Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54657

⸱

30 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Способность метастатических клонов колонизировать удаленные участки зависит от их способности к пролиферации и/или их способности выживать в микроокружении хозяина без значительного пролиферирования. Здесь мы представляем животную модель, которая позволяет количественно визуализировать оба типа колонизации печени метастатическими клонами.

Аннотация

У больных с ограниченным числом метастазов в печени и медленных темпов прогрессирования можно успешно лечить с местным лечением приближается к 1,2. Тем не менее, мало известно о гетерогенности метастазов в печени, а также на животных моделях, способных оценить развитие отдельных метастатических колоний необходимы. Здесь мы представляем улучшенную модель метастазов в печени, что обеспечивает возможность количественно визуализировать развитие отдельных опухолевых клонов в печени и оценить их кинетики роста и эффективности колонизации. Мы создали панель моноклональных производных HCT116 раковых клеток человека колоректального стабильно меченных люциферазы и tdTomato и обладающих различными свойствами роста. С селезеночной инъекции с последующим спленэктомии, большинство из этих клонов способны генерировать метастазами в печени, но с различными частотами колонизации и различной скоростью роста. Использование Syste В визуализации in vivoм (ИВИС), можно визуализировать и количественно развитие метастаз с люминесцентными в естественных условиях и исключая виво флуоресцентных изображений. Кроме того, Диффузный Люминесцентные визуализации томография (DLIT) обеспечивает 3D распределение метастазов в печени в естественных условиях. Ex естественных условиях флуоресцентной визуализации добываемых печени обеспечивает количественные измерения отдельных печеночных метастатических колоний, что позволяет для оценки частоты колонизации печени и кинетики роста метастазов. Так как модель аналогична клинически наблюдаемых метастазов в печень, он может служить в качестве механизма для выявления генов, связанных с метастазами печени, а также для тестирования потенциальных абляционные или вспомогательной терапии для лечения болезни печени метастазами.

Введение

У больных с метастазами в печень от первичных колоректального рака (КПР) характеризуются неблагоприятным прогнозом. Уровень 5-летней выживаемости для первичных неметастатическим CRC (этапы I - III) оценивается в 75 - 88% 3,4, в то время как у пациентов с метастазами в печени (стадия IV) имеют 5-летняя выживаемость составляет всего 8 - 12% 5 , 6. Тем не менее, у пациентов с метастазами представляют собой разнородную группу, представляя с различным числом метастазов и рецидивов разное время. Клинические наблюдения показывают , что количество метастазов (которое может быть пропорционально колонизируя способности или частоты колонизации) и размер любого отдельного метастаз (пропорциональной локальной скорости роста) являются независимыми прогностическими факторами 1,7. Другими словами, успех метастатических клонов колонизаторов печени зависит от двух основных свойств: их способность расти и их способность распространять и выживать в микросреде печени.

Дизайниз успешных клинических моделей с возможностью захвата и количественной оценки свойств метастатических клонов может существенно улучшить наше понимание печени метастаз биологии и обеспечить эффективный инструмент для разработки потенциальных терапевтических подходов. Модели экспериментальной метастазов в печени были ранее сообщалось 8,9, но ни один из них предоставил возможность количественно фиксировать и описывать свойства отдельных метастатических клонов , как в естественных условиях и бывших естественных условиях.

Здесь мы представляем новую, современную модель метастаз печени, которая включает генерацию опухолевых клонов с различной эффективностью колонизация печени и ростовые свойства. Мы использовали сочетание двойного мечения раковых клеток с люциферазы и tdTomato флуоресцентного белка с поколением моноклональных клеточных линий, которые имеют внутренние различия в метастатической способности. В этой экспериментальной модели, данные показывают, что развитиеметастазы в печень могут быть описаны в терминах частоты колонизацию и время удвоения (Td), что согласуется с клиническими наблюдениями. Количественный характер этой модели делает его легко оптимизируется для открытия новых лекарств и диагностических целей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете Чикаго (Протокол № 72213-09) с помощью и осуществляется в стерильных условиях.

