Методическая статья

Простой механический Процедура создания лимбальных Дефицит стволовых клеток у мышей

DOI:

10.3791/54658

⸱

17 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В следующей статье дается легко воспроизводимый метод для эффективного создания устойчивой модели мыши дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD). Эта модель животных полезна при тестировании и сравнения эффективности лечения заболеваний лимбальных стволовых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) представляет собой состояние неисправности или потере лимбальных эпителиальных стволовых клеток, после чего эпителий роговицы заменяется конъюнктивы. Пациенты страдают от повторяющихся дефектов роговицы, боль, воспаление и потеря зрения.

Ранее мышиной модели LSCD была описана и по сравнению с двумя другими моделями. Цель состояла в том, чтобы произвести последовательную модель мыши LSCD, что оба имитирует фенотип у человека и длится достаточно долго, чтобы сделать возможным изучение патофизиологии болезни и оценить новые методы лечения. Здесь, метод описан более подробно.

Моторизованные инструмент с вращающимся заусенцев предназначен для удаления ржавчины кольца с роговичной поверхности или сгладить крыловидной кровать у пациентов. Это подходящее устройство для создания желаемой модели LSCD. Это легко доступный, простой в использовании инструмент с тонким наконечником, что делает его подходящим для работы на маленьких глаз, посколькуу мышей. Его применение предотвращает ненужную травмы глаз, и это не приводит к нежелательным травмам, как это часто бывает с моделями химического повреждения. В отличие от тупого скребка, он удаляет эпителий с базальной мембраной. В этом протоколе, лимбальных район был истирается два раза, а затем весь эпителий роговицы была выбрита от лимба до лимба. Во избежание травм стромы, были приняты меры, чтобы не чистить поверхность роговицы после того, как эпителий уже была удалена.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий роговицы требуется для поддержания ясности и целостности роговицы. Он постоянно обновляется на протяжении всей жизни эпителиальными стволовыми клетками, проживающих в лимба-узкой зоне на стыке роговицы и конъюнктивы. Эти самообновляющихся лимбал стволовые клетки играют важную роль в регенерации эпителия роговицы, как правило, и после травмы. Частичное или полное истощение этих стволовых клеток будет приводить к рецидивирующих эрозий роговицы, боль, рубцевания роговицы и неоваскуляризации, появление бокаловидных клеток, и если его не лечить, роговице слепоте. Это состояние известно как дефицит лимбальных стволовых клеток (LSCD) и может быть идиопатической; наследственным; или приобретенные в результате химических или термических повреждений, долгосрочные ношения контактных линз, и хронического воспаления 1-6.

Исследование LSCD требует подходящей животной модели, которая не только подражает болезнь у людей, но является воспроизводимым и устойчивым, с меньшей мере,монтирование вреда другим роговицы и глазного структур. Эта модель необходима для оценки лечения и уточнения механизмов болезни на молекулярном и клеточном уровнях. Как было описано до 1, с использованием вращающегося заусенцев, можно легко разработать модель мыши LSCD , который показывает вышеупомянутые преимущества и сохраняется в течение не менее трех месяцев. Целью данного исследования является представить простой, воспроизводимой и устойчивой модели на мышах LSCD.

Вращающийся заусенцев представляет собой удобный инструмент , который равномерно удаляет эпителий , не повредив основную строму 1. Он был использован для индукции центрального участка роговицы эрозии 7, 8 в заживлении ран исследований. Методика настоящим представил создать LSCD в мыши не сообщалось ранее. Ранее введены методы соскоба эпителия с тупым результате шпателем в менее равномерном травмы, особенно у лимба-и более переменной фенотипу 1, 9, с большим восстановление Oе нормальный эпителий роговицы 1. В отличие от тупого скребка, вращающаяся заусенцев удаляет эпителиальный базальную мембрану а также 7, 8, 10. Другие сообщения методы разрывать стволовых клеток включают в себя использование химических веществ, таких как гидроксид натрия, н-гептанол, и хлорид бензалкония, который не только может вызвать нежелательное повреждение к нижележащим структур глаза, но и может привести к значительным воспалением и последующим роговичного помутнения или эпителиальной плоскоклеточной метаплазии 11-15. Вращающийся заусенцев не связано с этими серьезными осложнениями. Хирургически удаления лимбальную эпителий, в одиночку или с использованием химических веществ 10, 11, 16, является более трудным для выполнения и не самый лучший вариант у животных с маленькими глазами и тонким лимбальных эпителии (например , мышей). Кроме того, как ни удивительно, limbectomy все еще может оставить некоторые лимбальных эпителия позади 10.

