Методическая статья

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем настройки для параллельного мониторинга циркадной биолюминесценции и секреторной активности островковых клеток человека и первичных миотрубок. Для этого мы использовали лентивирусную доставку гена репортера ядра люциферазы с последующей синхронизацией in vitro и сбором исходящей среды путем непрерывного перифузии клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Суточный часы функционируют во всех светочувствительных организмов, что обеспечивает адаптацию к внешнему миру, предвосхищая ежедневные изменения окружающей среды. Значительный прогресс в понимании тесной связи между циркадных часов и большинство аспектов физиологии было сделано в области за последнее десятилетие. Тем не менее, распутывая молекулярную основу, лежащую в основе функции циркадного осциллятора в организме человека остается высшей технической задачей. Здесь мы приводим подробное описание экспериментального подхода для долгосрочного (2-5 дней) записи биолюминесценции и сбора Отток среды в культивируемых первичных клеток человека. С этой целью мы трансдуцированных первичных клеток с лентивирусов люциферазы, который находится под контролем промотора гена тактовой, что позволяет параллельной оценки секреции гормонов и циркадного биолюминесценции. Кроме того, мы опишем условия для нарушения циркадных часов в прimary человеческие клетки путем трансфекции миРНК таргетирования часами. Наши результаты на циркадный регуляции секреции инсулина поджелудочной железы человека, и myokine секрецию скелетных мышечных клеток человека, которые представлены здесь, чтобы проиллюстрировать применение этой методологии. Эти параметры могут быть использованы для изучения молекулярной состав периферических часов человека и проанализировать их функциональное воздействие на первичные клетки в физиологических или патофизиологических условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркадная система синхронизации (от латинского "Circa Diem") возникла во всех светочувствительных организмов, как адаптивный механизм с вращением Земли. У млекопитающих, она организована по иерархическому принципу, охватывая центральный синхронизатор, который находится в ядре супрахиазматического вентральной гипоталамусе, и периферической (или ведомый) осцилляторы, которые действуют в различных органах. Кроме того, эти клеточные автономные хозрасчетные осцилляторы функционируют почти в каждой клетке тела 1. Световые сигналы представляют собой доминирующую синхронизирующий кий (Zeitgeber) для нейронов SCN, в то время как нервные и гуморальные сигналы , исходящие от SCN сброса периферийных часов. В ритмах отдых-активность : сложение, что диск в свою очередь кормления натощак циклов, являются дополнительными синхронизаторы для периферийных часов 2. Согласно нашему современному пониманию, молекулярный состав ядра процессора основан на транскрипционный и translaные петли обратной связи, которые являются консервативными между организмами. Это включает транскрипционные активаторы BMAL1 и часы, которые вместе активируют транскрипцию генов отрицательных тактовая PER и крика. Высокие уровни PER и кричи белков будет препятствовать их собственную транскрипцию путем ингибирования / ЧАСЫ комплекса BMAL1. Вспомогательный контур состоит из ядерных рецепторов REV-Erbs и калах, которые также регулируют транскрипцию BMAL1 и ЧАСЫ. Кроме того, посттрансляционные события , включая фосфорилирование, SUMOylation, ацетилирование, O-GlcNAcylation, деградации и ядерной записи частоте ядра белки представляют собой дополнительный слой важную регуляторную при установлении 24 - часовом цикле колебаний 3.

Накопленные данные проистекает из исследований в моделях на грызунах и подчеркивает важнейшую роль циркадного системы в координации метаболических и эндокринных функций 4-5. Ряд LARGэлектронной шкалы анализ транскриптом предполагают , что кормление - голодание циклы играют центральную роль в синхронизации периферических осцилляторов 6-8. В согласии с этими исследованиями, метаболомики и липидомных анализ у грызунов и человека показали , что большое количество метаболитов осциллируют в ткани, плазмы и слюны в циркадных образом 9-11. Важно отметить, что большинство гормонов демонстрируют циркадные ритмы в 5,12-13 крови. Кроме того, циркадные часы из соответствующего гормонпродуцирующих периферических тканей может регулировать секрецию гормонов на местном уровне. Клеточно-автономным циркадные осцилляторы были описаны в грызунах и островковых клеток поджелудочной железы человека 14-16. Эти осцилляторы играют существенную роль в регуляции островков поджелудочной железы транскриптом и функции 15,17-18. Кроме того, myokine секрецию скелетных мышечных трубочек человека было недавно продемонстрировано, демонстрируют циркадный паттерн, который регулируется клеточно-автономным oscillatoRS оперативные в этих клетках 19.