1. Подготовка

  1. Сделать 500 мл среды для культуры НСТ116 опухолевых клеток: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина.
  2. Автоклава инструменты, которые будут использоваться для модели инъекции селезенке, в том числе 3 - 4 хирургические полотенца, марля, два маленьких Адсон пикапов, водитель иглы, две пары ножниц, небольшой зажим и 3 microclips, при 251 ° F в течение 20 минут ,
  3. Готовят послеоперационной анестезии для мышей, чтобы вводить подкожно после инъекции селезенке. Развести 2 - 4 мкг бупренорфина в 500 мкл 0,9 физиологического раствора на мышь.
  4. Подготовить аликвот 150 мкг / 150 мкл светляков люциферин для внутрибрюшинные инъекции DurИНГ биолюминесценции анализы. Хранить при температуре -20 ° C и защищать от света.

2. Генерация люциферазы / tdTomato-меченых моноклональных клеточных линий 10,11

  1. Оттепель и поддерживать НСТ116 человека клеток колоректального рака и 293FT эмбриональные клетки почки человека в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Поддерживать в культуре на уровне 5% CO 2 и 37 ° С.
  2. Продукция высокого титра лентивирус.
    1. На D 1, пластина 10 - 12 х 10 6 293FT клеток между прохождением 3 и 10 в 15 см чашки для культивирования клеток в 18 мл полной DMEM (cDMEM) с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% заменимых аминокислот , Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
    2. На D 2, трансфекции клеток с использованием следующего раствора для трансфекции:
      1. Для каждого блюда, используйте следующее: ДНК-смесь 37,5 мкг лентивирусов вектора pFUG вставленной с люциферазы (Luc2) и tdTomatoстроит 11 (подарок от доктора Джеффри Грин в Университете Чикаго), 25 мкг pCMVΔ8.74 и 12,5 мкг pMD2.G ресуспендировали в общей сложности 1,062 мкл стерильной H 2 O. Добавьте 188 мкл 2 М CaCl 2.
      2. Добавить 1 250 мкл 2x Hepes-буферном солевом растворе (HBS, 50 мМ Hepes, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, и 180 мМ NaCl, рН 7,12) к раствору ДНК / CaCl 2, капля за один раз, в то время как мыльные пузыри через раствор пипеткой.
      3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем добавляют 15,5 мл RT cDMEM и хлорохин, чтобы получить конечную концентрацию 25 мкМ.
    3. Аспирируйте СМИ в каждом блюде из 293FT клеток и заменить раствором трансфекции. Добавить 16 мл трансфекционную раствора медленно, как нанесенное клетки легко смещать.
    4. На D 3, после того, как 8 - 16 ч, удалить раствор Трансфекция и промыть клетки один раз с Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (ДЗФР), опять такинг осторожность, чтобы не сместить клетки. Заменить носитель с 18 мл свежего cDMEM с 10 мМ Hepes.
      Примечание: Медленно перемещайте блюда, аспирация решение трансфекции, а также добавить носитель через боковую стенку пластин так, чтобы не вытеснить клетки.
    5. На D 4, в 48 ч с момента трансфекции, собирают материал из блюд, медленно аспирационных с пипеткой, чтобы не вытеснить клетки. Центрифуга собранные средства массовой информации при 300 мкг в течение 5 мин для осаждения большой остатков клеток.
    6. Фильтр вирусный супернатант использованием 0,45 мкм с низким содержанием белка связывающего Фильтровальная колба и центрифугу с использованием SW-28 ротор в течение 2 ч при 50000 х г и 4 ° С. Слейте супернатант сразу после того, как центрифугирование отделок и высушить внутреннюю часть трубы с стеклоочистителей.
    7. Ресуспендируют вирусный осадок в 50 мкл Сниженная сыворотки среды (RSM) с 1% FBS. Аликвоты можно хранить при температуре -80 ° С для последующего использования (вирусный штамм).
  3. Трансдукции лентивирусовэс в HCT116 клеток и создать группу tdTomato-положительных клонов.
    1. Пластина клеток НСТ116 при плотности 1 х 10 5 в 24 - луночные планшеты 1 г до вирусной инфекции.
    2. Развести 40 мкл ресуспендированной вируса (от 2.2.7) в 4 мл RSM (разведение 1: 100) с 1% пенициллина / стрептомицина и 8 мкг / мл полибрена (CRSM).
    3. В день инфекции, мыть клетки один раз с ДЗФР, а затем добавляют 250 мкл разбавленного вируса из стадии 2.3.2 в каждую лунку. Выдержите в течение 4 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2, а затем добавляют 1 мл cDMEM в каждую лунку; инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 - 72 ч.
    4. Ресуспендируют клеток в 1 мл 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА, а затем добавляют 1 мл cDMEM для нейтрализации трипсина. Передача клетки микроцентрифужных трубки и гранулы при 300 мкг в течение 4 мин. Вымойте гранул 3 раза в 1 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) плюс 2% FBS.
    5. Ресуспендируют осадок со стадии 2.3.4с FACS буфером (2% FBCS и 2 мМ ЭДТА в PBS) в одной клеточной суспензии на 1 × 10 6 клеток / мл.
    6. Отсортируйте tdTomato-положительных НСТ116 клеток с использованием клеток сортировщик, стробирования для PE-позитивных клеток (возбуждение / излучения: 556/585 нм). Grow собранные клетки в 10-см чашку на 5% CO 2 и 37 ° C для создания родительских tdTomato-позитивных клеток НСТ116 (Рис . 1А)
    7. Ресуспендируют родительских tdTomato-положительных клеток НСТ116 из 2.3.6 с 8 мл 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА в течение 3 - 5 мин, а затем добавляют 8 мл cDMEM для нейтрализации трипсина.
      1. Передача клеток в 50 мл трубки и гранулы при 300 мкг в течение 4 мин. Удалить супернатант и разбавить родительских tdTomato-положительных клеток НСТ116 до 1 клетки на 200 мкл в cDMEM (Рисунок 1В).
    8. Пластинчатый одну ячейку (200 мкл разведения) на лунку в 96-луночный планшет при 5% CO 2 и 37 ° С (рис 1C).
    9. Grow отдельных моноклональных антител в колбах при 5% CO 2 и 37 ° С. (Рисунок 1D).

3. Калибровка интенсивности флуоресцентного сигнала как функция Количество сотовых

  1. Пластинчатый трансфектированных клеток НСТ116, теперь упоминается как НСТ116-L2T, при плотности 0, 10 3, 2 х 10 4, 3 х 10 5, 5 х 10 4, 7 х 10 4, 9 х 10 4, и 10 5 клеток / лунку в 96 - луночные планшеты при трехкратном повторе для каждой плотности.
  2. Через 5 часов инкубации, количественно tdTomato флуоресцентные интенсивности с использованием ИВИС 10.
    1. Нажмите на иконку образа программного обеспечения на рабочем столе, чтобы запустить программное обеспечение. Нажмите на кнопку "Initialize" для инициализации системы формирования изображения. После инициализации отделки (которая занимает около нескольких минут), выберите "флуоресцентной", "4 второго" времени экспозиции, "Medium" биннинга, "2" F / стоп, "535" Фильтр возбуждения,и "580" эмиссионный фильтр.
    2. Поместите 96-луночный планшет на станции формирования изображения и нажмите на кнопку "Приобретать", чтобы начать визуализацию. После того как изображение приобретается, нажмите кнопку "ROI Tools" в палитре инструментов и выберите 12 х 8 с помощью значка щели.
    3. Создание 12 х 8 прорезями, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении 96-луночного планшета и выберите вкладку измерений. Заметим , окно с таблицей измерений ROI с единицами фотонов в сек на стерадиан на квадратный сантиметр (фотонов / с / ср / см 2).
  3. Построить диаграмму рассеяния с аргументом (ось X), равное количеству клеток и функции (ось Y), представляющего интенсивность сигнала. Расчет кривых регрессии с использованием программного обеспечения для анализа данных для расчета количества ячеек , соответствующих единицах интенсивности флуоресценции (рис 2) 10.

4. Модель животных печени метастазами

  1. После того, как НСТ116-L2T клетки достигают 70- 80% конфлюэнтности, подготовить их примерно 1 ч до инъекции селезенке. Диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина в 0,53 мМ ЭДТА в течение 3 - 5 мин, а затем нейтрализуют их с равным количеством cDMEM. Убедитесь в том, чтобы тщательно пипеткой, чтобы избежать образования комков.
  2. Граф клеток с автоматическим счетчиком клеток.
  3. Ресуспендируют клеток в 1X ДЗФР до концентрации 1,2 - 2 х 10 6 клеток / 100 мкл. Убедитесь в том, чтобы пипеткой и ресуспендирования клетки тщательно, чтобы избежать образования комков.
  4. Хранить клетки на льду до инъекции, время от времени ресуспендирования их в трубе.
  5. Перед обезболиванием мышей, обеспечивают предоперационной анестетик и болюс жидкости путем подкожной инъекционное 500 мкл бупренорфина смеси, описанной в пункте 1.3. Администрирование ту же дозу дополнительного бупренорфин смеси два раза в день, пока признаки боли (снижение подвижности, сгорбившись роста, неспособность жениха, вокализации когда обработано) не решены.
  6. Обезболить от 6 до 8 недель-Старый самка бестимусных голых мышей с 2% изофлуран в кислороде в анестезии камере. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, зажимая хвост. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Передача каждого наркозом мышь к отдельному конусообразной для инъекции селезенке. До начала надреза, каждая мышь должна быть покрыта стерильной хирургической простыне.
  7. Определить селезенку как фиолетовой области видно снаружи через кожу на левом фланге голых мышей. Использование микродиссекции ножницами, сделать 8 мм левый фланг надрез на коже непосредственно над селезенкой.
    1. Затем поднимите на брюшной стенке и сделайте небольшой надрез. Обеспечить возможность поступления воздуха в брюшную полость так, что внутренние органы отодвигаться от места надреза. Увеличить брюшной стенки надрез до примерно 5 мм.
    2. Выставляют селезенку, осторожно применяя давление вокруг разреза с помощью ватного тампона. При необходимости, панкреатический жир может быть мягко человекipulated, чтобы помочь с воздействием таким образом, чтобы не повредить селезенку.
  8. Медленно вводят по 100 мкл клеток с использованием 1 мл шприц с иглой 27 G в кончик открытой селезенки. Вводят медленно, в течение периода, по меньшей мере, 30 - 60 с, чтобы избежать опухолей экстра-печени.
  9. Поместите microclip на селезенке перед извлечением иглы в конце инъекции, чтобы предотвратить утечку закачиваемой суспензии клеток.
  10. Оставьте microclip на месте в течение 5 мин.
  11. 5 мин послеинжекционной, выполнить спленэктомии с использованием ручных прижиганием устройство для гемостаза. Рассеките селезеночной рубчик, начиная с передней стороны. При вскрытии крупных сосудов, предварительно коагулировать проксимальной стороны сосудов с прилегающей жировой ткани, используя прижигание, чтобы избежать чрезмерного кровотечения.
    Примечание: Методы гемостаза: коагулировать кровоточащий непосредственно с прижиганием, оказать давление на кровоточащий в течение 3 - 5 мин, или шовный-лигировать кровоточащий с 5-0 шелковым галстуком.
  12. Закройте фланговую надрез каждой мыши в два слоя. Во- первых, закрыть брюшной стенки с 5-0 рассасывающиеся плетеным швом (например, викрил) в одной горизонтальной строчкой. Затем закройте кожу с помощью 4-0 невсасывающихся мононити швом (например, проленовой), опять же с одной горизонтальной строчкой.
  13. Очистите все инструменты путем распыления 70% изопропиловый спирт для поддержания стерильных условий между каждой процедурой.
    Примечание: Убедитесь, что животные нагреваются, пока они просыпаются от наркоза. Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторного и вернуться к нормальной деятельности. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 3 - 5 мин. Не оставляйте животных без присмотра, пока они не восстановили достаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока он не полностью восстановилась.

5. В Vivo Биолюминесцентный обработки изображений

  1. Выполните визуализацию наЕженедельно для измерения и количественной оценки изменений в биолюминесценции с течением времени.
  2. Место мышей в камере анестезии и обезболить их с 2% изофлуран в кислороде. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, зажимая хвосты. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Далее, внутрибрюшинно вводят каждую мышь с 150 мкл заранее подготовленные светлячка люциферин с шага 1.4.
  4. Поместите мышам в ИВИС с индивидуальными носовых конусов введение изофлуран. Поместите мышей в положении лежа на спине с распорками между ними, чтобы свести к минимуму сигнала на соседних мышей. Не более пяти мышей могут быть отображены в одно время.
  5. Измерение и анализ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ интенсив- 3 мин после инъекции люциферин.
    1. После инициализации ИВИС, как описано в пункте 3.2.1, выберите "люминесцентного", "1 секунда" время выдержки и биннинга "Medium".
    2. Нажмите на кнопку "Приобретать", чтобы начать Imaginг. Убедитесь в том, чтобы выполнить каждую визуализацию при постоянной времени (3 мин) после инъекции люциферин.
    3. После того как изображение приобретается, появится окно изображения и палитры инструментов. Нажмите "ROI Tools" и выберите "1", "2", "3", "4", или "5" от значком в виде круга, что соответствует количеству мышей изображаемых.
    4. Для того, чтобы определить области интереса (трансформирования), обведите область сигнала сигнала люминесцентного в брюшной полости мыши, а затем нажмите кнопку "измерения" на ROI в качестве произвольной единицы лучистой эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2)). Убедитесь в том, чтобы иметь дополнительный ROI круг фона.
  6. В четыре недели после инъекции и до принесения в жертву животных, выполнять Diffuse Люминесцентные визуализации томографии (DLIT) с использованием ИВИС для оценки опухолевой нагрузки и распределения с использованием реального времени 3D-реконструкция биолюминесценции интенсивности отдельных опухолевых колоний.
  7. Обезболить мышей и вводят люциферин, как описано в пункте 5.2.4. DLIT выполняется на одной мыши в то время.
  8. После инициализации ИВИС, как описано в пункте 3.2.1, выберите "Мастер обработки изображений", "биолюминесценции", и нажмите кнопку "Далее". Выберите "DLIT" и нажмите кнопку "Далее". Выберите "Светлячок" зондов и нажмите кнопку "Далее". Выберите "мышь" сюжетное изображение, "Авто" параметров экспозиции, "C-13 см" поле зрения ", и 0,5 см" при условии высоту, и нажмите кнопку "Далее". Нажмите на кнопку "Acquire", чтобы начать визуализацию.
  9. После того как изображение приобретается, выберите вкладку "DLIT 3D реконструкция" и "Анализ" Вкладка и нажмите кнопку "Реконструировать" для создания 3D-реконструкции изображения.
  10. Нажмите "Инструменты" и "3D-анимации". Выберите «Spin КНО по оси Y." в окне 3D-анимации. Нажмите кнопку "Запись" и "Сохранить" в файл формата .mov.

6. Ex Vivo флуоресцентная томография

  1. Жертвоприношение мышей путем смещения шейных позвонков в то время как под наркозом, или в соответствии с ведомственным руководящим принципам в 4 - 6 недель после селезенке инъекций.
  2. Заготавливают печень. Сделайте горизонтальный разрез слева на правый фланг. Схватив мечевидного отростка с пикапа, рассекают серповидной, печеночной вены и нижней полой вены.
    1. Рассеките правый гепаторенальный связки, гепатодуоденальной связки, а левый гепаторенальный связки, следя за тем, чтобы не повредить хвостатого мочку во время рассечения гепатодуоденальной связки. После сбора печени, удаления желчного пузыря, так как это будет отображать аутофлюоресценция. Обратите внимание на каких-либо дополнительных опухолей экстра-печени, присутствующих.
  3. Обратите внимание на цифры и размеров опухолей печени присутствует макроскопически, и поместите заготовленные печенки в ДЗФР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли макроскопически видны невооруженным глазомв виде белых опухолей (для репрезентативного примера, смотри рисунок 4).
  4. До размещения на листе изображения, возьмите каждую печень и осторожно удалить лишнюю жидкость путем промокания на бумажное полотенце.
  5. Измерьте флуоресцентные интенсивности от каждой колонии опухоли с использованием ИВИС.
    1. Выберите "Флуорецсенция", "4 секунды" время экспозиции, "Medium" биннинга, "2" F / остановка "535" фильтра возбуждения, и "580" эмиссионный фильтр. Нажмите на кнопку "Acquire", чтобы начать визуализацию.
    2. После получения изображения, найдите окно изображения и палитры инструментов. Нажмите кнопку "ROI Tools" и выберите "1" значком в виде круга. Для определения трансформирования, обведите область сигнала отдельных опухолевых колоний на изображении, а затем нажмите кнопку "измерения" на ROI в качестве произвольной единицы лучистой эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2) ). Убедитесь в том, чтобы иметь дополнительный ROI круг фона.
    3. Вычислить общий объем опухоли, если предположить, что это будет сфера. Объем опухоли = 4 х π хт 3/3 (г = радиус). Рассчитать долю опухолевых колониеобразующих клеток (Fc), как количество опухолей в печени, деленное на число клеток splenically впрыскиваемого.
    4. Подсчитайте общее число клеток на колонию (= X) от линейной аппроксимации с шага 3.3. Подсчитать количество клеточных делений (= Y), а Y = Log 2 X и Td , как Td (день) = 28 / Y.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью этого эксперимента было создать последовательную и легко воспроизводимый животной модели с потенциалом для последовательной количественной оценки метастатической опухолевой в естественных условиях и для оценки частоты колонизирующего и кинетики роста развития метастазов в печени. На рисунках 2-6, легендами, предоставляются из нашей предыдущей публикации под лицензией Creative Commons CC-BY 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Животная модель представлена ​​в нынешнем докладе, основывается на двух основных подходов. Во- первых, с тем чтобы обеспечить возможность наблюдать метастатических клонов с различными наклонностей колонизировать и размножаться в печени, была создана группа из сильно неоднородных линий моноклональных клеток, а не установленной клеточной линии 12,13 нефракционированного рака. Моноклональное подход к развитию метастаз оправдано недавними геномных данных 14 и был успешно применен ранее для моделировани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джеффри Л. Грин (Университет Чикаго) для плазмиды Luc2-tdTomato и линии клеток НСТ116, г-н Ани Соланки (Animal Resource Center) для управления мышей, и д-р Лара Leoni за помощь с DLIT. Количественными флуоресцентных и люминесцентных интенсивностей были выполнены в Комплексном мелких животных Imaging Research Resource в Университете Чикаго в IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Эта работа была поддержана Вирджинии и DK Людвиг фонд исследований рака, легких Cancer Research Foundation (КЗоТ), Фонд рака простаты (PCF) и онкологический центр поддержки Грант (P30CA014599). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
IVIS Spectrum In Vivo Система визуализацииCaliper Life Sciences124262In Vivo Система визуализации
LivingImage 4.0 Программное обеспечениеCaliper Life Sciences128165Программное обеспечение для визуализации
VAD-MGX Исследовательский наркозный аппаратVetamacVAD-MGXАппарат для ингаляционной анестезии
DMEMGibco11965-118Реагенты для клеточных культур
DPBSGibco14190250Реагенты для клеточных культур
Пенициллин/Стрептомицин, жидкие (10 000 единиц пенициллина; 10 000 μ g стрептомицин)Реагенты для клеточных культурInvitrogen15140163
HBSSThermoFisher24020117Реагенты для клеточных культур
Buprenex Injection (0,3 мг/мл)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-5Бупренорфина гидрохлорид
Gemini Cautery SystemBraintree ScientificGEM 5917Ручное прижигание для спленэктомии
Micro Clip; Прямой; давление 70 грамм; ширина клипсы 1,5 мм; Длина челюсти 10 ммХирургический инструмент RobozRS-5426Hemoclip: инструменты для гемостаза после инъекции селезенки
D-люциферин, калийная сольGoldbio TechnologyLUCK-1Gлюциферин калийная соль
Opti-MEM I Уменьшенная сыворотка MediumGibco31985062уменьшенная сыворотка Среда
TC20 Автоматический счетчик клетокBIO-RAD1450102Автоматический счетчик клеток
Программное обеспечение JMP10 Программное обеспечение для анализа данныхSAS Institute
BD FACSAria II клеточный сортировщикBD BiocsiencesКлеточный сортировщик

Ссылки

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714(2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821(2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141(2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650(2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IVISHCT116
Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.