Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

13 сентября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.

Аннотация

Создана недорогая, простая в использовании и мощная модельная система для оценки потенциальных методов лечения, которые могут улучшить нарушение гематического барьера сетчатки. Доказано, что воспалительный фактор, гистамин, нарушает целостность сосудов в культивируемой сетчатке из-за положительного окрашивания IgG за пределами кровеносных сосудов. Эффекты самого гистамина и препаратов-кандидатов для потенциального лечения, таких как липоксин А4, оцениваются по трем параметрам: утечка кровеносных сосудов через иммуноокрашивание IgG, активация клеток Мюллера через окрашивание GFAP и изменение нейрональных дендритов через окрашивание на MAP2. Кроме того, слоистая организация сетчатки позволяет детально анализировать процессы Мюллера и ганглиозных клеток, такие как изменения ширины и непрерывности. Несмотря на то, что представленные данные относятся к культуре сетчатки свиней, система применима к нескольким видам. Таким образом, модель является надежным инструментом для исследования ранних эффектов нарушения целостности сосудов сетчатки на различные типы клеток, а также для оценки потенциальных кандидатов в лекарства для лечения.

Введение

Все больше доказательств поддерживает существование барьера сетчатки крови (BRB) 1-5 и его сходство с гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) 6,7. Компромисс ГЭБ была тесно связана причинной или в качестве диагностического маркера хронических нейродегенеративных заболеваний , таких как болезнь Альцгеймера (AD) 8,9 и острых состояний , таких как делирий 10. Механистические способность проникновения в суть этих патологий и открытий для потенциальных мишеней для лекарственных средств, как правило, затруднено из-за ограниченной доступности и сети запутанности мозга. Такие альтернативы, как визуализации в естественных условиях 11 мозга органотипического культуры 12 первичных культур клеток 13,14 и систем совместного культивирования 15 были сформированы. Тем не менее, большинство из этих моделей требуют специальных инструментов, длинные экспериментальные периоды или несколько маркеров для идентификации клеток. Функциональные и структурные сходства между ГЭБ и BRB, а также корреляция между Dysfunctions из двух уже утверждалось , 16-19. Кроме того, более легкий доступ, хорошо определенные типы клеток и слоистая структура позволили хорошо охарактеризованный сетчатку как окно в мозг. Структурные и функциональные тождества ВВВ и BRB остаются для сравнения в деталях. Тем не менее, патологиями сетчатки глаза, особенно нарушение BRB, также были тесно связаны с прогрессированием различных заболеваний, включая диабет и 21,22 18-19 AD. Таким образом, представляет интерес для создания системы дисфункции BRB не только очертить механизм, но и на экран потенциальных лекарств. В этом докладе, протокол позволяет BRB дисфункции, используя простой острый сетчатке культуры разработан и представлен.

Повышение проницаемости ГЭБ и AD-как патологические изменения были установлены в мозг органотипического культуры инкубировали с гистамином, провоспалительного медиатора 12. Таким образом, в представленной системы, гистамин Applс использованием СВУ культуры сетчатки экс естественных условиях , чтобы побудить BRB дисфункции. Сетчатка из нескольких видов, таких как Mus Musculus и Bos Taurus, были протестированы. Из-за их коммерческой доступности и сходством с человеческой ткани, свежие свиньи глазные яблоки использовались для предоставления данных, представленных здесь. После инкубации с гистамином и / или другими наркотиками, сетчатка были обработаны для оценки иммунным окрашиванием в течение нескольких белков 12, таких как иммуноглобулин G (IgG), один из основных компонентов крови; глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), хорошо известный маркер для глиальных активации; и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), нейрон-специфический белок цитоскелета необходимы для сборки микротрубочек. Кроме того, слоистая структура сетчатки позволяет проводить детальный анализ процессов клеток Мюллера и ганглиозных клеток, такие как изменения в их ширине и непрерывности. Таким образом, несколько дополнительных параметров можно оценить последствия решенияBRB нарушение на ранней стадии и оценить разворотные эффекты потенциальных методов лечения, а также.

В этом протоколе, потенциальные эффекты реверсирование экранированных препаратов оцениваются с трех точек зрения: утечки кровеносных сосудов (БВС), активации клеток глии и живучесть реакции нервных клеток. Существует несколько методов количественного определения используются, например, уровень экспрессии показал интенсивности иммунным, измерения ширины процесса и непрерывность нейрональных процессов, показанных с помощью фильтр улучшения. Для того, чтобы лучше проиллюстрировать метод и помочь интерпретировать результаты, lipoxin А4 (LXA4), соединение эндогенно синтезированный в ответ на воспалительные повреждения и смягчающие эндотелиальной дисфункции 23, был выбран для демонстрационных целей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы были проведены в соответствии с политикой Institutional Animal Care и использование комитета, где это применимо.

1. Подготовка

  1. Приготовьте стабилизации среды с 75% Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 25% Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS). Хорошо перемешайте, аликвоты и хранят при -20 ° С до использования.
  2. Приготовьте фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР) и стерилизуют автоклавированием. Хранить раствор при комнатной температуре. Нагреть PBS до 37 ° С до эксперимента (5 мл на лунку).
  3. Готовят 10%, 20% и 30% сахарозы в PBS. Фильтр все решения индивидуально более отдельных фильтров 0,22 мкм для стерилизации. Сохраните решения при 4 ° С.
  4. Подготовьте гистамин маточного раствора в PBS до концентрации 90 мМ. Стерилизовать раствор путем фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Аликвоты и сохранить раствор при температуре -80 ° С. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания и-.
  5. Сделать свежий 4% параформальдегида (PFA) в PBS до начала эксперимента. Поместите его на льду.
    Внимание: Хранить PFA в вытяжном шкафу и носить соответствующее защитное оборудование.
  6. Разморозить стабилизации среды (20 мл на сетчатке). Добавить пенициллин-стрептомицина до конечной концентрации 100 ед / мл. Теплое часть среды (15 мл на сетчатке) до 37 ° С в инкубаторе до эксперимента. Оставьте остальные среды на льду.
  7. Поместите HBSS (10 мл на сетчатке) на льду.

2. сетчатке Органотипической Культура

  1. Передача образцов в капюшоне культуры ткани. Откройте окуляр разрезанием вокруг объектива. Используя щетку, аккуратно удалите стекловидное тело, не вытаскивая на сетчатке. Аккуратно отделить сетчатку от обрезной кромки с помощью кисти, чтобы выставить диск зрительного нерва. Тяжелое зрительного нерва с бритвой и отпустить сетчатку.
  2. Передача сетчатки глаза в чашку Петри и тщательно промыть сетчатку один раз с использованием холодного HBSS. Поместите образец в HBSS на Iсе. Проанализируйте, как много сетчатку по мере необходимости, повторите шаг 2.1 и этот шаг.
  3. Обрежьте сетчатку пополам симметрично с бритвой. Аккуратно перенести образцы в 6-луночный планшет с 3 мл стабилизационного сред на лунку. Уравновешивание Разрешить течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
  4. Подготовьте следующие реагенты при инкубации на шаге 2.3: Развести гистамин маточного раствора до желаемой концентрации (450 мкМ) в теплой среде. Растворите LXA4 (хранится под аргоном) в среде до конечной концентрации 250 нг / мл.
    Примечание: При измерении эффекта LXA4, одна половина из одной сетчатки используется для одного только гистамина, в то время как другая половина используется для гистамина с LXA4.
  5. Аспирируйте стабилизации среды тщательно и добавить Готовую среду в каждую лунку (3 мл на лунку). Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с атмосферой , содержащей 5% CO 2.
  6. промойтеОбразцы один раз в теплой, стерильной PBS.

3. Подготовка образцов для Иммуноокрашивание

  1. Отберите PBS с планшетов. Добавить 4% PFA (3 мл на лунку) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  2. Быстро аспирация PFA. Промыть образцы один раз с помощью PBS. Передача образцов до 10% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение от 2 до 4 ч при 4 ° С.
  3. Передача образцов до 30% сахарозы (5 мл на лунку) и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С. Смешайте одну часть коммерческой среды замораживания с двумя частями 20% сахарозы, чтобы сделать рабочую среду замораживания. Оставьте его при температуре 4 ° С в течение ночи или дольше, пока пузырьки воздуха исчезают.
  4. Передача образцов в рабочей среде замораживания и достижения равновесия в течение 5 мин при комнатной температуре. Обрежьте каждый сетчатку на прямоугольники (примерно 3 мм и 5 мм).
  5. Аккуратно перенести образцы в рабочую морозильную сред, содержащихся в цилиндрическом контейнере (около 1 см радиус х 2 см высоты) DevИСЭД из алюминиевой фольги. Убедитесь, что ломтики ретинальные вертикальны (ориентированы, чтобы обеспечить поперечное сечение сетчатки при секционирования) и замораживают их в жидком азоте. Сохранить блоки при -80 ° С до использования.
  6. Раздел каждый блок на криостата на 14 мкм ломтики толщиной и смонтировать разделы на стеклах. Хранить слайды при температуре -80 ° С до использования.

4. Иммунологическое

  1. Промыть участки с 5% фосфатного буфера сахарозы (SPB, 5% сахарозы в PBS, рН 7,4) один раз. Блок неспецифические сайты связывания путем инкубации срезов в блокирующем буфере (5% SPB с 10% нормальной козьей сыворотки и 0,5% Тритон Х-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Инкубируйте секций (на слайдах) с соответствующим первичным антителом (GFAP или MAP2, разбавленного в соотношении 1: 500 в блокирующем буфере) в течение 1 ч. Аспирируйте решение. Промыть три раза в 5% SPB. Для окрашивания эндогенного IgG, пропустите этот шаг.
  3. Инкубируйте разделы с соответствующим SECONритом антитела (Cyanine3 / FITC, конъюгированного с осла против мышиного / анти-IgG кролика, разбавленной в отношении 1: 800 в блокирующем буфере) в течение 1 часа.
  4. Вымойте участки тщательно с 5% SPB три раза. Подготовка образцов для микроскопии путем установки их в монтажной среде, содержащей DAPI и покрытие покровные.
  5. С помощью лазера конфокальной микроскопии, захват изображения через объектив 20Х при одинаковых параметрах , таких как интенсивность лазерного, значение усиления, время выдержки и т.д. во всех группах. Установка длины волн возбуждения / излучения для синего канала (для обнаружения DAPI) в качестве 408/447 нм, для красного канала (для обнаружения Cyanine3) в качестве 561/785 нм и для зеленого канала (для обнаружения FITC) в качестве 488/525 нм ,

Анализ 5. Изображение

  1. Количественно процент вытекающей кровеносных сосудов в соответствии со следующими критериями: 12: Включить только кровеносные сосуды с ядрами эндотелиальных клеток в плоскости сечения в подсчете; рассмотреть дырявое кровеносных сосудов, если он показывает AGRadient иммуноокрашивания окружающих сосуд.
  2. Для определения уровня экспрессии, выберите интерес областей и измерения среднего значения серого с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
  3. Для измерения ширины процесса, выбрать площадь участка, где процессы различны (наружный ядерный слой, ОНЛ, например). Затем выберите оптический поле, где такие процессы являются видимыми и непрерывными. Установите шкалу масштаба в соответствии с микроскопической обстановке, провести линию через процесс и выполнить измерение.
  4. Для того, чтобы проанализировать непрерывность процесса, выберите области интереса, применить фильтр, называемый дисперсией, которое усиливает края в изображении, заменяя каждый пиксель с его окрестности дисперсии, автоматически регулировать яркость и контрастность, подсчет строк и нормализовать количество самая площадь.
  5. Расчет статистических значений с помощью т -TEST в две-Стьюдента. *, P <0,05; **, Р <0,01; ***, P <0,001. псерия результат как среднее ± SEM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы представляем недорогой, эффективный по времени и простой в использовании системы для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы защитить против нарушения BRB, вызванного гистамином. IgG , ограничен в сосудах , в контрольной сетчатки (рис 1А), но утечки из кровеносных сосудов при воздействии гистамина (Рисунок 1В), подтверждая , что модель успешно установлено.

LXA4 был выбран, чт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчете мы представляем мощную ex vivo острую дисфункцию сетчатки BRB с использованием сетчатки свиней. Эта модельная система не требует специальных инструментов и может быть легко адаптирована под большинство лабораторных условий. Однако для получения успешного результата несколько этапов требуют пристального внимания. После получения глазных яблок из источника, их необходимо хранить при температуре 4 °C или на льду и обрабатывать как можно скорее. Когда анализируется эффект лечения, необходимо использова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Bringhurst Meats (Берлин, Нью-Джерси) признан за их искреннюю помощь в предоставлении свиных глазных яблок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДМЕМЛайф Технологии 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
СахарозаJ.T.Baker4072-05
ГистаминSigmaH7125-1G
Пенициллин-стрептомицин Invitrogen
PFAЭлектронная микроскопия науки15710
Замораживающие среды Triangle Biomedical SciencesTFM-5
Сыворотка для нормальной козы RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAPАнтитело MilliporeAB5804
MAP2 АнтителоEMD MilliporeMAB3418
FITC конъюгированное Donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 конъюгированный Ослик против мышей IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
Монтажная среда, содержащая DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
МикроскопNikon
ImageJНациональные институты здравоохранения1,45 с
Лазерный конфокальный микроскоп Eclipse Ti

Ссылки

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

A4IgGGFAPMAP2ex vivo
Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.