Loop Arteriovenous (AV) в модели мелких животных для изучения ангиогенеза и васкуляризированных тканевой инженерии

Annika Weigand; Justus P. Beier; Andreas Arkudas; Majida Al-Abboodi; Elias Polykandriotis; Raymund E. Horch; Anja M. Boos

doi:10.3791/54676

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Loop Arteriovenous (AV) в модели мелких животных для изучения ангиогенеза и васкуляризированных тканевой инженерии

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54676

⸱

2 ноября 2016 г.

Annika Weigand¹ , Justus P. Beier¹ , Andreas Arkudas¹ , Majida Al-Abboodi¹^,² , Elias Polykandriotis³ , Raymund E. Horch¹ , Anja M. Boos¹

¹Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), ²Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, ³Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем микрохирургической подход к генерации артериовенозные (AV) петли в качестве модели для анализа васкуляризации в естественных условиях в изолированном и хорошо охарактеризованного окружающей среды. Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но и оптимально подходит для инженерных и аксиально васкуляризированных перевивных тканей.

Аннотация

Функциональная сеть кровеносных сосудов является предпосылкой для выживания и роста почти всех тканей и органов в человеческом теле. Более того, в таких патологических ситуациях, как рак, васкуляризация играет ведущую роль в прогрессировании заболевания. Следовательно, существует острая потребность в стандартизированной и хорошо охарактеризованной модели in vivo для выяснения механизмов неоваскуляризации и разработки различных подходов к васкуляризации для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Мы описываем микрохирургический подход для модели маленького животного для индукции сосудистой оси, состоящей из вены и артерии, которые анастомозированы артериовенозной (AV) петлей. AV-петля переносится в закрытую камеру для имплантации для создания изолированной микросреды in vivo, которая соединяется с живым организмом только посредством сосудистой оси. С помощью 3D-визуализации (МРТ, микро-КТ) и иммуногистологии можно визуализировать растущую сосудистую сеть с течением времени. Путем имплантации различных клеток, факторов роста и матриц их роль в формировании сети кровеносных сосудов может быть проанализирована без каких-либо возмущающих воздействий со стороны окружающей среды в хорошо контролируемой среде.

В дополнение к исследованиям ангиогенеза и антиангиогенеза, модель AV-петли также идеально подходит для инженерии васкуляризированных тканей. После определенного времени преваскуляризации сгенерированные ткани могут быть пересажены в место дефекта и микрохирургически соединены с местными сосудами, тем самым обеспечивая немедленное кровоснабжение и интеграцию сконструированной ткани. Варьируя матрицы, клетки, факторы роста и архитектуру камеры, можно создавать различные ткани, которые затем могут быть адаптированы к индивидуальным потребностям пациента.

Введение

Большинство тканей и органов в организме человека зависят от функциональной сети сосудов крови, которая поставляет питательные вещества, газы и обменивает удаляет продукты жизнедеятельности. Неисправность этой системы, вызванной местными или системными проблемами сосудов может привести к множеству серьезных заболеваний. Кроме того, в научных областях, таких как тканевой инженерии или восстановительной медицины, функциональная сеть кровеносных сосудов в искусственно созданных тканей или пересаженных органов является необходимым условием для успешного клинического применения.

В течение десятилетий исследователи исследовали точные механизмы, участвующие в растущей сосудистую сеть, чтобы получить более глубокое понимание патологических ситуаций, с тем чтобы найти новые терапевтические вмешательства и обеспечить более профилактики сосудистых расстройств. На первом этапе, основные процессы , такие как межклеточных взаимодействий или влияния молекул на клетках сосудистой системы, как правило , исследовали с помощью экстракорпорального 2D или 3Dэксперименты. Традиционные 2D модели легко выполнить, хорошо известны и в значительной степени способствовали лучшему пониманию этих процессов. Впервые в 1980 году, Фолкман и др. сообщили в пробирке ангиогенеза высева клеток эндотелия капилляров на желатине планшетах , покрытых ^1. Это сразу же уступила публикации множества дальнейших экспериментов 2D ангиогенеза на клеточной трубки эндотелиальной формирования анализа ^2, ³ анализа миграции и совместного культивирования различных типов клеток ^4, а также другие. Эти анализы все еще используются сегодня и принят в качестве стандарта в пробирке методами.

