Методическая статья

Определение субстрата специфичностью для липазы и фосфолипазы кандидатов

DOI:

10.3791/54613

⸱

23 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие предсказанные (фосфо)липазы плохо характеризуются с точки зрения их субстратной специфичности и физиологических функций. В этой статье мы приводим протокол для оптимизации активности ферментов, поиска природных субстратов и предполагаем физиологические функции этих ферментов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроорганизмы производят широкий спектр (фосфо) липаз, которые секретируются для того, чтобы внешние субстраты для организма. В качестве альтернативы, другие (фосфо-) липазы могут быть физически связаны с продуцирующего организма в результате чего оборот собственных липидов и часто порождая ремоделирование клеточных мембран. Хотя потенциал (фосфо-) липазы может быть предсказано с рядом алгоритмов, когда последовательность гена / белок доступен, экспериментальное доказательство активности ферментов, субстрат специфичностью, а также потенциальных физиологических функций часто не было получено. Эта рукопись описывает оптимизацию условий анализа для потенциальных (фосфо) липазы с неизвестными подложки и специфичностью, как использовать эти оптимизированные условия в поисках природного субстрата соответствующего (фосфо) липазы. Использование искусственных хромогенных субстратов, таких как производные р - нитрофенил, может помочь обнаружить незначительныеферментативная активность для предсказанного (фосфо) липазы в стандартных условиях. Столкнувшись такую ​​незначительную ферментативную активность, особые параметры твердофазного иммуноферментного анализа фермента можно варьировать, чтобы получить более эффективный гидролиз искусственном субстрате. После определения условий, при которых фермент работает хорошо, разнообразие возможных природных субстратов должны быть исследованы на их деградации, процесс, который может сопровождаться использованием различных хроматографических методов. Определение субстратной специфичности в отношении новых ферментов, часто дает гипотезы для потенциальной физиологической роли этих ферментов, которые затем могут быть проверены экспериментально. Следуя этим рекомендациям, мы смогли идентифицировать фосфолипазу С (SMc00171) , который унижает фосфатидилхолин к фосфохолин и диацилглицерол, на решающем этапе для ремоделирования мембран в бактерии Sinorhizobium meliloti при фосфорных ограничивающими условиях роста. Для двух предсказывал patatin-как фосфолипаз (SMc00930 и SMc01003) одного и того же организма, мы могли бы пересмотреть свои субстратную специфичность и уточнить, что SMc01003 является диацилглицеринацилтрансферазы липазы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глицерин на основе липидов , такие как триацилглицеринов и (глицеро) фосфолипиды являются важными и , вероятно , наиболее известные классы липидные 1. Триацилглицерины (БИРКАХ) являются жиры или масла, которые обычно функционируют как липиды хранения, и, следовательно, в качестве потенциальных энергетических и углеродных источников. ДВТ может быть понижена липазы, которые часто выделяемыми продуцирующего организма переваривать внешних бирками и сделать их доступными в качестве источников углерода. Кроме того , липазы широко изучались на протяжении многих лет из - за их важных биотехнологического применения 2.

Из - за их амфифильного характера и их почти цилиндрическое форме (глицеро) фосфолипиды экспоната мембранообразующих свойств и , как правило , представляют собой основные липидные компоненты двухслойных мембраны 3. В простых микроорганизмов, таких как бактерии кишечной палочки, только три основных варианта головной группы, фосфатидилглицерина (PG), кардиолипину (CL), и phosphatidylethanolamine (PE) встречаются, хотя следует иметь в виду , что каждый из них может быть заменен с большим количеством различных жирных ацильных цепей в зп -1 или -2 зп ситуация , вызвавшая большое количество различных видов молекул ; 4 , Другие бактерии могут иметь другие фосфолипиды в дополнение или вместо. Например, Sinorhizobium meliloti, бактерия почвы, которая способна образовывать азотфиксирующую клубеньковых симбиозе с бобовой люцерны (Medicago сатива), содержит в дополнение к РЕ а второй цвиттерионная фосфолипид, фосфатидилхолин (PC) 5. Кроме того, липиды, не содержащие фосфор или глицерин могут быть амфифильными и являются составной частью клеточной мембраны. Например, при условиях роста фосфором ограничения, в S. meliloti, (глицеро) фосфолипиды в значительной степени заменены мембранными липидами , которые не содержат фосфор, то есть, сульфолипидов, орнитин липиды, и diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. У бактерий DGTS образуется из диацилглицерина (DAG) в двухступенчатом пути 7 , но источник для генерации DAG не было понятно. Пульс-чейз эксперименты показали, что ПК может быть предшественником для DGTS 8 и с использованием методики , описанной в этой рукописи мы могли идентифицировать фосфолипазу С (PLCP, SMc00171) , который формируется под фосфорных ограничивающими условиями и который может преобразовать ПК в DAG и фосфохолина 8.

