Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54635

⸱

20 сентября 2016 г.

 , 
1Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем флуоресцентный анализ для измерения фосфолипидного сккремблирования в больших униламеллярных липосомах, восстановленных с помощью опсина.

Аннотация

Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис - -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} - зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.

Введение

Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке 1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено 2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом 4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликозилирования 5. Регулируемый фосфолипид скремблирование необходимо подвергать фосфатидилсерина (PS) на поверхности апоптотических клеток , где он действует как "съесть-меня" -сигнала для макрофагов 7 и обеспечивает поверхность прокоагулянтную на активированных тромбоцитах , чтобы катализировать образование фактора белкаы необходимы для свертывания крови. В фоторецепторов дисковых мембран, карабкаясь активность родопсина была предложено , чтобы противодействовать фосфолипидов дисбаланс между двумя мембранами листков бислоя , который генерируется АТФ-зависимый, однонаправленного липида флиппазы abca4 4,8,9 10-12.

Несмотря на Физиологическое значение scramblases, их идентичность остаются неясными до родопсина не сообщалось как scramblase в фоторецепторных дисков 2, были идентифицированы членами семейства белков TMEM16 , как Са 2+ -зависимые scramblases , необходимые для облучения PS в плазматической мембране (обзор в ссылке 13), и бактериальный белок FtsW был предложен как липид II scramblase требуется для синтеза пептидогликана 14. Эти открытия были основаны на восстановлении очищенных белков в липосомы и демонстрации scramblase активности в результате протеолипосом с использованием методологии describред здесь. Другие потенциальные scramblases 15-21 - эти белки MurJ и Amj замешанные в пептидогликана биосинтеза, WzxE и родственные белки участвуют в скремблирования O-антиген предшественников, ФЗПНМ белков необходимо для транслоцироваться аминоацилирована фосфатидилглицерин через цитоплазматическую мембрану бактериальной, и члены семьи Xkr8 , которые были предложены выставить PS на поверхности апоптотических клеток - остаются для тестирования биохимически. Это подчеркивает важность надежного анализа, чтобы определить и охарактеризовать scramblase активность.

Здесь мы описываем воссоздание очищенного опсином, апопротеина фоторецептора родопсина, в большие однослойные везикулы (БУВ), и последующий анализ scramblase активности в результате протеолипосом с использованием флуоресцентного анализа на основе. Есть несколько хорошо описанных протоколов, доступных в литературе для гетерологичной экспрессии и очистки опсином, поэтому мы не будемописать его в этом протоколе; мы используем протоколов , описанных в Горен и др. 3 , который дает ФЛАГ-меченый, термостабильный опсина при температуре около 100 нг / мкл в 0,1% (вес / объем) dodecylmaltoside (ДДМ).

Разбавление достигается путем обработки БУВ с достаточным моющим средством таким образом, что они набухают, но не растворяются. В этих условиях, мембранный белок - поставляется в виде белково-детергентных мицелл - интегрирует в липосомы и стать восстанавливали в липосомальной мембраны при удалении моющего средства, в результате чего протеолипосомах. Для того, чтобы восстановить опсином (полученный в виде очищенного белка в 0,1% (вес / об) DDM), БУВ получают из смеси РОРС (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин) и POPG (1- пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3- [фосфо-рац- (1-глицерин)]) и насыщали DDM перед добавлением опсином и NBD-PC. Моющее средство удаляют путем обработки образца с полистирольных шариков.

деваха = "jove_content"> Принцип , лежащий в основе флуоресцентного анализа на основе показана на рисунке 1В. БУВ симметрично разведен с помощью микроскопического количества NBD-PC или другого НБД-меченого флуоресцентной фосфолипидного репортера (Рис . 1А) При добавлении дитионита, мембраносвязанным impermeant дианион, молекулы НБД-ПК в наружном листке БУВ оказываются нефлуоресцирующего как нитро-группой NBD сводится к нефлуоресцентном амино-группы. Поскольку ни молекулы НБД-PC, ни дитионит способны проходить через мембрану, на временной шкале эксперимента (<10 мин), это приводит к уменьшению на 50 флуоресцентного сигнала%. Тем не менее, если липосомы разведен с помощью scramblase, молекулы НБД-ПК во внутреннем листке может быстро вскарабкаться к внешней стороне, где они уменьшаются. Это приводит к полной потере флуоресценции в идеальном случае (рис 1C).

эс / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Схематическое изображение анализа scramblase активности Анализ используется люминесцентная NBD-меченых репортер липида; НБД-ПК показан (А). Большие однослойные везикулы восстанавливали микроскопического количества NBD-PC. Разбавление производит симметричные везикул, с НБД-PC распределенной равномерно во внешних и внутренних листков. Дитионит (S 2 O 4 2-) химически уменьшает нитро-группу NBD к нефлуоресцентном амино-группы. Лечение безбелковых липосом с дитионита (B, вверху) приводит к снижению на 50% от флуоресценции , так как только молекулы НБД-ПК в наружной листовке снижаются: дитионит отрицательно заряженными и не могут пересекать мембрану , чтобы вступать в реакцию с молекулами НБД-PC во внутреннем листке. Дитионит лечение Opsin содержащих протеолипосом (B, внизу), т.е. scramblase-активных протеолипосомы, приводит к 100% потере еluorescence, как опсином облегчает перемещение НБД-PC между внутренним и наружным листком. (С) показывает идеализированные флуоресценции следы , полученные на лечении небелковых липосом и Opsin содержащих Протеолипосомы с дитионита. Скорость потери флуоресцентной одинакова в обоих случаях, указывающих, что химическое восстановление NBD дитионитом является ограничивающим скорость, и что скремблирования происходит со скоростью, равной или большей, чем скорость химической реакции. Следы , полученные от фактического эксперимента показаны на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Методы , описанные нами могут быть использованы для восстановления и пробирного другие очищенные белки, а также их смеси мембранных белков , полученных, например, путем экстракции микросом с помощью моющих средств 22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение липосом, и протеолипосомах

  1. липосом Формирование
    1. С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1.
    2. Сухие липиды в течение 30 мин с помощью роторного испарителя при скорости вращения 145 оборотов в минуту (без воды ванны не требуется для этого объема растворителя), а затем перенести колбу на вакуумном эксикаторе в течение по меньшей мере 3 ч или в течение ночи при комнатной температуре (RT).
    3. Увлажняют высушенную липидную пленку с 10 мл 50 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl (далее упоминаемый в качестве буфера А) путем осторожно взбалтывая колбу до получения однородной, мутная результаты подвески;
      Примечание: Концентрация липида на данном этапе, как ожидается, будет 5,25 мМ, как без потерь не должно иметь место до сих пор.
    4. Разрушать ультразвуком суспензию в водяной бане в течение 10 мин при комнатной температуре с частотой OF 40 кГц. Решение будет выглядеть несколько яснее.
    5. С помощью экструдера, Суспензию пропускали 10 раз через мембрану с размером пор 400 в нм, за которым следует второй цикл экструзии с 4 проходит через мембрану с размером пор 200 нм.
      Примечание: Средний диаметр полученных БУВ составляет ~ 175 нм. При необходимости, размер и однородность БУВ можно проверить с помощью динамического рассеяния света в соответствии с инструкциями изготовителя.
    6. Количественная фосфолипидов концентрацию LUV суспензии, как описано в разделе 1.2).
      Примечание: Из-за потерь во время экструзии, концентрация, как правило, около 3,6 мМ.
    7. Хранить БУВ при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель, если не использовать сразу.
  2. фосфолипидов Количественное
    Примечание: Для определения фосфолипидной концентрации LUV суспензии, используемой для восстановления, а также, что из протеолипосомах, которые в конечном счете сгенерированных аликвоту образца Тематические ссылкиИДКТК окисления хлорной кислотой. Эта процедура разрушает фосфолипиды выпустить неорганического фосфата , который затем определяют количественно с помощью колориметрического анализа по сравнению со стандартами 23.
    1. Готовят 40 мМ исходного раствора фосфата натрия (Na 2 HPO 4) в деионизованной дистиллированной воде.
    2. Развести маточного раствора деионизированной дистиллированной водой, чтобы получить 4 мМ и 0,4 мМ рабочие растворы, которые будут служить в качестве калибровочных стандартов.
    3. Использование рабочих растворов следует подготовить стандарты в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки в диапазоне от 0 до 80 нмоль фосфата натрия в конечном объеме 50 мкл.
    4. Взять по 10 мкл каждого из LUV и proteoliposome проб должны быть определены количественно и разбавляют 40 мкл DDH 2 O в 13 х 100 мм 2 стеклянные трубки.
      Примечание: По мере того как концентрация липидов в БУВ и протеолипосомах находится в диапазоне 2,5-5 мкм, 10 мкл образца должен содержать 25-50 нмоль липидного фосфора.
    5. Добавьте 300 мкл хлорной кислоты к каждому из стандартов и образцов и высокой температуре в течение 1 ч при 145 ° С в нагревательном блоке. Поместите шарики на трубы, чтобы предотвратить испарение.
    6. Пусть трубы охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1 мл DDH 2 O.
    7. Добавьте 400 мкл каждого из свежеприготовленного 12 г / л молибдата аммония и 50 г / л аскорбата натрия и вихревые перемешать.
    8. Тепло в течение 10 мин при 100 ° C с шариками в верхней части пробирки. Удалить труб из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
    9. Измеряют поглощение образцов против заготовки (стандартного образца, содержащего 0 нмоль фосфата натрия) с помощью спектрометра при длине волны 797 нм.
    10. Определить содержание фосфатов образцов по отношению к стандартной кривой калибровки.
  3. Воссоздание Opsin
    Примечание: Необходимо, чтобы определить оптимальные условия припухлость восстановления, поскольку они зависят от природы моющего средства, а такжев качестве липидной композиции и концентрации БУВ. Как БУВ изменяют свои свойства рассеяния света на отечность процесс можно контролировать путем измерения оптической плотности (рисунок 2), рассмотренный Риго и Леви 24 и Geertsma и др. 25.
    1. Пипетка 800 мкл БУВ (из раздела 1.1; а восстановление липидного после экструзии составляет 70%, ожидаемая концентрация БУВ составляет 3,6 мМ фосфолипидов) в пробирке 2 мл.
    2. Добавить 5,3 мкл буфера А и 34,7 мкл 10% (вес / объем) ДДМ, растворенного в буфере А.
    3. Выдержите в течение 3 ч при комнатной температуре с конечным над уровнем конца перемешивания.
    4. В то же время подготовить полистирольные шарики:
      1. Используйте 400 мг шариков на образец и взвесить их в стеклянном стакане.
      2. Промыть их дважды с метанолом, три раза водой и один раз буфером A. Для каждого шага использования промывной 5 мл жидкости и медленно перемешивать в течение 10 мин.
        Примечание: Рекомендуется подготовить полистиролшарики для нескольких образцов одновременно, например, весят в 6 г гранул и промывают 75 мл жидкости. Избыточные шарики можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
    5. В течение последних 30 мин везикул дестабилизацию просушить НБД-меченного фосфолипида в шнековом-колпачок стеклянной трубки ( 'восстановление стеклянная трубка'): на одну пробу, 9,5 мкл НБД-PC (1 мг / мл в хлороформе, получа 0,4 моль% от общего количества фосфолипидов) сушат под струей азота в стеклянной трубке, а затем растворяли в 45 мкл 0,1% (вес / об) DDM в буфере А.
    6. После 3 ч везикул дестабилизацию добавить растворенный-НБД-меченного фосфолипида РГМ-растворимый белок и буфер А так, чтобы конечный объем 1 мл содержит 0,36% (вес / объем), то есть, 7 мМ, ДДМ.
      1. Таким образом, чтобы генерировать небелковых липосом (используемые в качестве контрольного образца) добавляют 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 60 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А; для протеолипосом добавить, для экзаменаPLE, 40 мкл белка (от типичного исходного раствора ~ 110 нг / мкл) в 0,1% DDM, 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 20 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А ,
        Примечание: Порядок добавления должны быть в списке.
    7. Перемешивают образец еще в течение конца ч в течение конца при комнатной температуре.
    8. Добавляют 80 мг приготовленных гранул полистирола и инкубирование образца с конечным над уровнем конца перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Затем добавить еще 160 мг гранул полистирола и инкубировать с концом поверх конца перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
    10. Переносят образец (оставляя затраченные полистирольные шарики позади) к стеклянному с завинчивающейся крышкой пробирку, содержащую 160 мг свежего гранул полистирола и перемешать в течение ночи при температуре 4 ° С.
      Примечание: Самый простой способ переноса образца и избежать поглощая бусинок использовать пипетку Пастера, который нажимается на нижней части стеклянной трубки с небольшим положительным давлением. После того, как кончик пипетки твердо нанижней части трубы, затем образец может быть легко снята без помех со стороны бортов.
    11. На следующее утро, перенести образец в пробирке без переноса бусы и место на льду в рамках подготовки к пробе scramblase активности.

2. Scramblase Анализ активности

Примечание: Интенсивность флуоресценции липосом или протеолипосомах разбавлены буфером А контролируется с течением времени при добавлении дитионита в флуоресцентном спектрометре. Для получения стабильной начальную интенсивность флуоресценции регистрируется в течение по крайней мере 50 секунд (или до тех пор, стабильный сигнал не будет достигнуто) перед добавлением дитионита к образцу непрерывно перемешивают и затем следует по крайней мере, 500 сек после добавления дитионит.

  1. Добавьте 1950 мкл буфера А на пластиковую кювету, содержащую мини-бар перемешайте.
  2. Добавляют 50 мкл приготовленной Proteo (липосом), и пусть образец уравновешиваться в флуоресцентном спектрометр при постоянном перемешивании в течение нескольких секунд.
  3. В то же время приготовить раствор 1 М дитионита в 0,5 М небуферизованном Трис (например, для двух образцов отвешивают 20 мг дитионита в пробирке и растворяют в 114 мкл охлажденного на льду 0,5 М Трис непосредственно перед использованием и хранить на льду в течение следующего образец).
    Примечание: дитионит раствор должен быть подготовлен свеже и не должно быть использовано более чем через 20 мин после приготовления; если много измерений должны быть сделаны, аликвоты дитионита могут быть взвешены заранее и растворяют непосредственно перед использованием.
  4. Запустите мониторинг флуоресценции (возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, ширина щели 0,5 нм).
  5. Добавьте 40 мкл 1 М раствора дитионита в кювету 50 сек после начала флуоресценцию съемки (с использованием перегородку в крышке камеры кювета если это возможно) и продолжают регистрировать флуоресценцию в течение еще 400-600 сек.
  6. Анализ данных, как описано в разделе 3.

3.Анализ данных

  1. Кинетика Scrambling
    1. Охарактеризуйте флуоресценции след каждого образца , полученного с помощью анализа scramblase активности путем определения начального флюоресценции, F I, перед добавлением дитионита, а конечная точка флюоресценции, F, достигается после того, как > 400 сек. F I определяется для каждого образца как среднее значение флуоресценции , за период 30 сек перед добавлением дитионита.
    2. Определить данные конечной точки , соответствующие степени восстановления флуоресценции, R = 100 • F / F я. Мы используем термины R L для безбелковых липосом и R P для Opsin содержащих протеолипосом.
  2. Определение молекулярной массой Функционально Scramblase восстановленного
    1. Преобразование данных по уменьшению флуоресценции в соответствии со следующим уравнением:
      р (≥1 scramblase) = (R P - R L) / (R макс - R L) (уравнение 1)
      ЗАМЕТКА: Где R макс является максимальное сокращение, которое получается , когда достаточное количество белка восстанавливали таким образом, что все пузырьки в образце обладают , по меньшей мере , одну функциональную scramblase, и р есть вероятность того, что конкретный везикул в реконструированном образце 'scramblase-активный », то есть он обладает , по меньшей мере , одной функциональной scramblase. Значение R L , как правило , 45% , тогда как 3 R Макс , как правило , 82,5% 3, вместо ожидаемого 100% (R макс может быть определено экспериментально для опсином протеолипосомах с ППР> 1 мг / ммоль). Как R макс <100% предполагается , что субпопуляции везикул является невосприимчивой к восстановления. Для R макс = 82,5%, доля везикул , что не может принять белок 0,35.
    2. Опишите связь между р (≥1 scramblase) и ППР (мг белка / ммоль фосфолипидов) по статистике Пуассона следующим образом:
      р (≥1 scramblase) = 1 - е -m = 1 - ехр (-PPR / а) (уравнение 2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если м = количество scramblases на пузырьке, а = моно-экспоненциальной подгонки постоянной в единицах мг белка / ммоль фосфолипидов.
    3. Поскольку доля везикул не способствует карабкаться даже при высокой PPR (обсуждение см), изменить уравнение к:
      р (≥1 scramblase) = 1 - ехр (-PPR * / α) (уравнение 3)
      Примечание: Там , где ППР = ППР / (1- е), где F является огнеупорный популяция везикул или, в данном случае, ППР = ППР / 0,65 (Уравнение 4).
      Примечание: Подгонка константа α определяется путем подгонки график р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * с моно-показательной функции. Если опсина (молекулярная масса 41,7 кДа) функционально реконструируют в пузырьках 175 нм диаметра (каждый пузырек имеет 280,000 фосфолипиды 26) в качестве мономера, а = 0,187 мг ммоль -1. Если опсина димеризуется до восстановления 3 с получением scramblase-активных везикул, то α= 0,37 мг ммоль -1. Если PPR PPR , а не * должны были быть использованы для анализа, то соответствующие значения альфа будет 0,122 и 0,244 мг ммоль -1. Эти предсказанные значения для а предположим, что все молекулы Opsin функционально компетентны. Если только часть молекул компетентен карабкаться липиды, то соответствующие значения а будет больше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерного состояния, в котором опсина функционально реконструируют в везикулы.

Для определения оптимальных условий восстановление, необходимо определить эмпирически количес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью 2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких как НБД-фосфатидилэтаноламина, меченные NBD на ацильной цепи , как показано на НБД-ПК на рисунке 1А, или на головная группа, НБД-сфингомиелина или NBD- фосфатидилсерин 2), эффект везикулы липид...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) и проектом J3686 (B.P.) Австрийского научного фонда (FWF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолинAvanti Polar Lipids850457CPOPC
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерин) (соль натрия)Avanti Polar Lipids840457CPOPG
1-пальмитоил-2-{6-[7-nitro-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]гексаноил}-sn-глицеро-3-фосфохолинAvanti Polar Lipids810130CNBD-PC
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислотаVWR ScientificEM-5330HEPES
NaClSigmaS7653-1KGNaCl
додецил-&бета;-D-мальтозидAnatraceD310 5 GMDDM
Флуориметр кюветысигмаC0918-100EAкюветы
СпектрофлуориметрPhoton Technology International, Inc.флуориметр
гидросульфит натрия технический сорт, 85%Sigma157953-5Gдитионит
GraphPad Prism 5 программное обеспечениеPrism
Tris BaseVWRJTX171-3Tris
LIPEX 10 мл экструдер Компания «Нортерн Липидс, Инк.»Экструдер
Ватман, Дренажный диск, ПЭ, 25 ммСигма28156-243Дисковая поддержка
Ватман Nuclepore Track-Etched Мембраны, 0,4 и микро; m, диаметр 25 ммSigmaWHA110607400 нм мембрана
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 & микро; m, диаметр 25 ммSigmaWHA110606200 нм мембранный
фосфатнатрия SigmaS3264-500G
VWR Пробирки для культивирования, одноразовые, боросиликатное стекло, 13 x 100 ммVWR Scientific47729-572стеклянные пробирки
Хлорная кислотаSigma30755-500ML
Молибдат аммония ТетрагидратSigmaA-7302молибдат аммония
(+)-L-аскорбат натрияSigmaA7631-25Gаскорбат натрия
Био-гранулы SM2 адсорбентыBio Rad1523920гранулы полистирола
  2,0 мл Микропробирки прозрачныеVWR Scientific10011-742Пробирки для восстановления
стеклянной пробиркиVWR Scientific53283-800Пробирки для восстановления стеклянных пробирок
Zetasizer Малверн СДО

Ссылки

  1. Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
  2. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
  3. Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115(2014).
  4. Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
  5. Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an' what's the reason for? ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
  6. Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
  7. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
  8. Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925(2012).
  9. Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
  10. Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
  11. Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
  12. Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
  13. Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
  14. Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
  15. Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
  16. Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
  17. Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
  18. Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
  19. Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
  20. Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
  21. Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
  22. Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
  23. Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
  24. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  25. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
  26. Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
  27. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367(2013).
  28. Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
  29. Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
  30. Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
  31. Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
  32. Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
  33. Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NBD PCGPCR
Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.