Тем не менее, эта экспериментальная установка не всегда подходит для изучения поведения клеток в естественных условиях , так как большинство типов клеток требуют 3D - среде , чтобы сформировать соответствующие физиологические структуры ткани ^5. Можно показать, что архитектура 3D-матрицы имеет решающее значение для капиллярного morphogenesiS ⁶ и что клеточно-внеклеточного матрикса (ECM) взаимодействия и 3D культуры условия регулируют важные факторы , связанные с опухолевого ангиогенеза ^7. 3D матрица обеспечивает сложные механические входы, могут связывать эффекторные белки и устанавливают ткани масштабные градиенты концентрации растворенного вещества. Кроме того, считается необходимым для того , чтобы имитировать в естественных условиях морфогенетических и ремоделирования шагов в сложных тканей ^5. В этих системах, как ангиогенез и образование и развитие сосудов могут быть изучены. В то время как ангиогенез описывает прорастание капилляров из уже существующих кровеносных сосудов ^8, образование и развитие сосудов относится к образованию де Novo кровеносных сосудов через эндотелиальных клеток или их предшественников ^9,10. Созревание судов описывается в процессе , называемом 'артериогенеза' с помощью набора гладких мышечных клеток ^11. Типичным развитие кровеносных сосудов в пробирке модель является разрастание эндотелиальных клеток из существующих монослояс затравку в виде монослоя на поверхности геля, на поверхности микросфер , внедренных в геле или путем создания эндотелиальные сфероиды ¹² клеток. В моделях васкулогенных одиночные эндотелиальные клетки захватываются в 3D-гель. Они взаимодействуют с соседними эндотелиальными клетками с образованием структур и сетей De Novo сосудов, как правило , в сочетании с поддерживающими клетками ^12.

Тем не менее, даже комплекс 3D в моделях пробирке не могут имитировать в условиях естественных условиях полностью учитывая множество межклеточных и клеточно-ECM взаимодействиях ^13. Вещества , обладающие высокой активностью в пробирке автоматически не показывают те же эффекты в естественных условиях и наоборот ^14. Для всестороннего анализа процессов васкуляризации существует острая необходимость в разработке в естественных условиях модели , которые лучше имитируют ситуацию в организме. Большой диапазон в естественных условиях ангиогенеза анализы описаны в литературе, в том числехорионалантоисной анализ мембраны (САМ), то модель данио, роговичный ангиогенез анализа, спинной модель воздушный мешок, спинной складка камеры, подкожные модели опухоли ^14. Тем не менее, эти анализы часто связаны с ограничениями, такими как быстрые морфологические изменения, проблемы в различении новых капилляров из уже существующих в анализе САМ, или ограниченное пространство в роговице ангиогенеза анализе ^15. Кроме того, системы немлекопитающего используются (например., То данио модель ^16), что приводит к проблемам в ксенотрансплантации ^17. В модели подкожной опухоли, ангиогенез, происходящих только из самой опухоли не могут быть проанализированы, так как прилежащие ткани в значительной степени способствует процессу васкуляризации. Кроме того, окружающие ткани могут иметь решающую роль в формировании микросреды ¹⁸ опухолей.

Не только для изучения ангиогенеза или васкулогенеза есть сильный пее изд для стандартизированной и хорошо охарактеризованный в естественных условиях модели , но и для изучения различных стратегий васкуляризации в тканевой инженерии и регенеративной медицины. На сегодняшний день создание сложных искусственных органов или тканей возможно как в пробирке и в естественных условиях. 3D-Биопринтинг обеспечивает технологию изготовления по требованию для создания сложных 3D - ткани функциональной жизни ^19. Кроме того, биореакторы могут быть использованы для создания тканей ²⁰ или даже собственное тело может быть использован в качестве биореактора ^21. Тем не менее, основным препятствием для успешного применения искусственно созданных тканей является отсутствие васкуляризации в инженерно-технических конструкций. Немедленное соединение с сосудистой сетью хозяина после трансплантации является важной предпосылкой для выживания, особенно в случае крупных искусственных тканей или органов.

Различные в пробирке или в естественных условиях стратегий prevascularization были развиOped установить функциональную микроциркуляторного русла в конструкциях до имплантации ^22. Имплантация помост с ин витро предварительно сформированных сконструированных капилляров на коже спины мышей приводило к быстрому анастомоза мышей сосудистую систему в течение ²³ -й день. В противоположность этому , сфероид совместно культуры , состоящей из человеческих мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток пупочной вены человека , собранных в трехмерную сеть prevascular дальнейшее развитие после имплантации в естественных условиях. Тем не менее, анастомоз с принимающей сосудистую сеть была ограничена ^24. Прежде всего, в плохо васкуляризированных дефектов, таких как некротических или облученные областях, это так называемая внешняя васкуляризация - врастание сосудов из окрестностей в эшафоте - часто выходит из строя. Характеристическая васкуляризации, с другой стороны, основано на сосудистом оси в качестве источника новых капилляров прорастающих в строительные леса ^25. Используя васкуляризации подход осевой, Инженерией ткани можно пересаживать с его осью сосудистых и соединен с местным судам на месте получателя. Сразу же после трансплантации, ткань адекватно поддерживается кислородом и питательными веществами, что создает благоприятные условия для оптимальной интеграции.

Из - за ограниченной доступности моделей для исследования ангиогенеза в естественных условиях и в знак признания растущей важности создания осевого васкуляризированных ткани, мы разработали микрохирургической подход Эрол и Спира далее для создания артериовенозного (AV) цикл в животной модели ^26. Использование полностью закрытой имплантации камеры делает этот метод очень хорошо подходит для изучения формирования кровеносных сосудов под "контролируемой", хорошо охарактеризованы в условиях естественных условиях (рисунок 1). Эта модель не только полезно для исследования ангиогенеза, но также оптимально подходит для осевого васкуляризации каркасы для Engin тканиЦели eering.