В отдельном исследовании, мы обнаружили , что ацил-КоА - синтетазы (Fadd) дефицитных мутант S. meliloti или кишечной палочки накопила свободных жирных кислот при входе в стационарной фазе роста 9. Хотя эти жирные кислоты, казалось, быть получены из мембранных липидов, точный источник свободных жирных кислот или фермента (ов), что их высвобождают не были известны. Опять же , применяя стратегию , изложенную в этой рукописи, два пататина типа 10 (фосфо-) липазы (SMc00930 и SMc01003) , что способствовало образованию свободных жирных кислот в S. meliloti 11 были предсказаны. Удивительно, но SMc01003 использовали DAG в качестве субстрата , преобразовав его в monoacylglycerol и , наконец , глицерин и свободные жирные кислоты 11. Поэтому SMc01003 является липаза DAG (DGLA).

Хотя ряд алгоритмов существуют для прогнозирования потенциального (фосфо) липазы 12,13, их точная функция и физиологическая роль, как правило , не известно. Здесь мы приводим протокол, клонировать и гиперэкспрессией предсказанных или потенциальных (фосфо) липазы. Эта рукопись объясняет, как анализы ферментов могут быть разработаны и оптимизированы для суперэкспрессированный (фосфо) липазы с использованием искусственных хромогенных субстратов. Мы приводим примеры, как с оптимизированной ферментного анализа реальной (фосфо) липаза субстрат можно встретить и каким образом эти результаты могут обогатить наше понимание микробной физиологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клонирование и гиперэкспрессией структурный ген для предсказанной липазы

  1. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) 14 и специфических олигонуклеотидов (таблица 1) 15, усиливают интерес ген (smc01003, smc00930 или smc00171), согласно прогнозам, кодировать липазы или фосфолипазы, из геномной ДНК организма - хозяина (т.е. , С. meliloti).
    1. Введем специфические сайты рестрикции (запланированной последовательности олигонуклеотидов). Дайджест амплифицированного ДНК - фрагмента с соответствующими ферментами рестрикции , и клонировать его в вектор экспрессии , такой как плазмид серии рЕТ 16.
    2. После проверки правильности последовательности ДНК клонированного гена, преобразование вектора к экспрессии , такой как штамм кишечной палочки BL21 (DE3) pLysS 16.
  2. Приготовьте накануне вечером предварительной культуры экспрессии хозяина E. палочки BL21 (DE3) рлYss, несущее соответствующий рЕТ вектор с клонированного гена или пустым вектором, в 100 мл колбах с культурой , содержащей 20 мл бульона Лурии Бертани (LB) 17 плюс необходимые антибиотики. Культуры клеток при 30 ° С (или при обычной температуре роста бактерии , из которой липаза берет свое начало).
    1. Использование ночных предварительных культур, инокуляции 500 мл среды LB подогретую (плюс необходимые антибиотики) в 2 л колбы с культурой , чтобы получить начальную оптическую плотность при длине волны 620 нм (OD 620) = 0,05. Последующие рост культур и при OD 620 = 0,3, добавляют изопропил-бета-D-тиогалактозида (IPTG) до конечной концентрации 100 мкМ, и инкубировать при перемешивании при 30 ° С в течение 4 часов.
    2. В конце инкубационного периода, передают каждую культуру в центрифужную пробирку емкостью 500 мл и центрифуге при 5000 мкг при 4 ° С в течение 30 мин. Ресуспендируют бактериальных гранул клеток в 5 мл суспензионного буфера (например, SMc00930- и SMc01003-экспрессирующих клеток в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, и SMc00171-экспрессирующих клеток в 50 мМ диэтаноламин-HCl, рН 9,8). Хранить клеточные суспензии при -80 ° С до использования.