Существует несколько подходов к изучению циркадных ритмов в организме человека в естественных условиях широко используются. Например, плазменный мелатонин или уровень кортизола в крови, а также грудные температура поверхности кожи (обзор в ссылках 3,20) были изучены для оценки эндогенных циркадных часов. Хотя эти методы позволяют изучать системные циркадные колебания в естественных условиях, они далеки от обеспечения надежной оценки обгонной автономных циркадных ритмов в различных органах и тканях. Тем не менее, такое рассечение от системного регулирования станет незаменимым инструментом для понимания специфического действия внутриклеточных молекулярных часов на функции этих клеток. Таким образом, значительные усилия были предприняты для разработки надежных подходов для изучения человеческих часов в иммортализованных или первичных культивированных клеток синхронизированных в пробирке. Важно то, что было показано, чтоЧасы характеристики , измеренные в культивируемых клетках первичных фибробластов кожи точно отражают индивидуальные тактовые свойства всего организма 21. Развитие флуоресцентных и биолюминесценции циркадных репортеров значительно продвинулся вперед этот подход 22-27. Кроме того, изучая первичные часы клеток, которые получают из различных периферических органов позволяет для исследования свойств молекул тканесецифического часы человека 3,5,16,19-20,28. Таким образом, оценка циркадных часов в пробирке в синхронизированных первичных эксплантов или клетки, с помощью биолюминесцентного репортеров, представляет собой весьма полезный метод для изучения молекулярной состав периферических часов человека и их влияние на функции органа.

В этой статье мы представим подробные протоколы для оценки циркадных экспрессии генов в первичных островковых и скелетных мышечных клеток человека синхронизированных в пробирке, а также влияния автономных клеточных часовСрыв на секреторную функцию этих клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Манипуляции , включенные в этот протокол был одобрен Комитетом по этике больницы Женевского университета и по этическим комитетом SUD EST IV (Соглашение 12/111) 19. Человеческие островки выделяли из панкреатических мозга умерших доноров полиорганной в трансплантологии Центра Островок в госпитале Университета Женевы (Швейцария) , как описано нами в ссылках 16,18, или получены из коммерческих источников.

