Измерение прогрессирующее неврологическое инвалидности в мышиной модели множественного склероза

Theiler в Мышиные энцефаломиелит Вирус (TMEV) является нейротропные одноцепочечной РНК-содержащий вирус, который заражает упорно мышиный центральную нервную систему (ЦНС). У восприимчивых мышей, инфекция с TMEV вызывает иммунный опосредованной, хронический прогрессирующий демиелинизирующее заболевание, известное как TMEV индуцированных демиелинизирующих заболеваний (TMEV-йодной). Экспериментальное заражение мышей происходит течения заболевания, напоминающего, что видели в прогрессивных форм рассеянного склероза (РС). TMEV-IDD характеризуется двумя различными фазами: острой фазе и хронической фазе. Острая фаза представляет собой мягкий, обычно субклинический энцефалит ^1,2. Во - вторых, хроническая фаза, начиная примерно через месяц после заражения, состоит из медленно прогрессирующей инвалидности характеризуется демиелинизации, воспаление и повреждение аксонов ^1,2. Слабость наблюдается у мышей связано с спастичности, а иногда и тяжелые тонических спазмов.

Потому что на данный момент нет medicatioнс для улучшения прогрессивной инвалидности у больных, исследователи особенно привлекает TMEV-йодной, которая представляет собой оптимальную модель животных для мониторинга воздействия модификации болезни препаратов на прогрессирование заболевания. Тем не менее, у мышей, а также у больных с МС, мониторинг прогрессии инвалидности требует непрерывного клиническое наблюдение в течение продолжительных периодов времени. У мышей, долгосрочный мониторинг прогрессирования инвалидности может быть выполнена с помощью теста производительности Rotarod.

Тест производительности Rotarod является стандартным поведенческий тест, который оценивает двигательные-ассоциированные функции, такие как координация, баланс, и усталость у грызунов. Мыши должны держать свой баланс на токарном стержень, который вращается под постоянным ускорением; время латентности падать от этого стержня записывается. Животные с неврологической дисфункции не в состоянии оставаться на вращающемся стержне до тех пор, как элементы управления, и они обычно уходят, когда скорость вращения превышает ихмощность двигателя. Чем больше неврологические нарушения у животных, тем быстрее они падают стержня, и тем короче время латентность.

Преимущество теста Rotarod над традиционными визуальных систем оценки является то , что она создает объективную, измеримой переменной время задержкам , которые в конечном счете могут быть использованы для статистического анализа для количественной оценки последствий лечения и экспериментальных процедур ^3.

В лаборатории нейроиммунология (Лони) в Дартмуте, мышей подвергаются протоколу адаптации, где они испытаны до TMEV инфекции с целью ознакомления их с машиной и оценить их нормальную "базовый" баланс координации и управления двигателем ^{4, 5.} После того, как исходный уровень установлен и мышей заражают TMEV, они проверяются один раз или два раза в неделю в течение нескольких месяцев. Фактический протокол тестирования длится в среднем 150 дней, что позволяет провести оценкуснижение баланса, координации и управления двигателем на всем протяжении болезни демиелинизации.

Несколько сотен TMEV-междугородний и имитацией мышей, обработанных были протестированы до сих пор для неврологической дисфункции в Дартмуте. Эти мыши получали различные иммуномодулирующие методы лечения, но ни один фармакологический агент не был признан эффективным в улучшении прогрессии инвалидности ^6,7. Настоящая статья и соответствующий протокол описывают, каким образом характеризовать прогрессивную неврологические нарушения, отображаемый мышей TMEV-ЙДЗ. В частности, протокол предлагает рекомендации конкретных параметров тестирования как считается, как правило, пригодны для изучения неврологического инвалидности у мышей TMEV-ЙДЗ с помощью теста Rotarod. Эта процедура обеспечивает основу против которой можно оценить (1) актуальность этой модели мыши с прогрессирующим рассеянным склерозом и (2) его полезность для тестирования методов лечения, направленных на лечение прогрессивных неврологических заболеваний, таких как MS. Очевидно, чтоRotarod тест производительности и текущий Оптимизированные параметры тестирования и протокол не полезны только при обнаружении прогрессирующее неврологическое инвалидности в мышиной модели TMEV-IDD, но также могут быть использованы в раскрытии ухудшений в других вирусиндуцированного и / или генетической мышиных моделях нейродегенеративных заболеваний.

Все животное работа использует протоколы рассматриваются и утверждаются по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) в GEISEL Медицинской школе в Дартмуте путем.

1. Модель мыши

1. Индукция TMEV-индуцированной демиелинизирующих заболеваний
   1. Перемещение клетки, содержащие от 4 до 6-недельного возраста самка SJL / Jhan мышей от стойки до комфортного рабочего пространства. Отметьте мышей (например, с тегом уха или ушной удар) , чтобы для индивидуальной оценки клинического и гистологического заболевания.
   2. Draw 30 мкл TMEV инфицирующего запаса (2 х 10 ⁶ бляшек единиц , образующих; БОЕ) в PBS в шприц инсулина 29- го калибра и иглы.
   3. Подготовить машину анестезии газа: проверить систему, чтобы обеспечить наличие достаточного количества кислорода и изофлуран для длительности процедуры.
   4. Включите расходомер до 1 л / мин. Поместите животное в индукционную камеру и герметизировать верхнюю часть. Включите ваporizer до 3,5% и контролировать животное до лежачие.
   5. Удалить животное из камеры и протестировать мышь, зажимая в подушечку лапы, чтобы обеспечить адекватную анестезию. Отсутствие реакции на сильный крайнем случае указывает на адекватную анестезию.
   6. Очистите место инъекции 70% изопропилового спирта.
   7. Впрыскивать 30 мкл TMEV вдувания запаса в правое полушарие головного мозга путем инъекции ( от руки рисунок 1). Место инъекции находится примерно на полпути между глаз и ушей линии и в непосредственной близости от средней линии.
   8. Возвращает мышь, чтобы его проведения клетки после полного оповещения и мобильный (обычно 3 - 5 мин).
   9. Эвтаназии мышей от обескровливания или сердечной перфузии от 3 до 6 месяцев после того, как TMEV инфекции, в зависимости от быстроты развития заболевания.

2. Анализ Rotarod

1. Аппарат Rotarod
   1. Тестовые мышей до TMEV к инфекции, чтобы ознакомить их смашины и оценить их нормальный базовый баланс координации и управления электродвигателями.
   2. Запустите протокол адаптации на -5 дней после заражения (точек на дюйм, то есть за 5 дней до TMEV инфекции).
   3. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться в комнату тестирования по крайней мере за 30 минут до Rotarod тестирования, для того, чтобы дать им возможность приспособиться к окружающей среде.
   4. Убедитесь , что как блок Rotarod и компьютер подключен к сети и друг с другом (рис 2).
   5. Предварительно установите Rotarod с -5 точек на дюйм параметров протокола обучения, как описано в таблице 1.
   6. Сохраните файл работы с информацией о дате и идентификации.
   7. Переместить клетку, содержащую команду для тестирования от стойки к столу, примыкающей к Rotarod. Мыши, как правило, проходят в дружин 4.
   8. Возьмите мышь за хвост и поместите его на стержне, обращенный в сторону от оператора. Повторите эти действия для второго по четвертый мыши. Если в FAL мышиLs или прыгает, поместить его обратно в свою полосу на Rotarod, пока все мыши не находятся в положении. Не обращайте внимания, если какие-либо мышей повернуться лицом к оператору.
   9. После загрузки всех мышей, нажмите кнопку "Enter", чтобы начать эксперимент. Соблюдайте таймеры запускаются автоматически и оборотов в мин (оборотов в минуту) на дисплее для каждой полосы движения.
      1. Поскольку каждое животное падает из стержня, записывать скорость стержня в момент падения, а также продолжительность времени животное оставалось на стержне. Стержень будет продолжать вращаться, пока последнее животное не упало с узла стержня.
   10. После того, как все мыши пали, использовать ткань, чтобы удалить любые фекальные Boli и мочи из стержня. Присутствие мочи и фекалий может повлиять на способность мышей для захвата стержня.
       1. После 3-минутного отдыха, дают мышей второй, а затем третий судебный процесс. Максимальное время на одном испытании составляет 240 сек. Администрирование в общей сложности 3 испытаний в течение каждого испытательного дня.
   11. Вернуть мышей в родную клетку и вернуть их обратно в стойку. По окончании экспериментального сеанса, очистить Rotarod с мылом и водой, чтобы удалить все фекалии от машины.
   12. Протирать плиту основания с этанолом 70%. Спрей вниз всю машину с диоксидом хлора для дезинфекции.
   13. В дни - 4, - 3, - 2 и 1 - пи, предварительно установить Rotarod с соответствующими параметрами протокола обучения, как описано в таблице 1, и повторите шаги 2.1.2 2.1.12.
   14. После получения базовых мер, заразить мышей с TMEV. Разрешить 6-дневный период восстановления пи.

протокол	День тестирования	частота	Скорость Запуск двигателя (оборотов в минуту)	МаксимумСкорость (оборотов в минуту)	ускорение	Испытания	ITI
					(оборотов в минуту / сек)	(N х сек)	(мин)
Обучение	- 5 точек на дюйм	1 день	1	12	01/03	3x240 сек	3
	- 4 точек на дюйм	1 день	1	13	01/03	3x240 сек	3
	- 3 точек на дюйм	1 день	1	14	01/03	3x240 сек	3
	- 2; - 1 дюйм	1 день	5	40	01/03	3x240 сек	3
экспериментальный	От +7 до +50 точек на дюйм	2 недели	5	40	05/30	3x240 сек	3
	От +51 до +150 точек на дюйм	1 неделя	5	40	05/30	3x240 сек	3

Таблица 1: Rotarod Параметры в тренировочных и экспериментальных протоколов.

2. Экспериментальный протокол Rotarod
   1. На +7 точек на дюйм, предварительно установить Rotarod с соответствующими параметрами протокола эксперимента, как описано в таблице 1. Повторите шаги 2.1.2 2.1.10.
   2. В конце пробного # 3, взвесить каждую мышь и запишите вес тела на листе данных. Чистый и дезинфицировать Rotarod в соответствии с шагами 2.1.11 и 2.1.12.
   3. Испытание мышей два раза в неделю в течение последующих 6 недель, как описано выше. Через 6 недель (в которых мышей , вероятно , достигала фазы плато) ^8,9, тест на мышей один раз в неделю с той же experimentaл протокол. Фактический протокол тестирования длится в среднем 150 дней, в зависимости от конкретного течения заболевания.
3. Неврологическое Функциональный индекс
   1. Экспорт необработанных данных в файл электронной таблицы и анализировать результаты.
   2. Экспресс - данные , как время работы (рисунок 3А): это нормальное время работы плюс пассивное время вращения минус время задержки вращения (Таблица 2) ^10. Вычислить среднее время работы трех испытаний в день.
   3. Экспресс данные в виде неврологического функционального индекса (НИЛ; фигура 3В).
      1. Вычислить эпидемический порог производительности каждой отдельной мыши. Порог базовой производительности определяется как среднее всех запущенных время от дня + 15 до + 45 пи ^6,7.
      2. Вычислить НИЛ как среднее из трех самых последних средних времени работы , деленное на пороге базовых характеристик этого ^6,7 конкретных мыши ^</ SUP>.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если тестируемый продолжительности работы для мыши в день + 72, + 76 и + 79 пи на 55 сек, 45 сек, 50 сек, а базовое время для той же мыши составляет 135 сек, NFI для этой мыши на +79 точек на дюйм будет [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 или 0,37.
   4. Экспресс данные как скорректированная NFI (adjNFI; Рисунок 3C): скорректировать данные NFI значением населения для одного эксперимента.
      1. Вычислить adjNFI путем деления значения NFI на среднее NFI, полученный мнимого группой, обработанной в этот конкретный день.

Срок	Определение
Обычное время работы	Общее время мышь тратит активно работает на вращающемся стержне, то есть задержка падать.
Пассивная время вращения	крепление времени мышь остается на стержне в режиме пассивного вращения.
Вращение время задержки	Количество времени, курсор остается на стержне в режиме пассивного вращения
Пассивный режим вращения	Когда мышь захватывает стержень и вращается без необходимости передвигаться.
Общее время сеанса	Общее количество времени, курсор остается на вращающемся стержне в течение сеанса.
Базовый уровень производительности	Предварительно ущерб производительности двигателя оценивается для определения минимального порога производительности.
Неврологическое индекс функции (НИЛ)	Клинический показатель, который сравнивает каждую двигательную мыши, то есть, время работы, в любое время до его пиковой производительности.
Скорректированный индекс неврологической функции (adjNFI)	Когда процесс нормализации применяется для корректировки данных NFI значением для населенияединственный эксперимент.
значение населения	Среднее значение ИЯС полученный мнимого группой, обработанной в определенный день.

Таблица 2: Определения параметров Rotarod Принят к Количественно неврологическими нарушениями.

Цель этого репрезентативного эксперимента было сравнение неврологическую инвалидность, вызванную Daniels (DA) штамма и штамма боб TMEV. Для целей настоящего исследования, группа из 32 самок мышей SJL были инфицированы интракрани- с TMEV, либо штамм DA (n = 16) или штамм Bean (п = 16), и их клинические признаки контролировались в течение долгого времени. Еще одна группа из 20 мышей была фиктивным лечение (то есть, физиологический раствор вводили интракрани-) и служила в качестве контрольной группы здоровых.

Тест производительности Rotarod был использован для оценки прогрессирования хронических заболеваний в TMEV-инфицированных мышей и контрольных мнимым. Мыши были индивидуально ухо маркированы и подвергали протоколу адаптации ежедневно в течение недели перед введением TMEV, а затем к фактическому протоколу тестирования, которая длилась 125 дней. Для каждого испытательного дня, времени работы, определяется как длина Т.И.мне мышь осталась на стержне, хранился отдельно для каждой мыши, как среднее значение из 3-х испытаний на этот день. Rotarod данные также выражается как NFI и в качестве мнимого-нормализуется adjNFI.

Как показано на рисунке 3А, инфекция с TMEV отрицательно сказывается на продолжительности работы мышей. А повторных измерений двухсторонним ANOVA показали значительное влияние TMEV инфекции (F = 56,76, р <0,0001), а также значительное влияние времени (F = 3,26, р <0,0001) и взаимодействие времени обработки (F = 8,065, р <0,0001). Тест множественного сравнения следующие действия Даннета показали , что обе группы TMEV-инфицированных мышей имели значительно более низкие значения NFI , чем у мышей фиктивных (р ≤ 0,01; Рисунок 3В). Различие было статистически значимым, начиная с дня + 61 пи до конца наблюдения (Фигура 3В). Там не было никакой разницы соmparing прогрессирования инвалидности у мышей , инфицированных штаммом Bean и лиц , инфицированных штаммом DA во всех временных точках (р> 0,5; рис 3C).

Рисунок 1:. Внутричерепное Инъекция Для выполнения внутричерепные инъекции, мышь газа под наркозом и сдержанным на твердой поверхности. До 30 мкл надежно вводили в мозг мыши. Место инъекции примерно на полпути между глаз и ушей линии и в непосредственной близости от средней линии. A 30 G игла непосредственно пронзает череп и инсулиновый шприц удобно использовать , чтобы игла от распространения слишком глубоко в мозг. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 2: Rotarod Аппарат Испытание Rotarod является стандартным психофизиологические анализа , в котором мышей обучаются работать на вращающемся стержне и приурочены, как долго они могут оставаться на стержне , как он медленно ускоряется. Стержень подвешен над полу клетки, а мыши, естественно, стараются держаться на стержне, чтобы не упасть на землю. Падение от стержня к основанию прибора не вызывает никаких травм у мышей. A) Стандартный Rotarod аппарат состоит из приводом от двигателя стержня с постоянными или ускоряющих скоростью. B) Панели разделить стержень на отдельные полосы движения, каждый из которых подходит для отдельное животное. Общее количество 4 мышей могут быть проверены в ходе каждого испытания. C) Стержень в 1.18. (Около 3 см) в диаметре, а его поверхность насечкой, что позволяет мыши , чтобы получить лучшее сцепление с дорогой. Падение мыши точно отслеживается, что фотолучаавтоматически записывает количество времени, потраченного на стержне. Экспериментальные данные записываются в компьютер после того, как мыши все упали от штанги. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Rotarod технических характеристик Испытания в TMEV-инфицированных мышей и имитацией контроля Испытание Rotarod проводили для измерения моторной функции мнимого, DA-инфицированных и бобовыми-инфицированных мышей. Кроме того , время работы (сек) (А), также были выражены данные Rotarod в качестве индекса неврологической функции (NFI) (B) и фиктивный-нормализуется скорректированной NFI (adjNFI) (C). Задержка падать с ускоряющим Rotarod измеряли в трех исследованиях в день. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). кипауе круг, п = 16 Bean-инфицированных мышей; красные квадраты, N = 16 DA-инфицированных мышей; черные треугольники, п = 20 фиктивных обработанных элементов управления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.