2. Подготовить бесклеточной экстракты белка и Определение концентрации белка

  1. Размораживание бактериальных клеточных суспензий и хранить на льду. Pass клеточные суспензии трижды через ячейку холодного давления при 20000 фунтов на в 2. Удалить интактных клеток и клеточного дебриса центрифугированием при 5000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С.
  2. После центрифугирования готовят аликвоты 100 и 500 мкл из надосадочной жидкости для последующего анализа и хранить их при температуре -80 ° С до использования.
  3. С помощью одного из 100 мкл аликвоты для определения концентрации белка в различных бесклеточных экстрактов методом выбора или , как описано 18.

3. С помощью искусственных субстратах для оптимизации ЭнзимДеятельность (фосфо) липазы

  1. Для начального охвата различных ферментативных активностей, используют искусственные субстраты , которые дают окрашенный продукт при гидролизе, например, р -nitrophenol (р) -np.
    1. Для получения ферментных анализов уже оптимизированы с искусственными подложками р - нитрофенил сложный эфир (намеченные для фосфолипазу С PLCP (SMc00171), а также для предсказанных пататина типа фосфолипаз SMc00930 и SMc01003), использование схемы пипетирующие описаны в таблице 2.
    2. При изучении нового потенциала (фосфо) липазу, подготовить первый стандартного ферментного анализа , содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 100 мМ NaCl, 0,05% Triton X-100, 0,5 мМ п - нитрофенил-содержащего соединения (р - нитрофенил фосфата , бис- р - нитрофенил фосфата, р - нитрофенил деканоат, или р - нитрофенил - пальмитат) и белковый экстракт без клеток (проверка 1, 3, 10, 30, 100, 300, и 1000 мкг) в общем объеме 1 мл в 1 мл пластиковые CUVEttes.
      Примечание: Используйте щелочной рН (Рисунок 1) , когда после гидролиза сложного эфира п - нитрофенил в непрерывном анализе. В качестве альтернативы, использовать одинарные анализы отсчете для диапазона значений рН, добавление NaOH в конце инкубационного периода , чтобы прекратить реакцию фермента , и , чтобы гарантировать , что во всех случаях р -np присутствует в виде фенолята.
    3. Выполните изменение во времени для увеличения поглощения при 405 нм, в связи с формированием р -np, в спектрофотометре при 30 ° С в течение 5 мин. Количественная первоначально линейное формирование р -np путем определения начальный наклон увеличения оптической плотности в единицу времени.
    4. Вычислить изменение концентрации ( & delta ; C) при р -np используя закон Ламберта-Бера (ΔA = ε & delta ; C d) 1.
      Примечание: ΔA является линейное изменение оптической плотности определяется, ε является молярный коэффициент поглощения при соответствующей длине волны (в единицах М -1 -1), d является длина светового пути (1 см), и является delta ; C изменение концентрации (в единицах М) , которые будут определены.
      1. Учитывая , что объем пробы составляет 1 мл, рассчитать количество р -np сформированную.
        Примечание: Сумма = концентрация х объем.
      2. Рассчитывают активность фермента путем деления количества р -np образованного к тому времени , в котором она формируется. Определить удельную активность фермента путем деления активности фермента на количество белка (в мг), который отвечает за формирование этой деятельности.
    5. Сравните изменения оптической плотности , спровоцированные белковых экстрактов , в которых были высказаны кандидатом гена (smc00171, smc00930 или smc01003) с экстрактами , которые укрывают только пустой вектор.
      Примечание: Для того, чтобы продолжить следующие шаги, конкретные виды деятельности, вызванные белковых экстрактов, в которых был высказан ген-кандидат, должен быть по крайней мере в два раза или мруды, чем значения, полученные для конкретных видов деятельности, вызванных белковых экстрактов, которые укрывают только пустой вектор.
    6. Для дальнейших экспериментов, выбрать те условия , в которых гидролиз р нитрофенил соединение представляет собой минимально с бесклеточных экстрактов (т.е. пустой вектор) и для которых наиболее выраженное образование р -np и р -nitrophenolate анион (рис 1) можно наблюдать , когда белковые экстракты используются, в которых был высказан ген - кандидат.
  2. После определения активности первоначального фермента в 3.1, оптимизации условий анализа для соответствующего фермента путем изменения рН, тип буфера, буферной силы, концентрации NaCl, детергенты, такие как Тритон Х-100, а также отсутствие или присутствие различных двухвалентных катионов.
    1. Для различных концентраций каждой переменной, определяют удельную активность фермента (см 3.1.4.2) (наибольшее число получено определяет условиеактивности фермента максимальной). Используйте сочетание оптимальных условий, возникающих для каждой переменной, чтобы определить оптимальную ферментного анализа, в котором каждая переменная присутствует в оптимальной концентрации.