Описанные ниже методика приводит к LSCD с неоваскуляризации А.Н.d conjunctivalization, имитирующее представление полного LSCD у больных и длится в течение по крайней мере трех месяцев 1. Она подходит для тех, кто стремится изучить LSCD или заживлении ран патофизиологии, иммунологии и потенциальных методов лечения у мышей. Возможно, с некоторыми изменениями, эта процедура может быть выполнена у крыс и кроликов 10. По мере того как вращающаяся заусенцев эффективно удаляет эпителий, оно может быть использовано в любых исследований, относящихся к роговичного эпителиального истиранию / ранении и в любых связанных с лечения или исследований по молекулярной биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, выполняемые на животных соответствуют ассоциации по исследованиям в области заявлений зрения и офтальмологии для использования животных в научных исследованиях зрения. использовались Четырнадцать четырех до шести-месячных мышей C57BL 6J типа мужских / женских / диких: десять мышей для модели травмы и четыре, как у контрольных животных (разматывать роговица).

1. Подготовка животных

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинного введения 100 мг / кг кетамина и в 5 мг / кг ксилазина смеси. После того, как анестезия вступили в силу, зажать палец, чтобы подтвердить глубину анестезии; животное не должно реагировать.
  2. Осмотрите глаза под щелевой лампой перед проведением экспериментов, чтобы убедиться в отсутствии какой-либо предыдущей травмы роговицы.
  3. Привить капли 1% тетракаина гидрохлорид на глаз. Через 60 - 90 секунд, проверить рефлекс роговицы, чтобы подтвердить отсутствие ощущения. Пропаракаина гидрохлорид 0,5% могут быть использованы вместо.
  4. Когда потеря чувствительности роговицынаверняка, аккуратно поместите каплю 5% повидон-йода на глаз и на волосы вокруг глаз. Вытрите капли через 1 мин или распространить его на волосы вокруг глаз, чтобы предотвратить волос от вмешательства в подсказке.

2. абразивные эпителий роговицы

  1. Носите хирургические перчатки и халат. Подготовьте необходимые инструменты: стерильный вращающийся заусенцев и пару стерильных пинцетов. Для лучшего контроля, используйте погнутые пинцета. Поместите инструменты на стерильную листа во время процедуры.
  2. Используя изогнутые пинцет, стабилизировать глаз, захватывая крышки из носовой части и аккуратно proptosing глаз. Избегайте использования слишком много давления.
  3. Под хирургическим микроскопом бриться на 360 ° вокруг лимбальных области дважды с использованием стерильного вращающегося заусенец. Обойдите лимба со скоростью 5 - 6 сек за раунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: заусенцев имеет одну фиксированную скорость. Тем не менее, для того, чтобы вращаться с установленной скоростью, "конец гайки" должен быть полностью затянут.
  4. Удалите весь эпителий роговицы от лимба до лимба с вращающимся заусенцев. Для достижения наилучших результатов, переместите инструмент по кругу и удерживать его несколько параллельно поверхности роговицы для работы с боковой стороны его кончика. Будьте осторожны, чтобы не повредить стромы, не повторно чистить те области, где эпителий уже удалена. Не применять какое-либо давление на глаза. Очистите кончик кисти по мере необходимости.
  5. Закапывание каплю стерильном фосфатно-солевом буферном растворе на роговице и вытереть любые обособленные эпителиальные листы с мягкой чистящей тканью.
  6. Бритье оставшийся эпителий, если таковой имеется.
  7. Обратите внимание на хвост мыши во время операции.
    Примечание: Если происходит какое-либо движение, глубина анестезии потускнела и требуется дополнительная инъекция. От одной трети до двух третей первичного введенного объема должно быть достаточно. Не передозировка животное с анестезирующего препарата.
  8. Стерилизовать все инструменты, прежде чем использовать их на другом глазу.