1. Получение первичной клеточной культуры

  1. Человек панкреатическими островками Изоляция, диссоциация и культура
    Примечание: Смазать каждую трубу, пластиковый наконечник или пипеткой с Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) среды с целью предотвращения островки или островковые клетки от прилипания к пластиковой поверхности, что может привести к значительной потере клеточного материала.
    1. За один день до островковых клеток диссоциации добавляют 1 мл ламинина-5-богатых внеклеточного матрикса (на основе 804G клеток как descriКровать в ссылке 29) на 3,5 см чашку. Перед металлизированный клетки, аспирация матрицу и мыть блюдо 3 раза стерильной би-дистиллированной воды. Дайте высохнуть блюдо под шкаф с ламинарным потоком в течение 5 мин.
    2. Внутри шкафа с ламинарным потоком воздуха, распределяют полученные островки с CMRL среды в 15 мл пробирку (ы). Центрифуга при 272 мкг в течение 5 мин.
    3. Аспирируйте супернатант, а затем ресуспендируют осадок в 1 мл фосфатно-буферного солевого раствора стерильного Дульбекко (DPBS), предварительно нагретый до 37 ° С без кальция и магния. Центрифуга при 272 мкг в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ДЗФР.
    5. Для того, чтобы подсчитать общее число островков, пипеткой 10 мкл из островковой суспензии, 1 мл в новый 3,5 см чашку. Подсчитайте число островков в капле 10 мкл под микроскопом и из этого рассчитать общее количество островками в островковой суспензией 1 мл. Добавьте 14 мл ДЗФР и центрифугирование клеточной суспензии еще одинВремя работы при 272 мкг в течение 5 мин.
    6. Для клеточной диссоциации островковых клеток поджелудочной железы, аспирация супернатант и прибавляют 1 мл раствора открепления клеток в течение максимум 1000 островковых эквивалентов (IEQ). Поместите пробирку в водяную баню при температуре 37 ° С и осторожно перемешать островки пипетированием вверх и вниз несколько раз Ежеминутно во время 6-10 мин,
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки качества пищеварения, пипеткой каплю 2 мкл суспензии на предметное стекло и проверить под микроскопом, что все клетки хорошо разделены, и что никакие дублеты или клеточные скопления не осталось.
    7. Остановить реакцию добавлением 14 мл холодной CMRL с добавками (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% пенициллина-стрептомицина (P / S), 1% гентамицина, 1 % пирувата натрия). Центрифуга при 425 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и добавляют 15 мл CMRL среды к осадку клеток.
    8. Ресуспендируют осадок в небольшом объеме CMRL с добавками. Подсчитайте количество клеток под микроскопом с помощью hemocytoметр, регулировать громкость CMRL, чтобы получить концентрацию клеток ~ 650, 000 клеток / мл.
    9. Пипеткой 3 разделенных капель 100 мкл каждого из дисперсной суспензии клеток, полученной на стадии 1.1.8 в 3,5 см чашку, предварительно покрытые ламинин.
      Примечание: Клетки прикрепить к чашке примерно 24 ч.
    10. Инкубируйте клетки (рис 1А) в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С во влажной камере. Изменение носителя ячейки капель через каждые 2-3 дня аспирацией по 100 мкл из каждой капли, и заменить его с тем же объемом свежей среды.
  2. Человек Первичная миобластов Культура и Дифференцировка в мышечных трубках
    1. Тканевой биопсии, выделение сателлитных клеток и миобластов культуры
      Примечание: биопсию мышц были получены из группы Этьена Lefai (INSERM, Лион, Франция) 19.
      1. Очищают первичных скелетных миобластов в соответствии с ранее описанной процедурой 30.
    2. Дифференцируя рrimary человека миобластов в мышечные трубки
      1. Возьмем один флакон (1 х 10 6 клеток) человека миобластов хранили в жидком азоте и быстро оттаивают клетки, поместив флакон в течение 30 сек до 1 мин на водяной бане при 37 ° С при перемешивании.
      2. Клетки Внесите (1 мл) в 24 мл ростовой среды, состоящих из ХАМ F-10 с добавлением 20% FBS, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицином В.
      3. Центрифуга 5 мин при 150 х г.
      4. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток с 15 мл свежей среды для роста на 2,5 × 10 5 клеток.
      5. Пластина по меньшей мере , 2,5 × 10 5 клеток на F75 клейкого колбу. Держите миобластов в клетке инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
      6. После того как клетки достигают 60-80% слитности, диссоциируют клеток с помощью трипсина-EDTA 0,05% в течение 1-2 мин и пластины их в 2 мл среды для выращивания на прилипшие блюда 3,5 см Петри.
      7. После достижения слияния, удаления среды роста.
      8. Начало дифференцировки протоCol человеческих миобластов Into мышечные трубки культивированием их в 2 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 1 г / л глюкозы, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицин В (дифференцировка среда) в инкубаторе клеток при 37 ° с и 5% CO 2. Изменение среды каждые 2 до 3 дней.
        Примечание: мышечные трубки, как правило, формируются в течение 7-10 дней.
      9. Проверка дифференцировки клеток мышц под микроскопом (рис 2А), наблюдая слияние миобластов в многоядерный мышечных трубочек 19.

2. малых интерферирующих РНК (миРНК) Трансфекция

  1. миРНК Трансфекция человеческих островковых клеток
    Примечание: Протокол трансфекцию осуществляют в каплях 100 мкл на следующий день после диссоциации клеток (этапы 1.1.1-1.1.10).
    1. Отберите 100 мкл CMRL среды из каждой капли, и заменить его таким же объемом не содержащей сыворотки минимальной необходимой среде (MEM), 2 чдо трансфекции пипеткой.
    2. Подготовить MEM смесь на основе реагента трансфекции и 50 нМ миРНК - мишени (SICLOCK) или 50 нМ ненацеливании siControl в соответствии с инструкциями изготовителя.
      1. Для одного блюда с 3 капли готовят две 1,5 мл пробирки с 200 мкл MEM каждого.
      2. Добавить в одной из этих трубок 4 мкл реагента для трансфекции.
      3. Добавьте ко второй трубке 1 мкл соответствующего миРНК исходного раствора (20 мкМ).
      4. Перемешайте эти две трубки медленно на орбитальном шейкере в течение 5 мин, а затем смешать содержимое пробирок вместе и перемешивают еще в течение 20 мин.
    3. Вытяжку 100 мкл MEM из каждой капли и заменить его таким же объемом смеси, полученной трансфекции в предыдущем шаге пипеткой.
    4. Заменить трансфекционного раствора CMRL среды после 4 ч инкубации при 37 ° С. Повторите шаги 2.1.1-2.1.3 на следующий день для клеток повторной трансфекции.
  2. миРНК Трансфекция человека мышечных трубочек
    1. Перед трансфекцией замените носитель (этап 1.2.2.8) с 2 мл свежей среды для дифференцировки на 3,5 см блюдо Петри.
    2. В стерильном 1,5 мл пробирку, приготовить смесь из 20 нМ миРНК (siControl или SICLOCK), что соответствует 2,4 мкл раствора 20 мкМ миРНК, а также 12 мкл реагента для трансфекции разведенных в 100 мкл среды для дифференцировки. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 15 мин при осторожном перемешивании.
    3. Трансфекцию клетки с 114,4 мкл смеси миРНК на 3,5 см чашку Петри и место клеток в инкубаторе для тканевых культур при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 ч.

3. Непрерывный Долгосрочный циркадного Биолюминесценция Запись выполняется параллельно с оценкой Гормон Секреция в живых человеческих первичных клеток

  1. Представляя циркадных биолюминесценции Репортеры в человека Первичные клетки путемлентивирусов Трансдукция
    Примечание: Все процедуры с использованием лентивирусов частиц должны быть выполнены в биологической безопасности 2-го уровня объекта принять дополнительные меры предосторожности при работе с агентами, представляющими умеренную потенциальную опасность для персонала и окружающей среды.
    1. Подготовить частицы репортер лентивирусов путем совместного трансфекцию вектора интереса pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / BMAL1-Luc или pLV156-Per2-dLuc ( так называемый BMAL1-Luc и Per2-Luc, соответственно) плазмиду 31 с лентивирусов векторов pMD2G и psPAX в клетки 293Т с использованием метода полиэтиленимина (для детальной процедуры см ссылку 16).
    2. Titrate полученные лентивирусов частиц (подробнее о титрования можно получить в http://lentilab.unige.ch/). Для дальнейших экспериментов, использовать лентивирусов с титрами в диапазоне 10 4 до 10 5 преобразующих единиц [ТУ / мкл].
    3. Место блюда с клетками человека островковых или человека миобластов (на 30-50% сплошности) внутри кабины ламинарного потокаЕТ и замените носитель с 2 мл свежей среды, дополненной CMRL (этап 1.1.7) или ростовую среду (этап 1.2.2.2), соответственно.
    4. Вычислить множественности заражения (MOI) (т.е. инфекционные частицы (преобразовательного единиц) / количество ячеек).
    5. Трансдукции первичной культуры клеток с помощью пипетки лентивирус раствора на блюдо , с тем , чтобы получить MOI = 3 (например, для 65000 прикрепленные клетки добавляют 3 мкл раствора вируса с титром 6,5 х 10 4 до 100 мкл среды капли).
    6. Выдержите в течение ночи в инкубаторе тканевых культур. Изменение среднего на следующий день.
      Примечание: трансдукции островковых клеток человека, по крайней мере за 4 дня до записи биолюминесценции для достижения достаточной экспрессии репортерной конструкции. Миобластов трансдуцируют во время фазы расширения, а затем выращивали до слияния, а затем дифференцировались в мышечные трубки.
  2. Экстракорпоральное Синхронизация человека первичных клеток
    1. Добавьте 10 мкМ аденилатциклазы активатора в 2 мл среды на 3,5 см чашку Петри, содержащую первичные клетки предварительно трансдуцированных на этапе 3.1.5.
    2. Инкубировать в течение 60 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
    3. Изменение среды, содержащей циклазным активатор аденилин с 2,5 мл носителя записи, содержащего 100 мкМ люциферин.
      Примечание: В случае клеток островков Лангерганса человека используют CMRL с добавлением 10% FBS, 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 1% гентамицина; для человека мышечные трубки используют фенол красный - свободный DMEM с 1 г / л глюкозы, дополненной 2% FBS, 2% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицина В.

4. Параллельный оценка циркадного биолюминесценции записи и гормональная секреция Профили в синхронном человеческого Секреторное Первичные клетки

  1. Настройка Долгосрочно константы Perifusion и биолюминесценции записи для первичных клеток человека.
    Примечание: При работе выходовIde шкаф ламинарный поток, очистите все контактные поверхности и ограничить воздействие культур или среды с воздухом, чтобы избежать загрязнения.
    1. Для приготовления perifusion среды, добавляют 100 мкМ люциферин к среде.
      Примечание: В случае клеток островков Лангерганса человека используют CMRL с добавлением 10% FBS, 1% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 1% гентамицина; для человека мышечные трубки используют фенол красный - свободный DMEM с 1 г / л глюкозы, дополненной 2% FBS, 2% L-аланил-L-глутамин-дипептид, 1% P / S, 0,5% гентамицина и 0,2% амфотерицина В.
    2. Внутри шкафа с ламинарным потоком воздуха, откройте 3,5 см чашках, содержащих трансдуцированных, трансфицированные и синхронизированные первичных клеточных культур (островковых клеток или мышечных трубках), как описано выше. Вставьте стерильные металлические колпачки (разработанные в доме) (рис 1B2) в см чашки 3,5, которые снабжены силиконовым наплыв / эффлюксных соединительные трубки (рис 1B1 / B5).
    3. Поместите посуду на измерительной платформе в 37 ° C лIGHT непроницаемого инкубатор. Закрепить блюда на платформу с помощью привинчивающаяся адаптера (рисунок 1B3). Вставьте наплывом / эффлюксных трубы системы perifusion в соответствующие силиконовые трубки колпачка (рис 1B1 / B5) и установить скорость насоса при скорости потока ~ 0,5 мл среды на 1 час.
    4. Откройте в доме разработанный Капельное-biolumicorder программное обеспечение, которое записывает сигналы от ФЭУ (ФЭУ) детектора. Выберите каталог, в котором будут храниться данные и начать непрерывную запись биолюминесценции от каждого блюда, нажав на значок "Пуск".
      Примечание: В качестве альтернативы к программному обеспечению Капельное-biolumicorder, другие программы (например , LumiCycle), могут быть использованы для записи сигналов от детектора ФЭУ.
    5. Поместите стерильные 6-луночные планшеты для тканевых культур в травосборник на льду.
    6. Откройте программу управления, которая управляет временем автоматического переключения между скважинами сбора. Настройка времени шindow средней коллекции (сек). Начать сбор оттока среды каждые 4 ч (14,400 сек; ~ 2 мл на временной точке), нажав на значок "Выполнить".
    7. Передача и измерить отток среды из каждой коллекции и в стерильные 2 мл пробирки с помощью пипетки. Хранить пробирки в -20 ° C морозильнике перед началом следующего шага. Повторите шаги 4.1.5-4.1.6 каждые 24 часа в сутки.
    8. Остановить запись биолюминесценции и потока среды, нажав на значок "стоп" на соответствующее программное обеспечение. Удалите металлические колпачки и аспирация остаточной среды из блюд.
    9. Для того , чтобы нормализовать секретируемые значения белка , полученные в различных экспериментах, либо извлечь ДНК (нормализацию геномной содержания ДНК для мышечных трубках 19), или добавить 1 мл буфера для лизиса кислотно-этанол (нормализация суммарным содержанием гормонов для островковых клеток 18) к блюда.

5. Измерение Островок Гормональные и Myokine Уровни в оттокеСредняя получены при непрерывной Perifusion из человеческого первичного эндокринных клеток

  1. инсулином
    1. Количественно базальный уровень инсулина в оттоке среды из собранных временных точках с помощью инсулина иммуноферментного анализа (ИФА) набор человека в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Нормализация данных по абсолютному объему собранной среды в каждую лунку , и к общему содержанию инсулина, извлеченного из кислотно-этанольных обработанных клеток в конце эксперимента (этап 4.1.9) 18.
  2. Интерлейкин-6 (ИЛ-6)
    1. Количественная базальная IL-6 уровней в оттоке среды из собранных временных точках с помощью человеческого IL-6 ELISA комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Нормализация данных по абсолютному объему собранной среды в каждую лунку, и к геномного содержание ДНК в конце эксперимента (этап 4.1.9).

6. Суточный датасетов Анализы для Bioluminesценция и гормональная секреция Профили

  1. Биолюминесценция Анализ
    1. Анализ профиля биолюминесценции с помощью прилагаемого программного обеспечения 19.
  2. Анализ JTK цикла
    1. Анализ профилей секреции гормонов и записи результатов биолюминесценции с помощью алгоритма 32 JTK_CYCLE.
    2. Установите ширину циркадного периода в 20-24 ч.
      Примечание: В случае, если условия эксперимента были записаны параллельно, сопряженное статистический анализ может быть проведен для сравнения экспериментов.
  3. Анализ CosinorJ
    1. В качестве альтернативы, анализировать секрецию гормона и циркадные профили биолюминесценции с помощью программного обеспечения CosinorJ 28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка Островок Гормон Секреция с параллельными циркадного биолюминесценции Запись с Perifused Человека островковых клеток

После предоставления первую молекулярную характеристику циркадных часов, действуют в клетках 16 островковых человека, мы направлены на изучение влияния часов на нарушения функции островковых клеток и транскрипции 18. Мы создали эффективный протокол SICLOCK трансфекции в диспе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные установки , описанные здесь , состоят из лентивирусов доставки циркадных репортеров биолюминесценции в культивируемых первичных клеток человека, с последующей синхронизацией в пробирке и непрерывной записи биолюминесценции в течение нескольких дней, и параллельный анализ секреции гормонов одними и теми же клетками. Они представляют собой эффективный подход для изучения молекулярных механизмов и функциональных аспектов циркадных часов в первичных клетках человека.

К...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны нашим коллегам из Университета Женевы: Жак Филипп за конструктивные замечания по этой работе, Ули Schibler за неоценимую помощь в развитии системы perifusion и для научного вдохновения, Андре Liani для задумав проектирование, изготовление и ввод в эксплуатацию система перфузия, компания Леза-Technology LTD за помощь в системе perifusion и разработки программного обеспечения Капельное-biolumicorder, Джордж Severi за помощь при проведении экспериментов perifusion, Урсула Loizides-Мангольд для критически чтении рукописи, и Анн-Мари Маклуф для лентивирус препаратов ; Этьену Lefai, Stéphanie Chanon и Hubert Видал (INSERM, Лион) для подготовки первичных миобластов человека; и Доменико Боско и Тьерри Berney (Островок центра трансплантации человека, Женева Больница университета) для обеспечения человека островки. Эта работа была профинансирована N: Швейцарский национальный научный фонд Грант 31003A_146475 / 1, Sinergia Швейцарский национальный научный фонд грант № CRSII3-154405, Fondation Romande пур ля Recherche сюр Diabète, Бо Hjelt Foundation, Fondation Ernst Et Lucie Шмидхайни и Société Académique De Geneve (CD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трипсин-ЭДТАИнвитроген25300-054Для биопсии мышц пищеварение
DPBS без кальция без магнияInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Для культуры миобластов
FBSInvitrogen10270Добавка к питательной среде
Пенициллин-стрептомицинSigmaP0781-100Добавка к питательной среде
ГентамицинАксон A1492.0001Добавка к питательной среде
ФунгизонаИнвитроген15290-026Амфотерицин В, добавка к питательной среде
DMEM 1г/л глюкозы + Na пируват + глутамакс Invitrogen21885-025Для культуры миотрубок
DMEM 1г/л глюкозы -Na Пируват - глутамаксInvitrogen11880-028Записывающий носитель для LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-аланил-L-глутамин дипептид, добавка к записывающему средству
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Раствор для отсоединения клеток, для диссоциации островковых клеток
CMRLGibco21530-027Питательная среда для островковых клеток
Пируват натрияGibco11360-039Добавка к питательной среде
15 мл Высокопросветная полипропиленовая коническая трубкаFalcon352096
F75 колбаBD Falcon353136
3,5 см чашка Петри BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Активатор аденилатциклазы, используемый для синхронизации
LuciferinProlume LTD260150Дополнение к носителю записи
OptiMEM Invitrogen51985-026Сыворотка Minimal Essential Medium (MEM) для трансфекции островковых клеток человека
Липофектамин RNAiMAX реагентInvitrogen13778-150Реагент для трансфекции
HiPerFect РеагентQiagen301705Реагент для трансфекции
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus нецелевая миРНК #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Набор для салфеток Qiagen69504Для экстракции ДНК из миотрубок
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104для экстракции РНК миотрубок
QIAshredder Qiagen79654Для миотрубок для экстракции РНК
2 мл сборные пробиркиAxygen311-10-051Для сбора среды с перифузионной
культурой Тканевая культуральная пластина, 6 лунокBD Falcon 353046Для сбора среды с помощью перифузионного
набора RNeasy Plus Micro Qiagen74034Для выделения островковой РНК
Человеческий IL-6 Набор для мгновенного ИФА eBioscience88-7066-22
Набор инсулина для человека MercodiaMercodia10-1113-01
Кислота соляная, мин.37%,годовыхAcros organics124630010Используется для приготовления буфера для лизиса (375 мл Этанол + 7,5% HCl + 117,5% H2O)
Этанол (>99,8%)Fluka Analytical02860-1LИспользуется для приготовления буфера для лизиса (375 мл Этанол + 7,5% HCl + 117,5% H2O)
Островки человека для исследованийProdo Laboratories
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
>Оборудование:
ЦентрифугаHeraeusMegafuge 1.0R
Водяная баняVWR1112A  на 37 ° C
Tissu культурный капюшонFaster Культуральный инкубатор SafeFastElite
TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 при 37 ° C, отсутствие воды благодаря установке LumiCycle
инкубатора для культуры TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 при 37° C, отсутствие воды благодаря установке LumiCycle
культуры TissuThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 при 37° C
ШейкерHeidolph InstrumentsUnimax 1010Для перемешивания смеси миРНК
LumiCycleActimetrics
Программное обеспечение LumiCycleActimetrics
CosinorJ программное обеспечениеEPFLСвободно доступно по адресу: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX Управляющее программное обеспечение ERC GmbHуправляющее синхронизацией автоматического переключения
в инкубаторе ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи