Исследования нейронов формообразования с использованием дрозофилы личиночной разветвление дендритов (DA) нейроны выгоду от визуализации на месте нейрональных и эпидермальных белков в иммунофлюоресценции. Мы опишем процедуру, которая улучшает иммунофлуоресцентного анализ нейронов да и окружающих клеток эпидермиса путем удаления мышечной ткани от личиночной стенки тела.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны являются популярной моделью для исследования механизмов морфогенеза нейронов. Da нейроны развиваются в связи с эпидермальных клеток , которые они возбуждают и , следовательно , их анализ выгод от in - situ визуализации обоих neuronally и epidermally выраженных белков с помощью иммунофлюоресценции. Традиционные способы приготовления личиночной филе для иммунофлюоресценции экспериментов оставить нетронутыми мышечной ткани, которая покрывает большую часть стенки тела, представляя несколько проблем для визуализации нейронов и эпидермальные белки. Здесь мы опишем метод удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол позволяет визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает отношение сигнал-шум и облегчает использование сверхвысокого разрешения микроскопии для изучения развития да нейрон.
Введение
Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны обеспечивают ценную модель для изучения развития нейронов из - за их аменабельности генетической манипуляции и легкость , с которой они могут быть изображаемого. Эти сенсорные нейроны играют важную роль в выявлении многочисленных путей , которые контролируют дендритов морфогенеза 1-3.
Четыре класса нейронов да (класс I - IV) иннервируют личиночной эпидермис. Эти нейроны лежат между базальной мембраной и эпидермиса, с их дендриты образуя в основном двумерные массивы 4,5. Из четырех классов, класс IV - да нейроны имеют наиболее сильно разветвленные беседок и, как сенсорные нейроны других животных, разработка этих беседок требует внутренних факторов, а также сигналы от соседних тканей, в частности , эпидермис, для их развития 6-9 ,
Исследования с целью определения того, как такое нейронные и экстра-нейронную фактПРС управления дендритов преимущество морфогенез от способности обнаружить экспрессию белка на месте с помощью иммунофлуоресценции. Наружная кожица личинки непроницаема для антител, но это препятствие легко преодолевается подготовки личиночной филе с помощью хорошо известных методов рассечение 10,11. Тем не менее, стенки тела мышечной ткани, которая лежит только интерьер к базальной мембране представляет несколько проблем по отношению к визуализации нейронов да и эпидермальных клеток. Во-первых, мышечной ткани, что линии большинство стенки тела, сильно затемняет флуоресцентные сигналы, исходящие от нервных клеток или эпидермальной ткани. Это в значительной степени уменьшает отношение сигнала к шуму в образце. Во-вторых, многие соответствующие белки могут быть выражены в мышечной ткани, а также в нейронах или эпидермиса. Эта мышца полученный сигнал флуоресценции, вероятно, еще неясного обнаружения сигнала флуоресценции от нейроном или эпидермиса. И, наконец, достижения в области микроскопии технологий нетж разрешение изображения образцов при разрешении суб-дифракционного и может быть особенно полезно в плане определения локализации белков, которые экспрессируются в нейронах и окружающих клеток эпидермиса 12,13. Тем не менее, визуализация с помощью супер-разрешения преимуществ микроскопии от сильного сигнала к шуму и непосредственной близости от образца к покровным. В дополнение к уменьшению сигнала к шуму, личиночные стенки тела мышечные расстояния да нейронов от покровного, ограничивая тем самым улучшенное разрешение изображения, которое может быть достигнуто с помощью методов микроскопии сверхвысокого разрешения. Кроме проблем для иммунофлуоресцентного анализа, мышечной ткани представляет собой барьер для электрофизиологические записи от сенсорных нейронов в личиночной стенки тела. Поэтому его удаление преимущества нейрофизиологическую манипуляции сенсорных нейронов 14.
Вот способ ручного удаления дрозофилы личиночной мышечной ткани описана. Показано, что наш протокол рermits иммунофлюоресценции визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает соотношение сигнал-шум для визуализации IV класса нейронов да, и дает возможность использовать сверхвысокого разрешения микроскопии, чтобы лучше различать пространственные соотношения белков и клеточных структур в нейронов да и эпидермис.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Процедура удаления мышц (рисунок 1) представляет собой модификацию ранее описанных способов получения личиночных галтелей. Шаги , которые предшествуют и следуют за удаление мышц изложены кратко и читатель отсылается к предыдущей работе 10, 11 для более подробного описания.
1. Рассеките Личинка в холодной солевой раствор
- Подготовить рабочее разведение холодного HL3.1 солевого раствора 15 или холодного Ca 2+ -бесплатно HL3.1 солевой раствор 11 (таблица 1). Поместите личинку в силиконового эластомера блюдо только с достаточным количеством холодного физиологического раствора, чтобы покрыть дно тарелки.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Обсуждение относительно выбора физиологического раствора.
| 1x HL3.1 физиологический раствор (рН 7,2) |
| 5 мМ HEPES |
| 70 мМ NaCl |
| 5 мМ KCl, |
| 1,5 мМ CaCl 2 (опустим для Ca 2+ -бесплатно физиологический раствор) |
| 4 мМ MgCl 2 |
| 10 мМ NaHCO 3 |
| 5 мМ трегалоза |
| 115 мМ сахарозы |
| Фильтр стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C |
| Примечание: Состав имитируют насекомых гемолимфы |
Таблица 1. Состав холодной солевой раствор.
- Поместите личинку с вентральной стороной вверх. Вентральной личинки могут быть идентифицированы с помощью брюшных dentical поясов и спинной стороне первичным личиночных трахей трубок, идущих от передней к задней. Stretch личинку в передне-заднем направлении и пин-код голова и хвост ксиликонового эластомера рассекает блюдо с использованием насекомых булавками. Используйте тонкие анатомические ножницы, чтобы разрезать вдоль вентральной средней линии, начиная с одного конца и продвигается по направлению к другому.
Примечание: Эта ориентация сохраняет широко изученный спинным скопление нейронов да. - После того, как личинка разрезают, придавить четыре угла к рассекает блюдо, как будто открывая книгу. Используйте пинцет, чтобы захватить и удалить внутренние органы, включая ЦНС, кишечника и трахеи. Отрегулируйте насекомых булавками так, чтобы филе тугой, но не максимально растянуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы прикреплены к стенке тела на сегментных границах. Хотя мышцы покрывают большую часть стенки тела, они отсутствуют в узкой области вблизи средней линии спины.
2. Мышцы Удаление
- Найдите средней линии спины личинки, где мышечная ткань отсутствует. Поместите единственный щипцов штырек таким образом, что он может быть вставлен под мышечной ткани в плоской возможной ориентации.
- Начинается ссредней линии спины, вблизи передней границы сегмента, аккуратно вставьте щипцами зубец между мышцами и эпидермисом, следя за тем, чтобы свести к минимуму контакт между щипцами и эпидермиса.
- Потяните вверх щипцами, чтобы сломать крепление мышцы к стенке тела в одной точке крепления. Повторите этот процесс для оставшихся геми-сегмента (ов), представляющие интерес.
Примечание: Этот протокол оптимизирует сохранение задней части каждого поля дендритов да нейрон. Чтобы сохранить переднюю часть дендритов поля, то лучше вставить щипцов зубец на заднем конце каждого сегмента. - Заново отрегулировать насекомых булавками таким образом, что личиночной филе максимально растянуто во всех направлениях.
- Закрепить филе в то время как он все еще прижат к рассекает блюдо с использованием холодного, свежеприготовленный 4% формальдегида в PBS в течение 25 мин.
- Промыть 5 раз в PBS.
- Используйте пинцет, чтобы осторожно отодвинуться мышечную ткань из оставшихся точек привязки, следя за тем, чтобы свести к минимуму ContàКТ с эпидермисом.
- Открепить и снять филе с рассекает блюдо до 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Выполните все последующие мойки, блокирование, и шаги иммунофлюоресценции окрашивания, как описано выше 11.
3. Установить личиночной филе
- Сначала удалите голову и хвост, используя тонкие анатомические ножницы для того, чтобы сделать выборку как можно более плоскими. Установите филе на покровное в antifade mountant с внутренней поверхностью филе, обращенной к покровным.
- Поместите стекло микроскопа на покровное и нажмите осторожно, чтобы разогнать монтажную среду. Флип стекло микроскопа снова и запечатать покровное на слайде с помощью лака для ногтей. Слайды можно хранить при -20 ° С в течение по крайней мере, одного месяца.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Показана полезность процедуры удаления мышц для улучшения сигнала к шуму в иммунофлюоресценции экспериментов совместно визуализировать перегородками клеммные белки челнок (Cora) и диски-большой (DLG) совместно с IV класса нейронов да меченых с мембранным маркером CD4- tdTomato.
Кора ранее использовался для идентификации трактов где - да нейрон дендриты окружены клетками эпидермиса и является одним из многих факторов , определенных эпидермальных , которые были...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь протокол описан для ручного удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол модифицирует ранее описанных методов личиночной рассечение 10,11. После того, как личинка рассекают в силиконового эластомера блюдо, средней линии спины расположен. Один пинцет зубец, в своей плоской возможной ориентации, аккуратно вставляется между мышечной тканью и эпидермисом, вблизи средней линии спины. Пинцет осторожно тянут вверх, чтобы отделить мышечной ткани от одной опорной точки в каждом ли...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Гари Лаевский за полезные дискуссии по микроскопии. Эта работа финансировалась NIH предоставляет R01GM061107 и R01GM067758 с ERG
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пинцет Dumont #5 | Электронная микроскопия Sciences | 72701-D | |
| Микроножницы, 8 см, прямые, лезвия 5 мм, наконечники 0,1 мм | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 набор силиконовых эластомеров | Dow Corning | 3097358-1004 | для препарирования пластин |
| Аустерлиц булавки от насекомых, 0,1 мм | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Источник света Fostec 8375 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Микроскопия | ||
| Vectashield антивыцветающая монтажная среда | Vector Laboratories | H-1000 | для конфокальной микроскопии |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | для микроскопии структурированного освещения |
| , микрозащитное стекло, 22 x 22 мм, No 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Предметные стекла для микроскопа Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 мм | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Мышиный анти-Коракл антитела | Исследования развития Hybridoma Bank | C615.16 | надосадочная жидкость, разбавлять 1:50 |
| Мышиные анти-диски большие | антитела Исследования развития Hybridoma Bank | 4F3 | надосадочная жидкость, разбавлять 1:50 |
| Кролик анти-dsКрасное антитело | Clontech | 632496 | разбавлять 1:1,000 |
| Антитело против кролика у козы, Alexa Fluor 568 конъюгированное | ThermoFisher Scientific | A-11011 | разбавлять 1:1,000 |
| Антитело против мыши у козы, Alexa Fluor 488 конъюгированное | ThermoFisher Scientific | A-11001 | разбавлять 1:500 |
Ссылки
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111(2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