3. Подтвердите Полное удаление Эпителиальное

  1. Нанесите каплю 1 мг / мл флуоресцеина натрия на роговицу. Очистите роговицу через 30 секунд и исследовать его под микроскопом с кобальтовым синим фильтром для проверки полного удаления эпителия.
    Примечание: Роговичные участки с дефектами эпителия визуализируются в зеленый цвет.

4. Послеоперационный уход

  1. Поместите животное на нагревательную одеяло и держать его в надежном месте (например, в клетке) , тогда как при восстановлении. Не держите в бессознательном состоянии животное в компании сознательных.
  2. Применяют 1% эритромицин глазной мази. Это также поможет избежать глаз сухости. Продолжить приложение, к которому ежедневно антибиотик в течение недели.
  3. Вводят 0,1 мг / кг подкожно бупренорфин после процедуры и снова через 12 ч. Продолжить инъекции дважды в день в течение двух дней.
  4. Наблюдайте животное в течение 30 - 45 мин, до полного выздоровления от наркоза.
    ЗАМЕТКА: Умеренная движение дыхательных мышц на вентральной поверхности указывает на животных хорошее самочувствие в то время как при восстановлении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение месяца после выполнения этой техники, 100% роговиц разработал поверхностный неоваскуляризации (рис 1A. Фотографии были сделаны с помощью камеры , подключенной к щелевой лампе под ярким полем и кобальта синим фильтром). В 18/20 (90%) , глаз, неоваскуляризация участвует вся поверхность роговицы (Фигура 1А). В 2/20 (10%), неоваскуляризации наблюдалось в трех из четырех квадрантах роговицы, но он все еще достиг роговой центра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается воспроизводимой и относительно простой метод, чтобы создать модель мыши LSCD. Есть несколько важных аспектов этой модели, которые стоит отметить. Во- первых, в отличие от моделей , которые используют химические вещества , 11, 12, травма в первую очередь включает в себя поверхностный эпителий (и базальную мембрану), с минимальным повреждением основной стромы роговицы или других внутриглазных структур. Таким образом, существует лишь ограниченное воспаление и рубцевание, оба из которы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что им нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Рут Zelkha, MS, за ее щедрую помощь в визуализации. Это исследование было поддержано Программа развития клинический научный сотрудник премии K12EY021475 М.Е., грант R01 EY024349-01A1 на ARD, основной грант EY01792 из Национального института глаза, NIH, и неограниченный грант от исследований, чтобы предотвратить слепоту. ARD является получателем премии в области развития карьеры от исследований по профилактике слепоты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вращающиеся заусенцы: средство для удаления ржавчины с кольца AlgerBrush II Rumex International Co, Clearwater, FL16-1410,5 мм жернов. Также доступно у других компаний.
Хирургический микроскопWild Heerbrugg, ШвейцарияWild M691
Цифровая фотоаппаратNikon, Таиланд
Фотоаппарат Nikon FS-2 щелевая лампаNikon, Япония
Поликлональное антитело против CK12Santa Cruz Blotechnology,CA,SC-17101концентрация 1:100
Моноклональное антитело против CK8TROMA-I-s, Айова-Сити, IAAB_5318261:50 концентрация

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
  2. Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
  3. Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
  4. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  5. Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
  6. He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
  9. Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
  10. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
  11. Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
  12. Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
  13. Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
  14. Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
  15. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  16. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
  17. Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
  18. Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
  19. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
  20. McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи