Изучение вирусных векторов в Трехмерные модели печени заселен с клеточной линии человеческого гепатоцеллюлярной карциномой HepG2

Большинство современных биомедицинских исследований опираются на один из двух подходов: либо двумерные (2D) эксперименты на клеточных культурах, либо животные модели, которые являются трехмерными (3D) по самой своей природе. Однако у этих подходов есть и серьезные недостатки. Было показано, что клетки, выращенные в 2D-культуре, отличаются по паттернам экспрессии генов и физиологии клеток от клеток, культивируемых в 3D-условиях. ¹ Животные модели, помимо того, что они связаны с этическими проблемами, часто плохо моделируют человеческую физиологию. Несмотря на то, что отсутствие явных токсических эффектов соединения должно быть подтверждено на животных моделях до первого введения его в организм человека, были задокументированы многочисленные случаи, в которых в клинических испытаниях происходили серьезные, иногда смертельные, побочные эффекты. ²

Чтобы преодолеть эти недостатки, гуманизированные 3D-модели органов ex vivo стали важными исследовательскими инструментами. При культивировании в подходящих условиях клетки самоорганизуются в 3D-структуры, известные как сфероиды. Однако у этих сфероидов отсутствует сосудистая система, что ограничивает распространение как мелкомолекулярных соединений, так и крупных биологических препаратов и вирусных векторов. Например, аденовирусные векторы трансдуцировали только внешние клеточные слои сфероидов, полученных из глиобластом человека. ³ Решением этой проблемы является использование модели органа, содержащей сосудистую систему. С этой целью представляющий интерес орган может быть пересажен из животного, а клетки животного могут быть заменены клетками человека. Описаны различные методы децеллюляризации печени животных путем обработки детергентами или холатом натрия. ^4-6 Образовавшийся внеклеточный матрикс (ВКМ) содержит цитокины и факторы роста, которые регулируют различные клеточные процессы. ⁷ Его можно использовать в качестве каркаса для рецеллюляризации с клетками человека с целью получения функциональной модели органа.

В недавнем исследовании мы использовали гуманизированную 3D-модель печени для изучения распределения и экспрессии трансгенов аденоассоциированного вирусного вектора (AAV). ⁸ Векторы AAV относятся к наиболее перспективным вирусным векторам для применения в генотерапии. ⁹ Первое и на сегодняшний день единственное одобренное в западном мире генотерапевтическое вмешательство использует вектор AAV для переноса липопротеинлипазы. ¹⁰

Примечание: RL получено этическое разрешение на УВК органов от Landesamt für Gesundheit унд Soziales (LaGeSo). Печени эксплантировали от крыс Wister. Нижней полой вены и воротной вены печени были канюлю с канюлей 22 G. Методы decellularization эксплантированной печени были описаны ранее. ^4,5 внеклеточном матрицы , используемые здесь , были получены при чрезмерной перфузии печени крыс с 1% дезоксихолате натрия.

1. Recellularization внеклеточного матрикса (ECM) крысы Печень

1. Расширение печени клеточной линии HepG2
   1. Культура гепатоцеллюлярной карциномой линия клеток HepG2 в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 2 мМ пенициллина и стрептомицина, каждый.
   2. Семенной 1,5 х 10 ⁷ клеток в Т175 бутылки и растут клетки при 37 ° С и 5% CO ₂ 2.
   3. Спин вниз клетки при 300 мкг и ресуспендирования их в 4 мл PBS и подсчета клеток с камерой Нойбауэра под микроскопом. Одна бутылка T175 получается примерно 4,5 х 10 ⁷ клеток.
      Примечание: Убедитесь , что культура содержит достаточное количество клеток для recellularization ЕСМ печени крыс с 6 × 10 ⁸ HepG2 клеток на ECM (10 х 175 см ² колбы для культивирования с 4-5 × 10 ⁸ клеток каждая).

Рисунок 1. Система биореактора. A) Эта система была биореактор на заказ. Он поддерживает модели органа при температуре 37 ° С и 5% CO _2. Скорости потока перистальтических насосов может регулироваться индивидуально. Б) Печень помещают в ростовую камеру и подключитье изд к схеме перфузионного, которая состоит из перистальтического насоса, средний резервуар, пузырьковой ловушки и датчик давления. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Recellularization ЕСМ
   1. Настройте систему биореактора, содержащую перфузионного камеру печени, систему перфузии, резервуар среды и пузырь ловушку. Стерилизацию систему биореактора (121 ° C, 15 мин).
   2. Подключите систему биореактора с использованием перистальтического насоса и поместить его в инкубатор обеспечения соответствующих условий (37 ° C, 5% CO _2). Поместите decellularized крысу каркасах печени ⁸ в перфузионной печени камеры системы биореактора (рисунок 1).
   3. Соедините каннюлирован воротной вены и полую вену с помощью трубки клипов в перфузионной системы. Равновесие леску с 150 мл среды RPMI (как описано в разделе 1.1)в течение 5 дней со скоростью потока 1,25 мл / мин.
   4. Отсоедините леску печени от схемы медиа и инокуляции леску с 3 × 10 ⁸ клеток HepG2 (в 5 мл) через воротную вену с помощью 5 мл шприца, во избежание образования пузырьков воздуха и позволяют клеткам заселить ECM инкубировании их в течение 1 час в эшафот с при выключенном насосе.
   5. Постепенно увеличивают скорость потока путем регулировки насоса, начиная с 1,25 мл / мин в течение 10 мин; 2,5 мл / мин в течение 20 мин и, наконец, 3,75 мл / мин в течение 30 мин.
   6. Повторите шаги 1.2.4-1.2.5 для достижения общего количества клеток 6 × 10 ^8.
   7. Запуск системы биореактора со скоростью потока 3,75 мл / мин. Культура recellularized печени крыс в течение 2 недель.
      Примечание: Заменить одну треть среды со свежей средой (50 мл) через день. Образец культуральной среды для измерения физиологических параметров, таких как активность лактатдегидрогеназы, рН среды образцов и концентрации глюкозы и лактата.

2. трансдукции Recellularized печени крысы

1. Крупномасштабная Производство AAV векторов
   1. Продукты, которые очищают, и количественно векторы AAV , как описано выше: ¹¹
      1. Если коротко, то производят векторы AAV в бутылей и очищают их от иодиксанол градиентного центрифугирования. Удалите остатки иодиксанол фильтрацией через PD10 гелевые фильтрационные колонки. Определить концентрацию ААВ вектора кПЦР с использованием геномной ДНК AAV в качестве стандарта.
         Примечание: самокомплементарными, pseudotyped AAV2 / 6 вектор , используемый в настоящем исследовании , закодированные EmGFP в качестве репортера , чтобы продемонстрировать эффективность трансдукции и кассету экспрессии shRNA для нокдауна эндогенно выраженного гена (человеческого циклофилин B (hCycB), рис 2) , Обеспечить достаточное количество pseudotyped scAAV векторов серотипа 6 (2,7 × 10 ¹³ AAV векторов в модели печени).

Рисунок 2. Карта самодополнительных, pseudotyped AAV2 / 6 вектор , используемый в настоящем исследовании. Геном состоит из инвертированных концевых повторов (ITR) из AAV2 и кодирует EmGFP под контролем промотора CMV , а также в качестве shRNA под контролем из U6 промотора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Трансдукция печени Модель
   1. Отрегулировать ААВ вектор раствора до конечной концентрации 2,7 х 10 ¹³ векторных геномов в 5 мл путем добавления соответствующего объема PBS.
   2. Отсоедините печень от цепи медиа путем удаления трубки из канюли. Подключение 5 мл шприц с канюлей воротной вены и вводят полный ААВ вектор раствор (5 мл).
      Примечание: OptionallY, добавляют фенол красный (5 мкг / мл), чтобы следовать за распределение ААВ вектора решения по всей печени.
   3. Инкубировать в течение 1 часа без прокачки. Постепенно увеличивают скорость потока, начиная с 1,25 мл / мин в течение 10 мин; 2,5 мл / мин в течение 20 мин и 3,75 мл / мин в течение 30 мин. Культура recellularized печени крыс в течение 6 дней.
      Примечание: Заменить одну треть среды, как указано в примечании под 1.2.7

3. Оценка печени Recellularized трансдуцированных Rat

1. Гематоксилином и эозином окрашивания (HE) и анализ Иммуногистохимическое
   1. Возьмите образцы (0,5 х 0,5 х 1,5-2 см) от каждой доли печени с помощью скальпеля.
   2. Инкубируйте образцы (от 3.1.1) в 4% параформальдегида (PFA) + 4% раствора сахарозы в течение 1,5 ч при температуре 4 ° С. (Внимание: PFA является токсичным и канцерогенным Всегда держите PFA в вытяжном шкафу и носить соответствующую защитную одежду.) . Wash три раза PBS (1 мин на стадии промывки) и инкубировать в 8%в течение ночи сахарозы при температуре 4 ° С.
   3. Налейте фиксируя среду в пластиковые cryomolds, поместите образцы в фиксируя среде без пузырьков воздуха. Добавить фиксирующую среду до тех пор, пока образец хорошо освещена. Хранить встроенные образцы при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.
   4. Подготовка крио-секций (10 мкм) с замораживающий микротом ^12. Оценка recellularization гематоксилином + эозином ^8. Оценка эффективности трансдукции путем иммуногистохимического окрашивания для гена представляющей интерес (здесь: EmGFP).
2. Молекулярно-биологические выборки
   1. Образец каждой доли печени с трепанобиопсия (4 мм в диаметре). Изолировать тотальной РНК, ДНК и белки в соответствии с инструкциями изготовителя для оценки трансгенной экспрессии EmGFP и hCycB сбить ^8.

Для оценки степени recellularization, криопроводники срезы готовили из каждой доли каждой recellularized модели печени. Затем срезы анализировали с помощью гематоксилином и эозином. Как видно на рисунке 3, каждая лопасть из трех моделей с печенью, обозначается как TLM1, TLM2 (трансдуцированная модели печени 1 + 2) и Ctrl (модель печени управления , которая была recellularized, но не трансдуцированных), были заселены с клетками HepG2. Эта печеночно-клеточная карцинома линия была создана из опухолевой ткани 15-летнего аргентинского мальчика. Некоторые области модели печени были более интенсивно recellularized, чем другие. Причины этих вариаций, еще предстоит определить.

Рисунок 3. гематоксилином и эозином пятно каждой доли трех анализировались модели печени TLM1 + 2:. Трансдуцированная печениМодели 1 и 2; Ctrl .: модель управления печени, которая была recellularized, но не трансдуцированная. Шкала бар: 200 мкм. (Перепечатана с разрешения из работы. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

На следующем этапе, оценивали трансдукции моделей печени. С этой целью ДНК получали из 28 пробивных биопсий каждой из моделей печени и вектор титр определяли количественно кПЦР. В среднем, 55 и 90 интернализированные векторных геномов на клетку (VG / клетки) были измерены для двух преобразованных моделей печени. Эксперименты в клеточной культуре 2D показали 30 VG / клетка достаточно для сильной экспрессии трансгенов и RNAi опосредованного глушителей. Производство EmGFP анализировали с помощью ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга. На самом деле, выражение репортер был обнаружен у 80-90% биопсий на уровни мРНК и белка, соответственно.8 Для того, чтобы получить полное представление об эффективности трансдукции, крио-срезы immunohistologically проанализированы. Как видно на фиг.4, области модели печени , которые были успешно recellularized, как и визуализировали с помощью DAPI окрашивания, также дали сильные флуоресцентные сигналы в иммуногистохимического анализа экспрессии EmGFP. Как и ожидалось, модель печени контроль, не обработанный AAV векторов, не показывают никакого выражения EmGFP.

Рисунок 4. Иммуногистохимическое анализ экспрессии EmGFP Клетки , которые заселяются модели печени визуализировали с помощью окрашивания DAPI (синий цвет). Выражение EmGFP визуализировали с помощью иммунохимического окрашивания (красный). TLM1 + 2: трансдуцированных модели печени 1 и 2; Ctrl .: модель управления печени, которая была recellularized, но не трансдуцированная. Шкала бар: 200 мкм. (Перепечатана с разрешенияиз работы. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

В качестве последнего теста, ААВ-опосредованной нокдаун hCycB анализировали с помощью QRT-PCR. Было обнаружено , что нокдаун hCycB составляет от 70 до 90%, в среднем по всем мочки двух преобразованных моделей печени (рисунок 5).

Рисунок 5. RNAi-обусловленный нокдаун hCycB в моделях AAV-трансдуцированных 3D печени. Сайленсинг hCycB определяли с помощью QRT-PCR. Средние значения и стандартные отклонения (SD) были рассчитаны для всех образцов каждой модели трансдуцированную 3D печени (TLM1 и 2, соответственно) и нормированы к среднему значению, не трансдуцированных контроля (Ctrl.). (Перепечатана с разрешения Rэф. 8.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.