figure-protocol-1
После гидролиза сложных эфиров п - нитрофенил, образуются Рисунок 1. р - нитрофенил эфиры в качестве искусственных субстратов для (фосфо) липазы в спектрофотометрического анализа. Кислотное (R-OH) и р -nitrophenol (р -np). В связи с рК а = 7.2 для диссоциации фенольного Н + от р -np, при рН> 9,2 более 99% находятся в ярко - желтой форме р -nitrophenolate и молярного коэффициента экстинкции 18,000 М -1 см - 1 может быть использован при длине волны 405 нм для количественного определения свободного р -nitrophenolate 22. Когда были использованы буферы с рН 8,5, оптическая плотность определяли при 400 нм и молярным коэффициентом экстинкции 14500 М -1 см -1 был использован 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Примечание: После того, как были определены оптимальные условия для активности фермента интерес, приступить к поискам реальной / физиологической субстрат этой липазы. В принципе, взять два, часто дополняют друг друга, подходы к достижению этой цели, в естественных условиях подход или подход в лабораторных условиях .

4. В естественных условиях Идентификация физиологического субстрата липазы

ove_content "> . Примечание: В подходе в естественных условиях, выражают липазы интерес в организме хозяина 8,11 для того , чтобы зарегистрировать в течение долгого времени , изменяет ли выражение липазы профиль host's липидный В другом подходе в естественных условиях, генерировать мутант , дефицитный представляющего интерес гена 8,11 и изучить ли ее липидный профиль отличается от дикого типа версии 6,8,11. для того , чтобы получить количественную оценку профиля липидов организма, простой способ состоит в радиоактивной клеточных соединений , извлечение липидов, отделяя их с помощью хроматографии, и количественной оценки радиоактивно меченных отделенных липиды.
  1. Радиоактивной липидов.
    1. Готовят на ночь предварительной культуры организма интерес (E.coli или S. meliloti) в 5 мл желаемой культуральной среды (комплекс среднего или определенный минимальный средний) и расти при 30 ° С.
    2. Из предварительной культуры, прививают в 20 мл самне свежую среду в колбе для культивирования емкостью 100 мл для получения начальной OD 620 = 0,3 для культуры.
    3. Берут аликвоту (1 мл) культуры в стерильных условиях и переносят в 14 мл стерильного полистирола с круглым дном трубки.
    4. Добавляют 1 мкКи [1- 14 С] ацетата (60 мКи на ммоль) в 1 мл культуры.
    5. Выдержите в жидкой культуре при перемешивании при 30 ° С в течение 24 часов.
    6. В конце инкубационного периода, передать культуру в микроцентрифужных трубки 1,5 мл и центрифугируют при 12000 х г при комнатной температуре в течение 5 мин.
    7. Ресуспендируют осадок в 100 мкл воды. На данный момент, хранить суспензии клеток при -20 ° С или сразу же продолжать с извлечением полярных липидов (раздел 4.2).
  2. Добыча полярных липидов.
    Примечание: Метод , описанный здесь , по существу , следует процедуре , описанной на Блай и Дайер 19.
    1. К 100 мкл водного клеток SUSPension, добавить 375 мкл метанола в хлороформе раствор (2: 1; об / об).
    2. Вихревые в течение 30 сек и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Центрифуга 5 мин при 12000 х г при комнатной температуре.
    4. Передача супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    5. Добавить 125 мкл хлороформа и 125 мкл воды, вихревые 30 сек.
    6. Центрифуга 1 мин при 12000 х г при комнатной температуре.
    7. Перенести Нижнюю фазу хлороформа в чистую пробирку и сухой с потоком газообразного азота.
    8. Растворение высушенных липидов в 100 мкл смеси хлороформ: метанол (раствор 1: 1; об / об).
      Примечание: В этот момент аликвоту 5 мкл раствора липида может быть определена количественно с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.
    9. Для анализа тонкослойной хроматографии (ТСХ), сухой вниз оставшиеся 95 мкл с потоком газообразного азота и растворяться высушенные липиды в 20 мкл смеси хлороформ: метанол (раствор 1: 1; объем / объем). Используйте 3 мкл аликвотыдля ТСХ-анализа.
  3. Разделение полярных липидов с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).
    Примечание: В зависимости от классов липидов, которые будут проанализированы различные комбинации твердых и подвижных фаз могут быть использованы для разделения. Здесь типичное разделение для заряженных полярных липидов и другой, больше подходит для нейтральных полярных липидов, с использованием высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) силикагель алюминиевых листов в качестве твердой фазы, изложены.
    1. Разделение заряженных полярных липидов двумерными ТСХ (2D-ТСХ).
      1. Нанесите 3 мкл аликвоты липидного образца в одном углу геля алюминиевого листа ВЭТСХ с силикагелем (10 х 10 см), 2 см от края пластины.
      2. Подготовьте и смешайте подвижной фазы (140 мл хлороформа, 60 мл метанола и 10 мл воды) для разделения в первом измерении.
      3. Покройте ТСХ разработки камеры с внутренней стороны хроматографической бумаги.
        Примечание: Это должно гарантировать, что газовая фаза из камерыбудет быстро насыщается (в течение 30 мин) после того, как подвижной фазы для первого измерение было добавлено в камеру и камера была закрыта со стеклянной пластиной.
      4. Подготовьте и смешайте подвижной фазы (130 мл хлороформа, 50 мл метанола и 20 мл ледяной уксусной кислоты) для разделения во втором измерении и передаче второй TLC развивающейся камере внутри покрытую хроматографическую бумагу, и пусть камеру насыщают.
      5. Тщательно передачи гель алюминиевый лист ВЭТСХ кремнезем с высушенного образца липида в первой камере и развивать (т.е. выполнять хроматографии) пластины в течение 60 мин в закрытой камере в первом измерении 5.
      6. Удалите пластину из камеры и дайте обсохнуть растворителей в капюшоне потока в течение 30 мин.
      7. После поворота пластины на 90 градусов по отношению к предыдущей хроматографии, перенесите силикагель алюминиевый лист HPTLC, на которых липиды были разделены в одном измерении, в SECONd камера и развивать пластины в течение 60 мин во втором измерении 5.
      8. Извлеките лист из камеры и дать растворителю высохнуть в ламинарном проточном в течение по меньшей мере 2 ч.
    2. Разделение нейтральных полярных липидов.
      1. Нанесите 3 мкл аликвоты образцов липида на гель алюминиевого листа ВЭТСХ кремнезема начиная 2 см от края пластины. Если несколько образцов анализируются в одномерной хроматографии, держать на расстоянии не менее 1,5 см между различными пятнами приложения.
      2. Подготовьте и смешайте подвижной фазы (140 мл гексана, 60 мл диэтилового эфира и 8 мл уксусной кислоты) и переноса в развивающейся камере ТСХ внутренне покрытые хроматографическую бумагу и покрытые стеклянной пластиной, чтобы позволить камерную насыщают (30 мин).
      3. Перенести силикагель алюминиевый лист HPTLC с высушенными образцами липидов в камеру и развивать пластины в течение 30 мин в закрытой камере.
      4. Удалите пластину из камерыи дать растворителю высохнуть в ламинарном проточном в течение 2 часов.
  4. Количественное и визуализация разделенных полярных липидов.
    1. После того, как разработанный ТСХ лист высохнет, инкубировать ее с экраном photostimulable люминесценцию (PSL) в закрытой кассете в течение 3-х дней.
    2. Expose инкубированных экран сканера PSL и приобрести виртуальный образ разделенных меченных липидов.
    3. Выполнение количественной оценки с использованием PSL программного обеспечения 20.
  5. Визуализация и выделение отдельных классов полярных липидов.
    1. Выдержите развитую ТСХ-лист в течение 10 мин в камере хроматографии в присутствии 1 г кристаллов йода.
      Примечание: Отдельно липидные соединения растворяет йод и появляются в виде коричневатых пятен.
    2. Круг пятна с карандашом, сравнить их относительной подвижности (R е) стандартных соединений (т.е. 1,2-dipalmitoyl- зп -глицерол, дипалмитоил-L-альфа-фосphatidylcholine, DL-α-monopalmitin, или пальмитиновой кислоты), а также определить, к которым липид класс они могут принадлежать.
    3. В вытяжном шкафу, пусть йод испаряется из листа ТСХ.
    4. С помощью шпателя, скрести силикагель, содержащий соединение, интерес со стороны листа, и извлечь соединение из силикагеля со смесью 100 мкл воды и 375 мкл метанола: раствор хлороформа (2: 1; ИЗД / об).
    5. Продолжить с извлечением согласно Блай и Дайер, как описано (4.2.2 и выше).
    6. Хранить очищенный класс липидов в 100 мкл хлороформа: метанола раствор (1: 1; объем / объем) при температуре от -20 ° С до использования.

5. In Vitro Идентификация физиологического субстрата липазы

Примечание: В подходе в пробирке, изучать ли липаза интерес может преобразовывать смесь отдельных липидов или отдельных чистых липидов к соответствующему HYDROLлиза продуктов в условиях, определенных в качестве оптимальной в 3.2.

  1. Используйте схемы пипетирования для анализов фермента согласно таблице 3 для PC конкретных фосфолипазы C SMc00171 (см 5.2), фосфолипазы А (см 5.3), и DAG липазы SMc01003 (см 5.4) активность.
  2. Определение фосфолипазы C активности PC специфические (Таблица 3).
    1. К 1,5 мл трубки микроцентрифужных, добавить 5000 импульсов в минуту (СРМ) из общего 14 С-меченого PC и раствор Тритона Х-100.
    2. Смешать и сушат в токе азота.
    3. Добавить диэтаноламин-HCl, рН 9,8 буфера, а также NaCl и MnCl 2 растворов и бидистиллированной воды для получения конечного объема 99,5 мкл. Vortex в течение 5 сек.
    4. Добавить 0,5 мкл фермента (5 мкг белка) (то есть, свободный от клеток экстракт , в котором избыточно экспрессируется SMc00171 присутствует) , чтобы инициировать реакцию. Кратко перемешать.
    5. Инкубируют при 30 ° С в течение 4 часов.
    6. Остановить реакцию с помощьюдобавление 250 мкл метанола и 125 мкл хлороформа.
    7. Экстракт липидов, как было описано ранее (см 4.2).
    8. Отдельные липиды одномерными (1D) -TLC (см 4.3.2 и 4.4), и анализировать их с помощью визуализации PSL.
  3. Определение активности фосфолипазы А (таблица 3).
    1. К 1,5 мл трубки микроцентрифужных, добавить 5000 СРМ всего 14 С-меченых фосфолипидов и раствор Triton X-100.
    2. Смешать и сушат в токе азота.
    3. Для окончательного анализа 100 мкл, добавляют Трис-HCl, рН 8,5, буфер раствором поваренной соли и воды. Vortex в течение 5 сек.
    4. Добавьте 5 мкл фермента (50 мкг белка) (то есть, свободный от клеток экстракт , в котором избыточно экспрессируется SMc00930 или SMc01003 присутствует).
    5. Инкубируют при 30 ° С в течение 5 часов.
    6. Остановить реакцию добавлением 250 мкл метанола и 125 мкл хлороформа.
    7. Экстракт липидов, как описано ранее (см 4.2), отдельныеих с помощью 1D-ТСХ с использованием 130 мл хлороформа, 50 мл метанола и 20 мл ледяной уксусной кислоты в качестве подвижной фазы, и анализировать их с помощью визуализации PSL.
  4. Определение диацилглицеринацилтрансферазы (DAG) активность липазы.
    1. Получение 14 С-меченного DAG.
      1. Радиоактивной С. meliloti культуры (см 4.1) и извлечь полярные липиды (см 4.2) , как описано. Отдельный S. meliloti Всего экстракты липидов по 1D-TLC в хлороформ: метанол: уксусная кислота (130: 50: 20; об / об) с использованием условий , описанных для разделения во втором измерении в 4.3.1.
      2. Визуализируйте PC йодом окрашивания и использовать карандаш, чтобы отметить локализацию фосфатидилхолин (PC).
      3. Изолировать радиоактивно ПК, как описано в 4.5.
      4. Количественно, извлеченной ПК с помощью сцинтилляционного счетчика.
        Примечание: О 320000 имп PC ожидается.
      5. Treat PC (250000 СРМ) с 0,1 U фосфолипазы С из Clostridium перфрингенс в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,2, 0,5% Тритона Х-100 и 10 мМ CaCl 2 в течение 2 часов в общем объеме 100 мкл , и реакцию останавливают добавлением 250 мкл метанола и 125 мкл хлороформа.
      6. Экстракт липидов, как описано выше и отдельно от них 1D-ТСХ (см 4.3.2).
      7. Изолировать диацилглицерина из диоксида кремния пластины и количественно с помощью сцинтилляционного счетчика (как описано в разделе 4.2)
    2. Анализ липазы диацилглицеринацилтрансферазы (таблица 3).
      1. К 1,5 мл трубки микроцентрифужных, добавить 5000 КПМ 14 С-меченного DAG и раствор Triton X-100.
      2. Смешать и сушат в токе азота.
      3. Для окончательного анализа 100 мкл, добавляют Трис-HCl (рН 9,0), буфер, раствором хлорида натри и дважды дистиллированной воды. Vortex в течение 5 сек.
      4. Инициировать реакцию добавлением 5 мкл фермента (50 мкг белка клеточного экстракта бесплатно).
      5. Инкубируют при 30 ° С в течение 4 часов.
      6. Остановить реакцию добавлением 250 мкл метанола А.Н.D 125 мкл хлороформа и экстракт липидов, как было описано ранее (см 4.2).
      7. Анализировать нейтральные полярные липиды от 1D-TLC (см 4.1.3.2) и последующего PSL визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активность PC конкретных фосфолипазы C SMc00171 с Бис р нитрофенил фосфатом

Бесклеточные экстракты , полученные из E. палочка BL21 (DE3) pLysS х, у которого было smc00171 выражены, были изучены на предмет их способности гидролизовать бис- р - нитрофенил эфиры фосфорной кислоты, с использованием спектрофотометрического анализа ферментативной,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние 20 лет, геномы многих организмов были секвенированы и хотя множество данных последовательностей генома была сформирована, функциональная интерпретация отстает и, следовательно, затрудняет наше понимание функции генома. функции генов в геномах часто присваиваются на основе сходства с генами известной функции или возникновения законсервированных мотивов. Тем не менее, точная функция данного гена часто не известна. Особенно, предсказанный структурные гены ферментов, не могут быть легко изучены с помощью OMIC м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Consejo Nacional де Ciencias у Tecnología-México (КОНАСИТ-Мексика) (82614, 153998, 253549 и 178359 в Investigación Cientifica BASICA, а также 118 в Investigación ан Fronteras-де-ла-Ciencia) и от Dirección генерала де Asuntos де Личный Academico-Autónoma Universidad Nacional де Мехико (DGAPA-НАУ; PAPIIT IN202616, IN203612).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ХлороформJT Baker9180-03TLC анализ и Экстракция липидов
МетанолJT Baker9070-03TLC анализ и Экстракция липидов
Уксусная кислотаJT Baker9507-05TLC анализ и Липидная экстракция
ГексаныJT Baker9309-02TLC анализ и Экстракция липидов
DiethyletherSigma32203Ферментативные анализы
бидистиллированной воды  ANY  NAФерментативные анализы
Tris BaseSigmaT-1503Ферментативные анализы
HClBaker9535-02Ферментативные анализы
NaClBaker3624-01Ферментативные анализы
Triton X-100SigmaX-100Ферментативные анализы
LB бульонANYNAБактериальный рост, 10 г триптона + 5 г дрожжевого экстракта + 10 г NaCl за литр бидистиллированной воды
триптонаBecton Dickinson and Company211705Бактериальный рост
дрожжевого экстрактаBecton Dickinson and Company212750Бактериальный рост
TY бульонANYNAБактериальный рост, 8 г триптона + 3 г дрожжевого экстракта + 66 мг CaCl2· 2H2O на литр бидистиллированной воды
CaCl2· 2H2OBaker1332-01Ферментативные анализы
изопропил-&бета;-D-тиогалактозид (IPTG)Invitrogen15529-019Бактериальный рост
ДиэтаноламинSigmaD-8885Ферментативные анализы
MnCl2Sigma221279Ферментативные анализы
фосфолипазы A2 змеи веномSigmaP0790Ферментативные анализы
фосфолипазы C Clostridium perfringensSigmaP7633Ферментативные анализы
Bis-p-нитрофенилфосфатSigma07422AHФерментативные анализы
p-нитрофенилстеаратSigmaN3627Ферментативные анализы
p-нитрофенилдодеканоатSigma61716Ферментативные анализы
p-нитрофенилдеканоатSigmaN0252Ферментативные анализы
p-нитрофенилпальмитатSigmaN2752Ферментативные анализы
p-нитрофенилбутиратSigmaN9876Ферментативные анализы
p-нитрофенилоктаноатSigma21742Ферментативные анализы
Уксусная кислота, соль натрия [1-14C]Perkin ElmerNEC084Бактериальный рост
диметилсульфоксид (DMSO)JT Baker9224-01Ферментативные анализы
Алюминий HPTLC силикагель 60 планшетов. Пластины из силикагеля HPTLC размером 20 х 20 см, 25 листов.Merck105547TLC анализ и Спектрометр для экстракции липидов
UV/VIS Лямбда 35Perkin ElmerNAФерментативные анализы
Storm 820 PhosphorimagerMolecular DynamicsNAФотостимулирующий люминесцентный сканер 
Многоцелевой сцинтилляционный счетчикBeckman CoulterNAКоличественная оценка радиоактивности
Французская ячейка давленияThermoSpectronicNA Поломка ячеек
хроматографическая бумага 3MM ChrWhatman3030917анализ TLC
Sinorhizobium meliloti 1021нашассылка 11изученный штамм
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Компетентные клеткиNovagen69451экспрессия белка
штамм pET9a векторNovagen69431вектор экспрессии белка
pET17b vectorNovagen69663вектор экспрессии белка
стерильный полистирол круглодонная пробирка (14 мл) FalconBecton Dickinson352057радиоактивное мечение бактериальных культур
полипропиленовые микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)Eppendorf30125.15Ферментативные анализы
1,2-дипальмитоил-sn-глицеринSigmaD9135стандартный липид
L-α-фосфатидилхолин, дипальмитоилSigmaP6267стандартный липид
DL-α-монопальмитинSigmaM1640липид стандартный
пальмитиновая кислотаSigmaP0500липид стандартный

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).
  2. Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
  3. Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).
  4. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids? Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
  5. De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
  6. Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
  7. Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
  8. Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
  9. Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
  10. Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria? Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
  11. Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
  12. Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
  13. Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  15. Untergasser, A., et al. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).
  18. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).
  19. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
  20. Molecular Dynamics. Phosphorimager SI User´s Guide. , http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf (1994).
  21. Dixon, M., Webb, E. Enzymes: Third Edition. , Longman, USA. (1979).
  22. Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
  23. Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
  24. Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).
  25. Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
  26. Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
  27. Scopes, R. K. Protein Purification, Principles and Practice. , Springer. New York. (2010).
  28. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lipase ActivityPhospholipase AssayEnzyme OptimizationSubstrate SpecificityChromogenic SubstratesThin Layer ChromatographyRadioactive LabelingPhosphatidylcholine DegradationDiacylglycerol LipaseSinorhizobium Meliloti

Похожие статьи