Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы для работы с изображениями прометафазе и метафазе мейоза I в фиксированных

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54666

⸱

31 октября 2016 г.

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протоколы сбора, подготовки и визуализации зрелых ооцитов дрозофилы. Эти методы позволяют визуализировать поведение хромосом, сборку и функционирование веретена во время мейоза.

Аннотация

Сегрегация хромосом в ооцитах человека подвержена ошибкам, приводящим к анеуплоидии, которая является основной генетической причиной выкидышей и врожденных дефектов. Изучение поведения хромосом в ооцитах модельных организмов имеет большие перспективы для раскрытия молекулярной основы восприимчивости ооцитов человека к анеуплоидии. Drosophila melanogaster поддается генетическим манипуляциям, благодаря более чем 100-летнему опыту исследований, сообщества и разработки технологий. Однако визуализация поведения хромосом и сборки веретена в ооцитах дрозофилы сопряжена с особыми трудностями, в первую очередь из-за наличия мембран, окружающих ооцит, которые непроницаемы для антител. Мы описываем здесь протоколы сбора, подготовки и визуализации сборки веретена мейоза I и поведения хромосом в ооцитах дрозофилы, которые позволяют проводить молекулярное препарирование сегрегации хромосом в этом важном модельном организме.

Введение

Изучение мейоза иногда описывается как "генетика генетики". Это связано с тем, что фундаментальные свойства наследования хромосом и независимого ассортимента осуществляются за счет сегрегации хромосом при производстве гамет. Важной демонстрацией хромосомной теории наследования стала работа Кальвина Бриджеса в 1916 году в Drosophila melanogaster1. Это и другие классические генетические исследования дрозофил внесли большой вклад в наше понимание генетики. Цитологическое исследование мейотических хромосом в ооцитах дрозофилы, однако, было сложной задачей. В первую очередь это связано с тем, что иммунофлуоресценция ооцитов дрозофилы на поздних стадиях, когда веретено собирается и хромосомы ориентированы на сегрегацию, затруднена наличием мембран, которые делают ооцит непроницаемым для антител.

Несмотря на эту проблему, ооциты дрозофилы остаются привлекательной моделью для изучения поведения хромосом и сборки веретена. Это происходит из-за мощных генетических инструментов, доступных дрозофилам, а также потому, что ооциты останавливаются в метафазе I, когда хромосомы ориентированы и веретено полностью сформировано. Это облегчает сбор и исследование большого количества ооцитов на этом важном этапе деления клеток. Кроме того, простой модельный организм, который поддается генетическим манипуляциям для изучения сегрегации хромосом ооцитов, может внести важный вклад в наше понимание репродуктивного здоровья человека. Ошибки в количестве хромосом являются основной генетической причиной выкидышей и врожденных дефектов у человека2. Большинство этих ошибок можно проследить до яйцеклетки и они коррелируют с увеличением возраста матери. Средний возраст матерей в США увеличивается, что делает эту проблему серьезной проблемой общественного здравоохранения.

Мы описываем здесь методы цитологического исследования ооцитов дрозофилы, включая демонстрацию того, как удалить мембраны ооцитов. Эти методы являются модификациями протоколов, впервые описанных Theurkauf and Hawley3, Zou et al.4, и Dernburg et al.5. Мы также включаем методы обогащения различных стадий ооцитов, основанные на протоколе, впервые описанном Gilliland et al.6. Наконец, добавляем инструкцию по медикаментозному лечению ооцитов дрозофилы. Вместе эти методы позволяют проводить цитологическое исследование сегрегации хромосом ооцитов и сборки веретена у дрозофил.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Процедуры выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Терморегулируемая инкубаторы используются для поддержания температуры для мух разведению и крестов, если не указано иное.

1. Подготовка

  1. Подготовить Мухи.
    1. Прометафазе обогащенные коллекции ооцитов.
      1. Очистить взрослых мух от здоровых, молодых фондовых или кросс-культур. Возраст бутылки в течение двух дней при 25 ° C.
        Примечание: Как правило, два здоровых бутылки будет достаточно, хотя и более могут быть необходимы для некоторых перекрестных культур.
      2. Через два дня, собирать ~ 100 до 300 самок (которые составляют от 0 до 2 дней в этой точке) из бутылки. Женщины не должны быть девственницами. Добавить мазок дрожжевой пасты на стороне флакона и помещают 30 женщин и от 10 до 15 самцов, каждый в дрожжевого флаконах. Возраст флаконах в течение двух дней при 25 ° C.
    2. Метафаза обогащенный ооцита Коллекции.
      1. Соберите 100 ~ до 300 самок на складе или кросс КУЛЬТУРАэс. Добавить мазок дрожжевой пасты на стороне флакона и поместить 30 женщин каждый (без добавленных самцов) в дрожжевого флаконах. Возраст флаконах в течение трех-пяти дней, при 25 ° C.
  2. Подготовка решения.
    Примечание: Растворы можно хранить неопределенно долго при комнатной температуре, если не указано иное.
    1. Готовят модифицированным буфером Робб (5x): 500 мМ HEPES, 500 мМ сахарозы, 275 мМ ацетат натрия, 200 мМ ацетата калия, 50 мМ глюкозы, 6 мМ хлорида магния и 5 мМ хлорида кальция. Используйте 10 Н 11: 8: гидроксид натрия гидроксид калия, чтобы довести рН до 7,4. Стерилизовать фильтрацией; не автоклав. Хранить при -20 ° C. Оттепель по мере необходимости для подготовки ~ 200 мл на ооцит преп 1x Робб.
    2. Фиксирующие решения.
      1. Вариант № 1: Подготовьте формальдегид / гептан фиксации. Готовят Fixation буфер: 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) плюс 150 мМ сахарозы. Чтобы использовать, сделайте свежий с 687,5 мкл Фиксирование буфера и 312,5 мкл 16% формальдегидана ооцит преп.
        ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при использовании растворов формальдегида в вытяжном шкафу. Утилизация отходов в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
      2. Вариант № 2: Подготовить формальдегид / какодилате фиксации. Подготовка Фикс смеси: 250 мМ сахарозы, 100 мМ ацетата калия (рН 7,5), 25 мМ ацетата натрия (рН 7,0), и 25 мМ EGTA (рН 8,0). Для того, чтобы использовать, чтобы свежие 400 мкл Fix Mix, 100 мкл какодилат калия (1 М, рН 7,2), и 500 мкл 16% формальдегида на ооцит преп.
        ВНИМАНИЕ: Калий какодилат содержит мышьяк.
    3. Готовят PBS / Triton X-100: 1X PBS плюс 1% или 0,05% Triton X-100. Хранить при температуре 4 ° С.
    4. Готовят PBS-Tween 20-бычьего сывороточного альбумина (БСА) (PTB): 1x PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (вес / объем) и 0,1% Tween-20. Можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели.
    5. Флуоресценцию в гибридизация (FISH) Solutions.
      1. Приготовьте хлорид натрия-20X цитрата натрия (SSC): 3 М хлорида натрия и 0,3 М цитрат натрия.
      2. Приготовьте 2 x SSC-твин-20 (ЦФСС): 2 x SSC плюс 0,1% твин-20. Сделайте свежие, 20 мл ~ на ооцит преп.
      3. Подготовка формамида решения: 2x SSC, 0,1% Tween-20, плюс формамида. Сделать свежий, 1 мл 20% формамид, 0,5 мл 40% формамида, и 2 мл 50% формамида на ооцит преп.
        ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при использовании формамида решений в вытяжном шкафу. Утилизация отходов в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
      4. Подготовка раствора гибридизации: 2х SSC, 50% формамиде и 10% сульфата декстрана (вес / объем). Хранить при температуре 4 ° С.
    6. FISH зондами.
      1. Заказать олигонуклеотиды (см таблицу 1 для последовательностей) с очисткой ВЭЖХ и желательно 5 'флуоресцентный модификации (например, Cy3 или Cy5). Ресуспендируют в Трис-ЭДТА (ТЭ) при 50 нг / мкл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Защита от олиго воздействия света во все времена.

2. Сбор поздних стадий дрозофилы ооцитов

  1. В виде Drosophila ооциты с мембранами интактных будет придерживаться пластика и стекла, предварительно смажьте внутри одного 5 мл трубки и один Пастера пипеткой на ооцит преп с ПТБ.
  2. Обезболить все 100 ~ 300 до дрожжевого мух с диоксидом углерода и добавляют в смеситель, содержащий ~ 100 мл 1x буфер Робб. Импульсные три раза (~ 1 сек каждый). Держите ооциты в Робб для <20 мин, чтобы избежать активации.
    Примечание: В качестве альтернативы ооциты могут быть вручную рассекали от самок. Преимущество этого способа состоит в том, что она требует меньше самок. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность , чтобы ограничить воздействие углекислого газа лишь несколько минут , чтобы избежать артефактов , связанных с гипоксией 7.
  3. Фильтр через большие сетки (~ 1500 мкм) в 250 мл мензурку для удаления больших частей тела. Если многие неповрежденные животы остаются на сетки, повторно молотилки материала с использованием дополнительного буфера Робб и фильтр снова. Пусть оседать ~ 2 мин, затем Аспирируйте от верхнего слоя, удаляя как многие из больших частей тела, как это возможно.
  4. Fiчерез фильтр малой сетки (~ 300 мкм) в химический стакан емкостью 250 мл. Промойте оставшиеся ооциты выхода из первого мензурку с использованием дополнительных Робб и покрытую Пастера пипетку. Пусть оседают ~ 3 мин; ооциты будут оседать. Аспирируйте от всех, но ~ 10 мл.
  5. Налейте столько, сколько из 10 мл, как будет вписываться с покрытием 5 мл трубки. Пусть отстояться, удалить жидкость и повторите с остатком. Промыть оставшиеся ооцитов из мензурку с использованием дополнительного Пастера пипетку Робб и с покрытием. Пусть осесть в 5 мл пробирке в течение ~ 3-5 мин.

3. медикаментозное лечение (необязательно)

  1. Покройте второй 5 мл трубка с PTB для каждого ооцита преп. Добавить соответствующий растворитель (контроль) или лекарственное средство по 1 мл Робб каждый для каждого ооцита преп (таблица 2).
  2. Split ооциты во вторую покрытую 5 мл трубки. Пусть отстояться, удалить жидкость, и добавьте 1 мл Робб плюс растворителя в одну пробирку и 1 мл Робб плюс препарат во вторую пробирку. Качаться на соответствующее количество времени для лекарственной терапии (таблица 2). Lи др осесть.

4. Закрепление

  1. Аспирируйте от всей жидкости и сразу же добавить 1 мл Fix.
  2. Вариант № 1: Формальдегид / гептан крепление (Фиксирование буфера плюс 5% формальдегида).
    1. Закрепить в течение 2,5 мин на nutator. Добавить 1 мл гептана и вихревую 1 мин. Пусть оседать ~ 1 мин.
    2. Удалите всю жидкость, а затем добавляют 1 мл 1x PBS. Vortex 30 сек. Пусть оседать ~ 1 мин.
    3. Удалите всю жидкость, а затем заполнить трубку с 1x PBS.
      Примечание: ооциты могут быть использованы непосредственно или храниться на nutator в течение нескольких часов при комнатной температуре.
  3. Вариант № 2: Формальдегид / какодилат крепление (Fix Mix плюс 8% формальдегида и 100 мМ какодилат).
    1. Закрепить в течение 6 минут на nutator. Пусть оседать 2 мин. Удалите жидкость, а затем заполнить трубку с 1x PBS.
      Примечание: ооциты могут быть использованы непосредственно или храниться на nutator в течение нескольких часов при комнатной температуре.

5. Удаление Мембраны ( "Роллинг")

  1. Использование покрытого Пастера пипетку, добавьте ~ 500 до 1000 ооцитов к матовым (пескоструйная обработка) части предметного стекла. Удалите все части тела и посторонний материал, с помощью пинцета. Не позволяйте ооциты высохнуть; добавить 1X PBS в случае необходимости.
  2. Поместите покровное на вершине ооцитов и мягко "Ролл" ооцитов, пока все мембраны удаляются (перетягиванием края покровного через ооцитов работает лучше всего.) Периодически проверяйте прогресс под микроскопом, добавляя больше 1X PBS по мере необходимости. Будьте осторожны, как слишком большое давление разрушит ооциты.
    Примечание: Только для иммунофлюоресценции, перейдите к шагу 6. ​​Для рыбы (с иммунофлуоресценции или без него), перейдите к шагу 7.

6. Антитело Окрашивание Drosophila ооцитов

  1. Добыча и блокировка
    1. Полоскание свернутые ооцитов в 15 мл коническую пробирку, содержащую ~ 15 мл PBS / 1% Тритон Х-100. Качаться ооциты в этом растворе в течение не менее 1,5 ч и не более 2 часов.Этот шаг позволяет проникновение антител.
    2. Пусть ооциты оседать ~ 2 мин. Удалить жидкость вместе с таким количеством мембран, как это возможно, а затем добавить PBS / 0,05% Triton X-100.
      Примечание: Мембраны будет располагаться медленнее, чем рулонных ооцитов.
    3. Пусть ооциты оседать ~ 2 мин, а затем удалить все, кроме ~ 1 мл жидкости. Передача ооциты закончил 1,5 мл трубку и удалить оставшуюся жидкость. Добавляют 1 мл РТВ для блокирования и качаться в течение 1 часа.
  2. Антитело Окрашивание
    1. Предварительное поглощение вторичных антител против эмбрионов.
      Примечание: Этот шаг устраняет фоновое окрашивание от неспецифических взаимодействий антител с Drosophila белков.
      1. Собрать и закрепить Drosophila эмбрионов (~ 25 мкл) за типичной процедуре 8. Хранить в метаноле при температуре от -20 & deg; С.
      2. Удаления метанола из эмбрионов, добавляют 800 мкл метанола плюс 200 мкл 1X PBS, и качаться в течение 15 мин. Удалить 500 мкл супернатанта и заменить 500 мкл 1x PBS, Затем качаться в течение 15 мин. Повторите два раза (в общей сложности ~ 1 час стирок), а затем закончить в РТВ.
        Примечание: Эмбрионы могут быть использованы непосредственно или храниться на nutator в течение нескольких часов при комнатной температуре.
      3. Удалите жидкость, залить РТВ 200 мкл на ооцитов стадии подготовки, а также добавить флуоресцентно-меченых вторичных антител в соответствующих разведений (имея в виду, что окончательный объем будет 300 мкл, см. Шаг 7.4) качаться при 4 ° С в течение ночи (предпочтительно) или при комнатной температуре в течение от 3 до 4 часов.
        Примечание: предварительно абсорбируют антитела будут использованы на этапе 6.2.4.
        Примечание: Хранить образцы в темноте, насколько это возможно, как только флуоресцентные антитела были добавлены.
    2. Удалите жидкость из ооцитов, залить РТВ до 300 мкл, и добавить первичные антитела в соответствующих разведений. Качаться при 4 ° С в течение ночи (предпочтительно) или при комнатной температуре в течение от 3 до 4 часов.
    3. Мытье ооцитов четыре раза в течение 15 мин каждый раз с 1 мл РТВ.
    4. Удалитьжидкость из ооцитов, добавьте 200 мкл супернатанта из эмбрионов (предварительно абсорбируют вторичными антителами). Затем залить РТВ до 300 мкл. Качаться при комнатной температуре в течение от 3 до 4 ч (предпочтительно) или при 4 ° С в течение ночи.
    5. Вымойте ооциты один раз в течение 15 мин с 1 мл РТВ, удалить жидкость. Затем добавьте 0,5 мкл Hoechst 33342 и 500 мкл РТВ и качаться в течение 7 мин.
    6. Вымойте ооциты дважды в течение 15 мин каждый раз с 1 мл РТВ.
      Примечание: ооциты могут быть смонтированы на салазках непосредственно или могут быть сохранены в РТВ при 4 ° С до готовности для работы с изображениями.

7. FISH (Продолжайте с шага 5 выше)

  1. Полоскание свернутые ооцитов в 15 мл коническую пробирку, содержащую ~ 15 мл 2x SSCT. Пусть ооциты оседать ~ 2 мин. Удалить все, но ~ 0,5 мл жидкости наряду с таким количеством мембран, как это возможно.
    Примечание: Мембраны будет располагаться медленнее, чем рулонных ооцитов.
  2. Передача ооцитов до 0,5 мл трубки и удалить оставшуюся жидкость. Последовательно добавлять и удалять 500 мкл20%, 40%, и 50% растворы формамид, нутационное в течение 10 мин в каждом растворе.
    Примечание: ооциты будет располагаться медленнее с более высоким процентным содержанием формамида.
  3. Удалить жидкость, затем добавляют 500 мкл 50% -ного раствора формамида и качаться при 37 ° С в течение от 1 до 5 часов.
    Примечание: Более инкубирование приводит к лучшему проникновению зонда.
  4. Удалить жидкость, оставив после не более чем ~ 100 мкл ооцитах, и добавить 36 мкл раствора гибридизации плюс 2 мкл зонда (50 нг / мкл) и 2 мкл воды или 2 мкл 2 - й пробы (таблица 1).
  5. Инкубировать при 91 ° С в течение 3 мин (только рыба) или 80 ° С в течение 20 мин (FISH плюс иммунофлюоресценции), с последующей инкубацией в водяной бане C 37 ° в течение ночи.
    Примечание: Эти шаги могут быть выполнены в амплификатор.
  6. Не удаляйте жидкость. Добавить 500 мкл 50% -ного раствора формамида, и качаться при 37 ° С в течение 1 часа.
  7. Пусть отстояться, удалить жидкость, добавить 500 мкл 50% -ного раствора формамида, А.Н.d качаться при 37 ° С в течение 1 часа.
  8. Пусть оседать, удалить жидкость, добавьте 500 мкл 20% -ного раствора формамида и качаться при комнатной температуре в течение 10 мин.
  9. Выполните три быстрых промывок в 500 мкл 2х ЦФСС (пусть отстояться, удалите затем добавить жидкость, инвертировать несколько раз, повторите.) Пусть отстояться, удалить жидкость, затем добавьте 500 мкл РТВ и качаться в течение 4 часов.

8. Антитело Окрашивание после FISH

  1. Удалите жидкость из ооцитов, залить РТВ до 300 мкл, и добавляют 10 мкл анти-альфа-тубулина антитела, конъюгированного с FITC. В качестве альтернативы, другие антитела могут быть использованы, следующие выше протокола. Качаться при комнатной температуре в течение ночи.
  2. Промыть ооцитах один раз в течение 15 мин с 500 мкл РТВ, удалить жидкость, затем добавляют 0,5 мкл Hoechst 33342 и 500 мкл РТВ и качаться в течение 7 мин.
  3. Вымойте ооциты дважды в течение 15 минут каждый с 500 мкл РТВ.
    Примечание: ооциты могут быть смонтированы на салазках непосредственно или могут быть сохранены в РТВ при температуре 4 ° С до готовности кизображений. Хранить ооцитов в темноте как можно больше раз флуоресцентные антитела были добавлены.
Повторить Имя хромосома Последовательность Oligo *
359 Икс GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
додека- 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1,686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 Последовательность от Eric Joyce, личного общения, другие последовательности из Sullivan и др. 8

Таблица 1: FISH зонды для дрозофилы центромерных повторами.

лекарственный растворитель концентрация Фото Конечная концентрация Время лечения эффект
колхицин спирт этиловый 125 мМ 150 мкМ 10 мин или 30 мин дестабилизировать не-кинетохор (10 мин) 9 или все (30 мин) микротрубочки
паклитаксел ДМСО 10 мМ 10 мкМ 10 минут стабилизировать микрофонrotubules
Binucleine 2 ДМСО 25 мМ 25 мкМ 20 мин ингибирования Aurora B киназы 10

Таблица 2: Медикаментозное лечение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Методы , которые мы описали здесь приведет к сбору поздних стадий дрозофилы ооцитов , представляющих три стадии мейоза (рис 1). Яйцеклетки в профазе отличаются наличием ядерной оболочки, который виден отсутствием сигнала тубулина в области , окружающей кариозома (Фигура 1А). Прометафазе это период после распада ядерной оболочки, в течение которого компонует шпинделя. Во время прометафазе, то кариозома принимает характерную форму, становясь часто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поэтапное Drosophila ооцитов

Хотя удлиненный кариозома часто рассматривается в прометафазных ооцитов, используя кариозома форму, чтобы отличить прометафазы от метафазных ооцитов может быть проблематичным. Во время прометафазе, то кариозома начинается как круглой формы, удлиняется, а затем втягивается в круглую форму, как яйцеклетка приближается к метафазного ареста. Это означает, что многие прометафазе ооциты не имеют вытянутую кариозома. Кроме того, если рассматрив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Кристиана Ленера за предоставление антитела CENP-C и Эрика Джойса за рекомендации по FISH. Работа в лаборатории МакКима финансировалась за счет гранта NIH (GM101955).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл конические тубыРазличный
16% формальдегидTed Pella, Inc.18505ОПАСНЫЙ; после вскрытия выбросьте через месяц
250 мл стаканыРазличные
тюбики по 5 млРазличные
активные сухие дрожжиРазличноесмешать с водой для получения пасты консистенции арахисового масла
анти-&альфа;-тубулиновые антитела, конъюгированные с клоном FITCSigmaF2168DM1A
Binucleine 2SigmaB1186ОПАСНЫЙ
блендерРазличный
бычий сывороточный альбуминSigmaA4161
хлорид кальцияРазличный
колхицинSigmaC-9754ОПАСНЫЙ
покровный листVWR48366-227No1 1/2
декстранасульфат Различный
ДМСОРазличные
EGTAРазличные
этанолыРазличные
щипцыTed Pella, Inc.5622Пинцет Dumont высокоточный класс стиля 5
формамидSigma47670-250ML-F
стеклянные слайдыVWR48312-003
глюкозаРазличные
градуированные 1,5 мл пробиркиразличные
HEPESVWREM-5330доступны у нескольких продавцов
Hoechst 33342Различные
хлориды магнияРазличные
метанолыРазличные
крупные ячейки (~1,500 &; m)VWRAA43657-NKразличных форматов и других поставщиков, 12 или 14 меш
с малой ячейкой (~300 & микро; m)Spectrum labs146 424различные форматы, например, 146 422 или 146 486
nutator Различные
дозаторы ПастераРазличные
ацетат калияРазличные
какодиловые кислотыSigmaC0125ОПАСНЫЕ; в качестве альтернативы какодилат натрия может быть заменен
калием гидроксидРазличный
ацетат натрияРазличный
хлорид натрияРазличный
цитрат натрияРазличный
гидроксид натрияРазличный
сахарозуРазличный
таксол (паклитаксел)SigmaT1912ОПАСНЫЙ
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
vortexРазное

Ссылки

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сборка веретена деленияповедение хромосомудаление мембраниммунофлуоресценцияконфокальная микроскопияпроникновение антителфиксация ооцитованализ кариосомы
Методы для работы с изображениями прометафазе и метафазе мейоза I в фиксированных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.