Мы описываем флуоресцентный анализ для измерения фосфолипидного сккремблирования в больших униламеллярных липосомах, восстановленных с помощью опсина.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис - -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} - зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.
Введение
Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке 1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено 2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом 4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликози....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение липосом, и протеолипосомах
- липосом Формирование
- С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1.
- Сухие липиды в течение 30 мин с помощью роторного испарителя при скорости вращения 145 оборотов в минуту (без воды ванны не требуется для этого объема растворителя), а затем перенести колбу на вакуумном эксикаторе в течение по меньшей мере 3 ч или в течение ночи при комнатной температуре (RT).
- Увлажняют высушенную липидную пленку с 10 мл 50 мМ HEPES ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерного состояния, в котором опсина функционально реконструируют в везикулы.
Для определения оптимальных условий восстановление, необходимо определить эмпирически количес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью 2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких как НБД-фосфатидилэтаноламина, меченные NBD на ацильной цепи , как показано на НБД-ПК на рисунке 1А, или на головная группа, НБД-сфингомиелина или NBD- фосфатидилсерин 2), эффект везикулы липид.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) и проектом J3686 (B.P.) Австрийского научного фонда (FWF).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерин) (соль натрия) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-пальмитоил-2-{6-[7-nitro-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]гексаноил}-sn-глицеро-3-фосфохолин | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| додецил-&бета;-D-мальтозид | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Флуориметр кюветы | сигма | C0918-100EA | кюветы |
| Спектрофлуориметр | Photon Technology International, Inc. | флуориметр | |
| гидросульфит натрия технический сорт, 85% | Sigma | 157953-5G | дитионит |
| GraphPad Prism 5 программное обеспечение | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 мл экструдер | Компания «Нортерн Липидс, Инк.» | Экструдер | |
| Ватман, Дренажный диск, ПЭ, 25 мм | Сигма | 28156-243 | Дисковая поддержка |
| Ватман Nuclepore Track-Etched Мембраны, 0,4 и микро; m, диаметр 25 мм | Sigma | WHA110607 | 400 нм мембрана |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 & микро; m, диаметр 25 мм | Sigma | WHA110606 | 200 нм мембранный |
| фосфат | натрия Sigma | S3264-500G | |
| VWR Пробирки для культивирования, одноразовые, боросиликатное стекло, 13 x 100 мм | VWR Scientific | 47729-572 | стеклянные пробирки |
| Хлорная кислота | Sigma | 30755-500ML | |
| Молибдат аммония Тетрагидрат | Sigma | A-7302 | молибдат аммония |
| (+)-L-аскорбат натрия | Sigma | A7631-25G | аскорбат натрия |
| Био-гранулы SM2 адсорбенты | Bio Rad | 1523920 | гранулы полистирола |
| 2,0 мл Микропробирки прозрачные | VWR Scientific | 10011-742 | Пробирки для восстановления |
| стеклянной пробирки | VWR Scientific | 53283-800 | Пробирки для восстановления стеклянных пробирок |
| Zetasizer | Малверн | СДО |
Ссылки
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
