоцитов позволяет очистить популяцию клеток-мишеней в относительно короткий промежуток времени. Используя наш протокол истощения, мы смогли увеличить процент CD8 Т-клеток (OT-I в рекомбинацией активации гена-1 (КГР-1) дефицитных мышей) от 72,8% (до очистки) до 94,2% (после очистки; Рисунок 1А) 4,5. Эти очищенные лимфоциты затем могут быть использованы для последующих функциональных анализов для определения пролиферации лимфоцитов и .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе, мы демонстрируем процедуру очистки лимфоцитов из лимфоидных органов. очистка клеток с помощью магнитной сортировки шарик представляет собой быстрый и простой метод, который дает жизнеспособные, высоко очищенные клетки-мишени.
Критические шаги в рамках Протокола
Жизнеспособность клеток и выход клеток
Поддержание жизнеспособности кроветворных клеток линии дифференцировки в пробирке имеет решающе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Министерства образования, Сингапур (ACRF Tier1-RG40 / 13 и Tier2-MOE2013-T2-2-038). Рукопись была отредактирована Эми Салливан из Obrizus Communications.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| RPMI 1640 (без L-глютамина) | Gibco | 31870025 | |
| Фетальная сыворотка | инактивирована | ||
| L-глутамин | Gibco | 25030024 | |
| пенициллин/стрептомицин | Gibco | 15140114 | |
| 2-меркаптоэтанол | Gibco | 21985023 | |
| магнитные микрогранулы Anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Хорошо перемешать перед применением |
| Стрептавидиновые микрогранулы | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Хорошо перемешать перед использованием |
| Антианнексин V магнитные | шарики Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Хорошо перемешать перед применением |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 96-луночный U-образный стерильный культуральный планшет | Greiner Bio-one | 650180 | |
| 96-луночный стерильный питательный планшет с F-образным дном | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m сетка | для стерилизации с использованием УФ-излучения перед использованием | ||
| 0,2 мкм; М стерильные одноразовые фильтрующие блоки | Nalgene | 567-0020 | могут быть заменены на любые стерильные фильтрующие устройства |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV для краткости; альтернатива CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY для краткости; альтернатива CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR для краткости; альтернатива CFSE |
| Клеточный пролиферативный краситель eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 для краткости; альтернатива CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, альтернатива CFSE< |
| strong>Name | Company | Номер в каталоге | Comments |
| >Chemicals | |||
| Декстроза | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Фосфат калия одноосновной | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Фосфат натрия двухосновной | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Фенол красный | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Дигидрат хлорида кальция | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Хлорид калия | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Хлорид натрия | Merck Millipore | S7653 | Можно использовать из других источников |
| Гексагидрат хлорида магния | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Сульфат магния | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Хлорид аммония | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Трис-основание | |||
| Диметилсульфоксид | сигма Олдрич | D8418 | |
| (5-(и 6-) карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидилового эфира (CFSE) | Молекулярные зонды | C-1157 | восстанавливают в ДМСО |
| 12,13-дибутират Phorbol (PBDU, сложный эфир Phorbol) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (ионофор кальция) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Name< | >Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| Антитела и рекомбинантный белок | |||
| CD11b биотин (клон m1/70) | Biolegend | 101204 | Коктейль истощения Т-клеток |
| CD11c биотин (клон N418) | Biolegend | 117304 | коктейль истощения Т-клеток |
| Gr-1 биотин (клон RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | коктейль истощения Т-клеток |
| Ter119 биотин (клон Ter119) | Biolegend | 116204 | коктейль истощения Т-клеток |
| TCR-γ &дельта; биотин (клон GL-3) | Biolegend | 118103 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD19 биотин (клон 6D5) | Biolegend | 115504 | Т-клеток |
| B220 биотин (клон RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD49b биотин (клон DX5) | Biolegend | 108904 | коктейль истощения Т-клеток |
| CD4 биотин (клон GK1.5) | Biolegend | 100404 | Коктейль истощения Т-клеток |
| CD8 биотин (клон 53-6,7) | Biolegend | 100704 | коктейль истощения Т-клеток |
| F(ab')2 козьих антимышиных IgM (с пластинчатым покрытием) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 &микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Антимышиный CD40 mAb (с пластинчатым покрытием) | Pharmingen | 553722 | 50 & микро; л/луза для нанесения покрытий (96-лунка) |
| Рекомбинантный ИЛ-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS из E. coli Серотип 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (клон OKT3) (покрытый пластиной) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 & микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Anti-CD28 (клон 37.51) (с пластинчатым покрытием) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 &микро; l/лунка для покрытия (96-лунка) |
| Рекомбинантный IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| Альбумин из белка куриного яйца, овальбумин | Sigma Aldrich | A7641 |
Ссылки
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
