Методическая статья

Микроглия как суррогатного биосенсора, чтобы определить наночастицу нейротоксичности

DOI:

10.3791/54662

⸱

25 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроглия (иммунные клетки мозга), используются в качестве суррогатного биосенсора для определения влияния наночастиц на нейротоксичность. Мы описываем серию экспериментов, направленных на анализ реакции микроглии на наночастицы и воздействия на нейроны гипоталамуса надосадочной жидкости из активированной микроглии для определения нейротоксичности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наночастицы, обнаруженные в загрязнителях воздуха, могут изменять профили нейротрансмиттеров, усиливать нейровоспаление и изменять функцию мозга. Таким образом, описанный здесь анализ поможет выяснить роль микроглии в нейровоспалении и нейродегенеративных заболеваниях. Использование микроглии, резидентных иммунных клеток мозга, в качестве суррогатного биосенсора дает новое представление о том, как воспалительные реакции опосредуют нейронные повреждения. В данной работе мы используем иммортализированную линию мышиных микроглиальных клеток, обозначенную BV2, и описываем метод воздействия наночастиц с использованием наночастиц серебра (AgNPs) в качестве стандарта. Мы описываем, как подвергать микроглию воздействию наночастиц, как удалять наночастицы из надосадочной жидкости и как использовать надосадочную жидкость из активированной микроглии для определения токсичности, используя в качестве меры выживаемость клеток гипоталамуса. После воздействия AgNP активация микроглии BV2 была подтверждена с помощью иммуноферментного анализа фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) (ИФА). Надосадочную жидкость фильтровали для удаления AgNP и для того, чтобы цитокины и другие секретируемые факторы оставались в кондиционированной среде. Затем клетки гипоталамуса подвергались воздействию надосадочной жидкости из микроглии, активированной AgNP, и выживаемость нейронов определялась с помощью флуоресцентного анализа на основе резазурина. Этот метод полезен для использования микроглии в качестве суррогатного биомаркера нейровоспаления и определения влияния нейровоспаления на другие типы клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экологические загрязнения, в частности , те из наночастиц (NP) диапазоне (1 - 20 нм в диаметре), были связаны с ожирением и других нейродегенеративных заболеваний из - за способности пересечь барьер 1-3 гематоэнцефалический. Повышенные воздействие загрязнения может вызвать воспаление в центральной нервной системе , включающей в гипоталамусе 1. Один потенциальный механизм , в котором это происходит , может быть через наночастицами индуцированной активации микроглии (мозговые клетки иммунной системы ) 4. Предыдущие исследования используются в естественных условиях модели для изучения влияния NPs на здоровье мозга , которые отнимают много времени, дорого, и непосредственно не ответить на вопрос о том , как влияют на NPs микроглии. Микроглии играют многогранную роль в центральной нервной системе, в том числе поддержание микроокружение головного мозга и общения с окружающими нейроны посредством высвобождения секретируемых факторов и цитокинов. В зависимости от раздражителей, микроглии может быть активирован к пр M1о-воспалительное или M2 противовоспалительное состояние. Например, М1 активированный микроглии релиз провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа), в то время как М2 активации и выделения микроглии противовоспалительными цитокинами, включая интерлейкин-4 (IL-4). Для того, чтобы подтвердить нашу суррогат в пробирке биосенсора для определения нейротоксичности загрязнителей воздуха, мы измеряли микроглии ответ на 20 нм наночастиц серебра (AgNPs). Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать , как в пробирке микроглии клеточная линия может быть использована в качестве суррогатного маркера биосенсора для тестирования мышиного микроглии ответ на Соседства и как микроглии активации влияет на гипоталамические клетки. В долгосрочной перспективе предусматривается применение этой модели является проверенной, чтобы проверить влияние реальных загрязнителей на здоровье мозга и нейродегенеративных заболеваний. Мы предоставляем подробное описание в пробирке 96-луночного анализа формата для измерения активации микроглии и выживания клеток гипоталамуса следующие экспозиции микрофона roglial кондиционированной среды.

Активации микроглии определяли следующим AgNP экспозиции с помощью ФНО- твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Для определения влияния активированной микроглии на гипоталамических клеток, то AgNPs были удалены из микроглии супернатант (кондиционированной среды) с использованием фильтрующего устройства. Устройство фильтрации сохраняет цитокины в то время как за исключением AgNPs на основе размера. В кратком изложении, надосадочную жидкость из микроглии, обработанных с использованием или без AgNPs собирали, добавлены к фильтрам, и центрифугировали при 14000 х г в течение 15 мин. Мы тогда были в состоянии определить влияние микроглии секретируемых цитокинов на гипоталамо жизнеспособность клеток. Ячейка токсичности после воздействия кондиционированной среды (содержащей цитокины) определяли с помощью анализа на резазурин основе , как было описано выше 5,6. Метаболически активных клеток уменьшают резазурин и производят флуоресцентный сигнал , пропорциональный количеству жизнеспособных клеток 7.

нт "> Есть несколько преимуществ использования этого метода по сравнению с другими (например, сокультивирования, транс-луночных установок, или в экспериментах естественных условиях). Наша модель дает возможность напрямую активировать микроглии и определить , является ли секретируемые факторы являются токсичными для нейронов 8 . в настоящее время протокол использует увековечены BV2 микроглии стимулировали наночастиц диаметром 20 нм, и увековечил мышиных гипоталамических клеток (обозначенный mHypo-A1 / 2) 9 для определения последующего ответа. Хотя этот протокол был оптимизирован для этих конкретных условий, методы могут быть измененное для использования в других моделях микроглии-индуцированной гибели клеток, или с другими типами клеток, включая первичный микроглии и нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Техническое обслуживание микроглии Культура клеток

  1. Теплое среда для культивирования клеток (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин / Неомицин (PSN) до 37 ° С.
  2. Получение замороженного запаса bv2 клеток микроглии при прохождении 18 - 25 из хранения при -80 ° C. Быстро разморозить клетки в 37 ° С на водяной бане.
  3. Аккуратно перенести клетки на 75 см 2 вентилируемой колбу , содержащую 10 мл среды для культивирования клеток.
  4. Выдержите в колбу в 5% СО 2 при 37 ° С. Аспирируйте СМИ после 24 часов и заменить свежей средой. растут клетки примерно до 70 - 80% сплошности.

2. Подсчет и покрытие Клетки

  1. В водяной бане при 37 ° С, теплой DMEM и раствор 1x-трипсин-ЭДТА.
  2. Аспирируйте средств массовой информации из клеток и добавить 500 мкл трипсина. Инкубировать при 37 ° С в течение 2 - 5 мин.
  3. С помощью скребка удалить клетки из колбы и подвесить в 5 млиз DMEM. Проходят клетки через сетчатый фильтр 70 мкм в 50 мл пробирку три раза.
  4. Граф клеток с использованием гемоцитометра и семян 8000 клеток / лунку в черный окруженный стеной четкую нижнюю пластину в конечном объеме 200 мкл среды DMEM, дополненной 10% FBS и 1% PSN. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
  5. Удалите старую DMEM и заменить 200 мкл подогретого DMEM, дополненной 1% PSN сыворотки голодать микроглии. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.

3. Активирование микроглии

  1. В отдельные пробирки, разбавленные AgNPs (0,01, 0,05 или 0,1 мкг / мл) и транспортного средства / переключение в нейтральное положение (цитрат натрия, 0,04 мМ) в бессывороточной DMEM, дополненной 1% до ПСН конечных рабочих концентраций.
  2. Удалить 100 мкл среды из каждой лунки и заменить 100 мкл соответствующего соединения лечения.
  3. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.

4. Fiфильтрация кондиционированной среды

  1. Собирают 200 мкл среды супернатанта из каждой лунки и перенесите в фильтр (молекулярная масса отсечки 10 кДа) с коллекторной трубки (от 1,5 до 2 мл мощности).
  2. Центрифуга при 14000 х г при комнатной температуре в течение 15 мин.
  3. Откажитесь проточные (надосадочную с частицами) и поместите фильтр в обратном порядке в новую пробирку для сбора.
  4. Центрифуга при 1000 х г при комнатной температуре в течение 2 мин.
    Примечание: В результате фильтруется носитель (содержащий секретируемые цитокины) концентрируют в шесть раз.
  5. Доведите объем концентрата до 400 мкл свежей среды DMEM, дополненной 10% FBS и 1% PSN и хранить на льду.
    Примечание: Для того, чтобы гарантировать , остаточные AgNPs удаляются из отфильтрованных сред, генерируют концентрацию AgNP на основе характеристики пик при примерно 390 - 420 нм 10. Вкратце, готовят аликвоты нефильтрованного AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 и 0,2 мкг / мл, как описано в пункте 3.1) и фильтруютуправления транспортным средством (цитрат натрия, 0,04 мМ) в бессывороточной DMEM. Алиготе 50 мкл отфильтрованных образцов и стандартов в черную замурованы четкую нижнюю пластину. С помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность при 390 - 410 нм и сравнить показания к кривой концентрации AgNP. Если отфильтрованные образцы имеют одинаковое значение абсорбции в качестве образца управления транспортным средством, то можно предположить, остаточные AgNPs удаляются.
  6. Используйте половину отфильтрованных сред для определения секреции TNF-α следующие инструкции из коммерчески доступного набора.

5. гипоталамуса Техническое обслуживание Культура клеток

  1. Теплый DMEM, среда для культивирования клеток, дополненной 10% FBS и 1% PSN до 37 ° С.
  2. Получение замороженного запаса гипоталамо (mHypo-A1 / 2) клетки при прохождении 18 - 25, хранящиеся при температуре 80 ° C. Быстро разморозить клетки в 37 ° С на водяной бане.
  3. Аккуратно перенести клетки на 75 см 2 вентилируемой колбу , содержащую 10 мл среды для культивирования клеток.
  4. Выдержите колбу в 5% CO 2 при 37 ° С. Аспирируйте СМИ после 24 часов и заменить свежей средой. растут клетки, пока примерно на 70 - 80% сплошности.

6. Определение гипоталамуса Cell Токсичность

  1. Теплый раствор DMEM, и 1x-трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
  2. Аспирируйте средств массовой информации из гипоталамуса клеток и добавляют 500 мкл трипсина. Инкубировать при 37 ° С в течение 2 - 5 мин. Удалить клетки из колбы с помощью скребка, как описано выше, на стадии 2.
  3. Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины гипоталамических клеток в количестве 5000 клеток / лунку в черный окруженный стеной четкую нижнюю пластину в конечном объеме 200 мкл среды DMEM , дополненной 10% FBS и 1% PSN и инкубировать в течение ночи в 5% СО 2 при 37 ° C ,
  4. Удалить 100 мкл старых носителей с помощью многоканального пипеттором и добавляют 100 мкл отфильтрованных сконцентрированных кондиционированной среды до конечной концентрации 1х.
  5. Инкубируйте пластины в 5% СО 2 при 37 ° С в течение 24 ч.
  6. Добавить 221; л реагента резазурин и инкубировать пластины в течение 20 мин в 5% СО 2 при 37 ° С.
  7. С помощью многомодового спектрофотометр, запись флуоресценции (560 нм EX / 590 нм EM) для измерения жизнеспособности клеток. Отчет результаты в виде относительных единицах флуоресценции (РФС).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покажем, что функция микроглии в качестве суррогатного биосенсора для ответа мозга на наночастицах с использованием протокола выше. Наши результаты включают в себя измерение токсических эффектов активации микроглии на выходе гибели нейронов. Рисунок 1 демонстрирует последовательность действий протокола для активации микроглии и определить , является ли секретируемые цитокины уменьшают жизнеспособность нейронов гипоталамуса. Секреции TNF-α была значительно увеличена следу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние исследования подтверждают, что воздействие окружающей среды способствует ожирению и другим нейродегенеративным заболеваниям 11,12. Тем не менее, методы, использованные в предыдущих исследованиях, отнимают много времени и денег. Экономические соображения, физиологически значимые системы доставки, этические проблемы при широком использовании животных моделей in vivo и трудности с переводом полученных результатов в значимые рекомендации по здоровью – вот некоторые из основных проблем, которые пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет никаких противоречий для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Министерством по делам ветеранов США BLR&D IK2 BX001686 (для TAB) и грантами от Университета Миннесоты Healthy Foods, Института здоровой жизни (для CMD, JPN и TAB) и Фонда медицинских исследований и образования ветеранов Миннесоты (для TAB). Мы благодарим докторов Филиппа Марамбо (Институт медицинских исследований Файнштейна, Манхассет, штат Нью-Йорк) и Вэйхуа Чжао (Методистская больница, Хьюстон, штат Техас) за предоставление клеточной линии BV2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cells/Reagents
Mouse microglial Cell Line (BV2)Interlab Cell Line Collection (Генуя, Италия)ATL03001
Взрослая мышиная клеточная линия гипоталамуса mHypoA-1/2 Cellutions Biosystems Inc.CLU172
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s MediumInvitrogen10313-039
Фетальная бычья сыворотка PAA LabsA15-751
Пенициллин/Стрептомицин/НеомицинThermo Fisher Scientific15640-055
Трипсин-ЭДТАThermo Fisher Scientific25200056
Наночастицы серебра (20 нм)Sigma-Aldrich730793

PrestoBlue Реагент жизнеспособности клеток		InvitrogenA13262
Мышиный TNF- α ELISA Max DeluxBiolegend430904
липополисахаридSigma-AldrichL4391
цитрат натрияSigma-AldrichS4641
НазваниеCompanyНомер в каталогеComments
>Equipment
96 Вт Оптическая нижняя пластина, черный полистирол, обработанный клеточными культурами, с крышкой, стерильнаяThermo Fisher Scientific
Amicon Ultra-0.5 с мембраной Ultracel-10EMD MilliporeUFC501008
многорежимная микропластина SpectraMax M5 Многорежимные микропланшетыМолекулярные устройстваM5
Falcon 50 мл Коническая центрифуга ТрубкиCorning, Inc
14-432-22
Falcon Cell Sits 70 μ mCorning, Inc08-771-2
Настольная центрифуга 5430Eppendorf22620560
центробежная фильтрующая установка 165305

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
  2. Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
  3. Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49(2014).
  4. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
  5. Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
  6. Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
  7. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  8. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
  9. Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
  10. Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
  11. Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
  12. Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105(2011).
  13. Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
  14. Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
  15. Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
  16. Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
  17. Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
  18. Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
  19. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
  20. Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
  21. Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
  22. Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
  23. Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
  24. Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
  25. PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
  26. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  27. McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
  28. Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
  29. Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
  30. Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BV2

Похожие статьи