В Vivo Изучение человеческого взаимодействия Эндотелиальная-перицитов Использование гелевой матрицы штепсельной вилки пробирного мыши

Краткое содержание

Мы представляем протокол для изучения взаимодействия эндотелиальной-перицитов человека в мыши с помощью изменения гелевой матрицы плагин ангиогенеза анализа.

Аннотация

Ангиогенез — это процесс, при котором из существующих сосудов образуются новые кровеносные сосуды. Рост новых сосудов требует скоординированной пролиферации, миграции и выравнивания эндотелиальных клеток для формирования трубчатых структур с последующим привлечением перицитов для обеспечения поддержки стенки и облегчения созревания сосудов. Современные подходы к культивированию клеток in vitro не могут полностью воспроизвести сложную биологическую среду, в которой эндотелиальные клетки и перициты взаимодействуют, образуя функциональные сосуды. Мы представляем новое применение анализа матричной гелевой пробки in vivo для изучения эндотелиально-перицитарных взаимодействий и формирования функциональных кровеносных сосудов с использованием мышей с тяжелой комбинированной мутацией иммунодефицита (SCID). Вкратце, матриксный гель смешивают с раствором, содержащим эндотелиальные клетки с перицитами или без них, после чего вводят в спину мышей под наркозом при ТКИН. Через 14 дней матричные гелевые пробки удаляются, фиксируются и рассекаются для гистологического анализа. Длина, количество, размер и степень перицитарного покрытия зрелых сосудов (определяемая наличием эритроцитов в просвете) могут быть количественно оценены и сравнены между экспериментальными группами с использованием коммерческих статистических платформ. Помимо использования в качестве анализа ангиогенеза, этот матричный анализ гелевой пробки может быть использован для проведения генетических исследований и в качестве платформы для разработки лекарств. В заключение следует отметить, что этот протокол позволит исследователям дополнить имеющиеся анализы in vitro для изучения эндотелиально-перицитарных взаимодействий и их значимости как для системного, так и для легочного ангиогенеза.

Введение

Ангиогенез представляет собой процесс , посредством которого образуются новые кровеносные сосуды из предварительно существующей сосудистой сети ¹ и является предметом текущих исследований во многих областях , начиная от нормального развития болезни. Этот динамический процесс включает пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЭКС) и набор перицитов построить сосудистую трубку, которая направлена в сторону участка , который нуждается в кислороде и доставку питательных веществ ^2. Для изучения этого процесса требует столь же динамический анализ, самое главное тот, который может резюмировать трехмерную природу формирования трубки. В пробирке 3D матричные анализы были разработаны для удовлетворения этой потребности и работали хорошо , чтобы позволить исследователям определить дискретные шаги в пространстве и времени , в котором ангиогенез имеет место ^{3, 4, 5, 6.} Тем не менее, эти модели в пробирке 3D матрицы ограничиваются изучением не-перфузию сосудов наd поэтому не имеют критических компонентов , имеющих отношение к процессу ангиогенеза (например, циркулирующей роста и ингибирующие факторы, неестественное напряжение / силы через сосудистого русла) и не в состоянии смоделировать сложную среду , присутствующей в живой ткани. Для устранения этого ограничения, несколько в естественных условиях анализов ангиогенеза были разработаны ^7, включая пробки анализа матрицы геля , которая будет находиться в центре нашего доклада ^{8, 9.}

Анализ гелевая матрица штепсель хорошо налаженные естественных условиях ангиогенез анализа в который обращается к исследователям , поскольку она обеспечивает надежную платформу для тестирования роли различных клеток и веществ в ангиогенеза. Матрица гель представляет собой коммерчески доступный раствор базальная мембрана, которая секретируется Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) линии клеток мыши саркомы, которая затвердевает в виде материала гелеобразную при 37 ° С. Гель матрица может быть смешана с клетками и / или веществ, таких как факторы роста, а также ИнджеИДКТК подкожно в мышь. Хозяин КЭ вторгнутся пробку в течение 14 дней, образуют сосудистую сеть, и стать перфузии кровью хозяина. На сегодняшний день, подключаемые анализы матрицы геля были сосредоточены исключительно на изучении поведения эндотелиальных клеток во время ангиогенеза, однако, насколько нам известно, никаких усилий не было сделано, чтобы определить, является ли этот анализ может быть использован для совместного культивирования эндотелиальных клеток и перицитов изучить, каким образом эти два типа клеток взаимодействуют во время ангиогенеза. В частности, понимание взаимосвязи между КЭ и перицитов является ценным для изучения заболеваний , где потеря кровеносных сосудов патологическое, в том числе микрососудистой ишемии и болезни периферических сосудов ^{10, 11, 12.}

Здесь мы опишем протокол, который вводит человека полученный перицитов к смеси гелевой матрице наряду с человеческим КЧС и фактор роста фибробластов (bFGF). Затем эту смесь можно вводить подкожно яп спинке мышей SCID, чтобы обеспечить образование полностью функциональным, перицитов покрытием, гибридные сосуды. Наш протокол описывает, как подготовить матрицу геля пробки, содержащие человеческие ECs с или без человеческих перицитов, помещение в SCID мышей и как анализировать гистологических срезов для критических ангиогенеза конечных точек.

Протокол

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Стэнфордском университете в Школе медицины.

ПРИМЕЧАНИЕ: Животные находятся под обезболиванием с 3% изофлуран испарителя и поставки газа O ₂ 3%. Использование ветеринарную мазь на глаз может помочь предотвратить сухость под наркозом.

1. Подготовка сотового

1. Grow эндотелиальные и перицитов культур клеток человека в 100-мм чашках с 10 мл соответствующего средства массовой информации. Заменить 10 мл свежей среды каждые 2 - 3 дня до клетки достигают 80% слияния.
   1. Культура эндотелиальные клетки (ПАУ) в полной среде эндотелиальных клеток (ECM), дополненной компанией поставляется 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10% пенициллина / стрептомицина и 10% дополнительно роста эндотелиальных клеток.
   2. Культура перицитов в полной перицитов средах (ПМ), дополненной компания поставила 2% FBS, 10% пенициллин / стрептомицин и 10% роста добавки перицитов.
2. Готовят смеси клеток
   1. Рассчитать необходимое количество ячеек для экспериментальной и контрольной групп.
      Примечание: Каждый модуль в экспериментальной группе содержит один миллион (1 х 10 ⁶⁾ человека ЭКС и двести тысяч (2 х 10 ⁵⁾ перицитов. В контрольной группе, каждый плагин содержит только 1,2 миллиона человеческих ECs. Группа отрицательного контроля имеет только гелевую матрицу. Каждая группа должна включать, по меньшей мере, четыре заглушки, которые требовали бы двух мышей, как штекеры могут быть введены в каждую сторону от нижней на мыши обратно. Три пробки будет служить в качестве трех повторностях для эксперимента, а четвертый может быть использован в случае, если один терпит неудачу. Приготовьте 25% дополнительные ячейки, чтобы соответствовать дополнительный объем геля.
   2. Сбор и подсчет клеток из культуры пластин.
      1. Для того, чтобы отделить клетки, удалить носитель и мыть один раз с комнатной температуры 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Удалить PBS, добавляют 1 мл 0,25% трипсина / 2,21 мМ ЭДТА, и инкубируют в течение 1 мин. Вымойте клетки от пластины путем добавления 2мл среды и собирают в 15 мл пробирку.
      2. Подсчета клеток с помощью гемоцитометра в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. Центрифуга соответствующее количество клеток в гранулы при 400 х г в течение 5 мин. Для экспериментальной группы, центрифугу и ЭКС и перицитов вниз вместе в одну гранулу.

2. Матрица геля Приготовление

1. Оттаять гелевую матрицу полностью при температуре 4 ° С в течение 4 часов или в течение ночи, чтобы получить гомогенный раствор. Смешивание не требуется.
2. гелевую матрицу аликвоты в 1,5 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
3. Предварительно охлажденные стерильные 1,5 мл пробирки и 28 G 1 куб.см инсулиновые шприцы при температуре 4 ° С. Внимание: Хранить матрицу геля на льду во все времена.
4. Смешайте гелевую матрицу холодной с bFGF в объемном соотношении 1: 100 (конечная концентрация bFGF = 0,5 мкг / мл; bFGF маточного раствора = 50 мкг / мл) после смешивания раствора гелевую матрицу пипетированием вверх и вниз несколько раз, инкубировать на льду в течение 30 - 60 мин бEfore смешивания с клетками на этапе 3.1.
   Примечание: Разморозить запаса bFGF перед смешиванием. Подсчитайте число заглушек, необходимых для инъекций. Например, каждый плагин требует 200 мкл матричного геля. Таким образом, подготовить 25% дополнительного геля.

3. Перемешать Матрица Гель с клетками

1. Для каждой группы, ресуспендируют осадок клеток (содержащий соответствующее количество клеток) с расчетного объема матричного геля, содержащего bFGF. Осторожно перемешать, чтобы избежать пенообразования и оставить в 15 мл пробирку на льду, пока мыши не подготовлены для инъекций.

4. Подготовка мыши

1. Обезболить 1 SCID мышей в течение 5 мин в 3% Isoflurane плюс 3% O ₂ в индукционной камере. Фокус на одной экспериментальной группе, или 2-х мышей, в то время.
2. Отключив мышь от индукции камеры, место на грелку вентральной стороной вниз и быстро прикрепить морду насадку к лицу мыши через систему без возвратного дыхания для подачи анестезии по всей ИнджеПроцедура фикция. Переключение газового потока из индукционной камеры к системе без возвратного дыхания и понижают давление газа до 1,5% изофлуран и 1,5% O _2.
3. Удалить волосы с обеих боковых областей задних (около диаметром 1 см) с кремом для удаления волос или бритвы.
4. Протрите участок кожи с спиртовым тампоном на 70%.
5. Возвращение мышь к индукции камеры и повторите шаги 4.2 - 4.4 со второй мыши.

5. Матрица Гель для инъекций

1. Подготовьте одну мышь для инъекций путем присоединения к системе без возвратного дыхания и размещения на грелку вентральной стороной вниз.
2. Нагрузка матричного геля в предварительно охлажденный 28 G 1 куб.см инсулиновый шприц одной мыши в то время.
   1. Загрузить полный объем 500 мкл матричного геля для двух вилок (200 мкл на штекер плюс 25% за дополнительную плату) в шприц.
   2. Убедитесь, чтобы придать гелевой матрицы в мышей в течение 3 мин после загрузки клеток в шприц, чтобы предотвратить CELLS оседать на боковой стороне шприца и чтобы предотвратить гелевую матрицу затвердевание внутри шприца.
3. Поднимите заднюю кожу, чтобы определить местонахождение подкожное пространство, а затем вводят 200 мкл геля матрицы медленно и равномерно в подкожное пространство задней задней части грудной клетки.
4. Удалить инъекционную иглу медленно, соблюдая осторожность, чтобы не допустить гелевую матрицу от утечки из места инъекции. Буферный сформирует в месте инъекции. Протрите место инъекции с спиртовым тампоном.
5. Повторите инъекции шаги 5.2 - 5.5 на другой стороне задней части мыши, а затем оставить мышь на спине в течение 1 мин, чтобы позволить гелеобразование геля матрицы на тепловой площадку.
6. Outline обе ударах с использованием постоянного маркера для идентификации шишка через 14 дней. После того, как некоторые волосы вырастают снова, это будет легче найти шишку.

6. Матрица геля штепсельной вилки Изоляция: через 14 дней после инъекции

1. Эвтаназии мышей гуманно, подвергая животноес до> 5 мин ингаляции диоксида углерода с последующим смещением шейных позвонков, чтобы гарантировать смерть.
2. Удалите матрицу геля вилку из спины мыши.
   1. Аккуратно удалите отросших волос вокруг места инъекции, где пробка расположена, повторив шаг 4.3. Маркер линия указывает размер оригинального бугорок под кожей.
   2. Акцизный пробку вместе с окружающими слоями кожи и мышц, прикрепленных на верхней и нижней сторонах вилки, соответственно.
      1. Использование тонких хирургические ножницы, надрезать на отмеченной границе вилки, которая перпендикулярна к коже и прорезать к мышце под пробкой. Затем осторожно обвести периферии пробки вдоль отмеченной границы.
      2. Удалите пробку, удерживая ее зажатой между кожей и мышечных слоев. Немедленно промыть в небольшом стакане с 1x PBS, чтобы смыть лишнюю кровь. Вилка теперь готова быть фиксированной (следующий шаг, 6.3).
3. Закрепить PLUг в 4% параформальдегид.
   1. Поместите всю пробку, включая кожу и мышечные слои, в 50 мл пробирку с 25 мл 4% параформальдегида в течение 24 ч при комнатной температуре без раскачивания. На следующий день, перевести вилку в 25 мл 70% этанола в течение еще 24 ч до парафин.
      Примечание: Ручка параформальдегида с осторожностью. Носить перчатки.

7. Парафин Процесс гелевой матрицы штепсельной вилки

1. Подготовить пробку для парафин.
   1. Сориентируйте заглушку , как показано на рисунке 1а; поместите пробку в кассету ткани таким образом, чтобы сторона вилки была обращена вверх, и как кожи, так и мышечные слои видны по всей поверхности блока тканей, которые будут сокращены в первую очередь во время секционирования.
2. Парафин вставлять вилку в соответствии со стандартными протоколами парафиновых встраивания ^13.
3. Вырезать 8 - 10 мкм толщиной секций от блока ткани и смонтировать на предметные стекла микроскопа Accorдинь со стандартными парафиновых секционирования протоколов ^13.
4. Храните слайды в прохладном и сухом месте при комнатной температуре до готовности к окрашиванию.

8. Пятно Секции гематоксилином и эозином Stain (H & E) ¹³

1. Де-paraffinize срезах тканей путем пропускания через слайды 100% ксилола в два раза, 100% этанол, 95% этанола, 70% этанола и, наконец, 1X PBS, каждый в течение 5 мин при комнатной температуре. Оставьте слайдов в 1X PBS до следующего шага.
2. Пипетка 100 мкл раствора H & E на участке и не инкубировать в течение 1 - 5 мин, или пока имеется четкий контраст между голубыми ядрами и розовой цитоплазмы в клетке, если смотреть под вертикальным световым микроскопом при 10-кратным увеличением. Будьте осторожны, чтобы не допустить, чтобы любое решение H & E прикоснуться к цели.
3. Мытье H & E решение от слайда по Данкинг слайд в большом стакане водопроводной воды, а затем поместить слайд в стойку в стакане и промойте проточной водой в течение 2 мин.
4. Moве к шагу 9.8 для установки слайдов.

9. Пятно Другие Слайды для человека капилляры и Перициты

1. Де-paraffinize срезах тканей путем пропускания через слайды 100% ксилола в два раза, 100% этанол, 95% этанола, 70% этанола и, наконец, 1X PBS, каждый в течение 5 мин при комнатной температуре. Оставьте слайдов в 1X PBS до следующего шага.
2. Отварить секции в поисковых раствор антигена.
   1. В 2 л лабораторный стакан, готовят кипячением антиген извлечения раствора с использованием 1х цитратном буфере (рН 7,0) при 95 ° C на нагревательном блоке.
   2. После кипения, поместите слайды в металлическую стойку и погрузить в раствор антигена поисковой кипения в течение 20 мин.
   3. Осторожно вынуть стакан из нагревательного блока с горками еще погруженных и дайте раствору медленно нагреться до комнатной температуры в течение примерно 30 мин.
   4. Поместите слайды в 1x PBS до следующего шага.
3. Блок-секции в блокирующем буфере (PBS 1x, 5% козьей сыворотки, 00,3% Тритон Х-100).
   1. Нарисуйте гидрофобный круг вокруг краев каждой секции с PAP ручкой.
   2. Поместите слайды в лоток влажности с использованием дистиллированной воды в нижней части лотка.
   3. Пипетка 100 мкл Блокирующий буфер на секциях то, чтобы все ткани покрыта жидкостью (может потребоваться более 100 мкл).
   4. Инкубировать срезы с блокирующим буфером в течение 1 часа.
4. Инкубировать срезы с первичным антителом.
   1. Приготовьте одно решение с двумя первичными антителами, чтобы исследовать каждую секцию для CD31 (ПАУ) и актин гладких мышц (перицитов), разведенного в буфере для разведения (1х PBS, 1% BSA, 0,3% Тритон Х-100).
      Примечание: Здесь, анти-CD31 концентрации 1:50 и анти-гладкая концентрация актин составляет 1: 300.
   2. Инкубируйте разделы в течение ночи при 4 ° С со 100 мкл первичных антител в ванночку влажности, содержащего дистиллированную воду.
5. Вымойте слайды три раза в 1x PBST (1x PBS + 0,1% TWEEN20) в течение 5 мин каждый промывной.
6. Инкубировать срезы с вторичным антителом.
   1. Готовят раствор с флуорофором, конъюгированного козьего анти-кроличьего вторичным антителом признать кролика антитела против CD31, разбавленного в буфере для разведения.
      1. ПРИМЕЧАНИЕ: актин гладких мышц первичного антитела уже конъюгированы с Су3 флуорофора, так что не требуется вторичное окрашивание антител. Коза-анти вторичного концентрация антитела кролика составляет 1: 250.
   2. Инкубируйте разделы в течение 1 ч со 100 мкл вторичного антитела в лотке влажности, содержащего дистиллированную воду.
7. Вымойте слайды три раза в 1x PBST в течение 5 мин каждый стирки.
8. Установите слайды.
   1. Пипетировать 2 - 3 капли (~ 40 - 60 мкл) antifade монтажного раствора с DAPI ядерного окрашивания на каждом участке.
   2. Аккуратно откуда нет. 1.5 Крышка скользит по секциям и монтажного раствора, что позволяет жидкости разложить по секциям и к краямкрышка скольжения. Осторожно использовать палец, чтобы выдавить пузырьки воздуха, которые могут быть расположены по сечению.
   3. Пусть слайды высохнуть в течение по меньшей мере 1 ч перед обработкой.

10. Количественная капиллярного Плотность и структура ¹⁴

1. Подсчитайте количество капилляров в H & E окрашенных срезов, выраженное в виде # / мм ^2.
   1. Приобретать фотографии четырех различных полей на вертикальном световым микроскопом при 40-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капилляры выявляются в виде трубок, заполненных эритроцитами.
   2. В качестве альтернативы, вместо того , чтобы вручную подсчета капилляров, используют программное обеспечение для анализа изображений (например, Wimasis путем анализа изображения) для количественного определения различных параметров ангиогенеза , такие как номер судна, средней длины судна и диаметра, а также точки ветвления.
2. Анализ структуры капилляров в иммунофлуоресцентных окрашенных участках.
   1. Приобретать фотографии четырех различных полей на перевернутой флуоресцентного микроскопас FITC и TxRed фильтра куб.
      1. Используйте куб FITC для изображения КЭ при возбуждении при 488 нм и использовать куб TxRed для перицитами изображения путем возбуждения при 594 нм.

Результаты

Представитель H & E и иммунофлуоресцентного окрашивание срезов матрицы геля зажигания показаны на рисунке 2. Разделы от ЕК только штекеры отображения некоторых судов, которые в большинстве случаев не озарен крови (рис 2 в левом верхнем углу черные стрелки) , тогда как вилок , содержащих как КЭ и перицитов отображения нескольких орошаемый сосуды с увеличенным диаметром и полного охвата перицитов, о чем свидетельствует положительной SMA окрашивания, не...

Обсуждение

Анализ гель плагин матрица оказалась удобной и мощный метод для оценки регуляции генов в ангиогенезе, ангиогенеза и антиангиогенных соединений в естественных условиях, и дополнить тесты в лабораторных условиях . Здесь мы опишем подробно новый матричный гель плагин анализа человеческого ангиогенеза, исследующая взаимодействие между эндотелиальных клеток и перицитов при формировании сосуда.

Есть несколько новые и важные шаги в этом протоколе. Клетки низкого прохода (проход 1 ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PBS (фосфатно-солевой буфер)	Corning	21-031-CV
0,25% трипсина/0,53 мМ ЭДТА	Набор	25-053-CI
	Sciencell	1001	включает в себя среду, добавку для роста EC и пенициллин/стрептомицин, каждый из которых поставляется в необходимом объеме для легкого смешивания
перицитарных сред (PM) Набор	Sciencell	1201	включает в себя среду, добавку для роста перицитов и пенициллин/стрептомицин, каждый из которых поставляется в соответствующем объеме для легкого смешивания
первичных микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека	.		Клетки, используемые при прохождении 1-4
первичных легочных перицитов человека		прорыва легочной гипертензии	этот тип клеток не доступен в продаже, но парициты мозга есть. Используемые клетки при прохождении 1-4
bFGF (основной фактор роста фибробластов)	Peprotech	100-18B	стоковый раствор составляет 50 мкм; г/мл в 0,1% БСА в PBS, аликвоты при 50 мкм; l и хранить при -20 градусах
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 г 1 мл Insluin Syringe	BD	329410
SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит) мыши	Лаборатория Джексона	5557	NOD. Лучшим штаммом является гамма-нокаутный штамм SCID IL2R; 4-6 недель в возрасте
1,5 мл микроцентрифужные пробирки, стерильные	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 мл пробирки с завинчивающейся крышкой, стерильные	BD Biosciences	352096
PAP ручка	Life Technologies	8899
гемоцитометр	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair крем для эпиляции	Walmart
рабочее антитело против человеческого CD31	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	рабочий раствор 1:50
против человеческого актина гладкой мускулатуры CY3 первичное флуоресцентное антитело	Sigma	C6198	рабочий раствор 1:300
козье вторичное антитело; 488/зеленый	ThermoFisher Scientific	A-11008	1:250
Prolong Gold DAPI раствор	Cell Сигнальные	8961S
	VWR	48300-047
No 1,5 защитные стекла	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
цитратный буфер 10x	Millipore	21545
экстратонкие хирургические ножницы	Fine Science Tools	14084-08
Формалин (параформальдегид)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Салфетки	Simport	M492-12
сыворотка для коз	Dako	X0907